Ústav patologické fyziologie, LF MU Ing. Hana Holcová Polanská, Ph.D. Epigenetika Pokud jsou všechny buňky vytvořeny ze stejného genetického materiálu, proč existuje tolik různých typů buněk? Epigenetika • Epigenetika je studium potenciálně dědičných změn v genové expresi, které nezahrnují změny základní sekvence nukleotidů v DNA, jde tedy o změnu fenotypu beze změny genotypu. • Epigenomika – studium kompletní sady epigenetických změn. • Epigenetický kód – soubor epigenetických vzorců, které udržují různé fenotypy v různých buňkách. Epigenetické mechanismy a) Modifikace DNA b) Modifikace chromatinu c) Nekódující RNA d) Modifikace RNA Modifikace DNA • DNA může být modifikována na cytosinových a adeninových zbytcích přidáním chemických skupin. • Cytosiny mohou být modifikovány methylací, hydroxymethylací, formylací a karboxylací, zatímco adeniny mohou být methylovány. • U lidí je nejčastější formou modifikace DNA methylace cytosinu v místech výskytu CpG (cytosin následovaný v sekvenci DNA guaninovou bází). Methylaci lze nalézt také u cytosinů následovaných adeninem, cytosinem nebo thyminem, taková forma methylace je častá v nervových tkáních a kumuluje se během vývoje. Methylace DNA • Methylace je zavedení methylové skupiny -CH3 do molekuly DNA. Methylace může změnit aktivitu segmentu DNA beze změny jeho sekvence. • U lidí je nejčastější formou modifikace DNA methylace cytosinu vedoucí ke vzniku 5-methylcytosinu (5-mC). • Přidávání methylových skupin je v buňkách řízeno na několika různých úrovních a je prováděno rodinou enzymů nazývaných DNA-methyltransferázy (DNMT). Methylace DNA • DNMT1 je zodpovědná za zachování zavedených vzorců DNA methylace po replikaci DNA a dělení buněk. • Každý typ tkáně a buňky má jedinečný profil methylace DNA. • Methylační vzorce DNA se mění během ontogeneze. • Během gametogeneze a v časné embryogenezi jsou téměř všechny rodičovské methylační vzorce vymazány. Dynamika methylace DNA během embryonálního vývoje myši. E3.5-E6, atd., dny po oplodnění. PGC: primordiální zárodečné buňky. Následky methylace DNA • Transkripce většiny genů kódujících proteiny je iniciována na promotorech bohatých na CpG sekvence. Tyto úseky DNA bohaté na CpG jsou známé jako CpG ostrovy. • Když je CpG ostrov v promotorové oblasti genu methylován, exprese genu je potlačena. Promotory genů, které bývají hojně exprimovány, zpravidla 5-mC neobsahují. • Methylace DNA může fyzicky bránit vazbě transkripčních faktorů. Následky methylace DNA • Methylovaná DNA může být vázána proteiny známými jako proteiny vázající methyl-CpG (MBD; methyl-CpG-binding domain proteins). MBD proteiny mohou vázat další proteiny, které mohou modifikovat histony a remodelovat chromatin. • Represe transpozonů. • Vysoká methylace CpG zvyšuje frekvenci spontánních mutací (methylované zbytky C se mohou spontánně deaminovat na zbytky T). Modifikace Chromatinu • Chromatin je komplex DNA a bílkovin zabalený do jádra savčích buněk. DNA je sbalena kolem jaderných proteinů nazývaných histony. • DNA-histonový komplex, který se skládá ze 146 párů bází dvouvláknové DNA zabalené kolem osmi histonů, se nazývá nukleozom. • Čím více je chromatin kondenzovaný, tím těžší je přístup pro transkripční faktory a další DNA vázající proteiny. • Pokud je chromatin těsně zabalen a není aktivně přepisován, nazývá se heterochromatin. • Když je chromatin rozvolněn, a tudíž dostupný pro transkripci, nazývá se euchromatin. Chromatin • Chromatinová struktura není rigidní a může být modifikována proteinovými komplexy, které specifikují umístění, složení a stav nukleozomů, což nakonec reguluje přístup k dané DNA sekvenci. • Kanonické histony (H3, H4, H2A, H2B a spojovací histon H1) jsou obsaženy v nově replikovaném genomu. • Později mohou být nahrazeny nekanonickými histonovými variantami, které mění strukturu, stabilitu a dynamiku nukleozomů a tím i dostupnost DNA pro transkripci. Modifikace histonů • Posttranslační modifikace histonů mění funkci chromatinu a dostupnost DNA. • N-konce histonů (histonové ocásky) jsou modifikovány nejvíce. • Modifikace histonů zahrnují acetylace, methylace, ubiquitylace, fosforylace, sumoylace, ribosylace a citrullinace. Nejstudovanější jsou acetylace. Modifikace histonů • Enzymy podílející se na acetylaci histonů se nazývají histonacetyltransferázy (HAT). HAT přidávají acetylovou skupinu k lysinům v histonovém ocásku, což maskuje jejich pozitivní náboj, dochází k uvolnění elektrostatické interakci mezi DNA a histony, což způsobuje dekondenzaci chromatinu a umožňuje genovou transkripci. • Histondeacetylázy (HDAC) naopak katalyzují hydrolytické odstranění těchto acetylových značek. • Enzymatický komplex obsahující HDAC se váže k methylované DNA skrze proteiny MeCP1 (methylCpG binding protein 1) a MeCP2. Metylace DNA a modifikace histonů jsou tedy vzájemně závislými procesy. Modifikace histonů • Methylace lysinu 9 histonu H3 je spojována s konstitutivně transkripčně tichým chromatinem (konstitutivní heterochromatin). • Fosforylace (přidání fosfátové skupiny z ATP) je možná na serinových zbytcích v histonových ocáscích. Modifikace RNA • Epigenetické modifikace se vyskytují také v RNA (epitranskriptom). • Modifikace RNA představují další vrstvu epigenetické regulace genové exprese analogickou s methylací DNA a modifikací histonů. • mRNA, tRNA, rRNA a nekódující RNA obsahují tisíce post-transcripčních chemických modifikací. • N⁶-methyladenosin (m6A) je nejčastější modifikací • m6A je rozpoznáván rodinami proteinů vázajících RNA, které ovlivňují mnoho aspektů funkce mRNA. Nekódující RNA • RNA interference je biologický proces, při kterém molekuly RNA inhibují genovou expresi nebo translaci neutralizací cílových molekul mRNA. miRNA • MicroRNA (miRNA) jsou krátké (asi 22 nukleotidů), jednovláknové, nekódující RNA, které regulují mRNA pomocí jejich degradace nebo inhibicí jejich translace na proteiny. • Každá miRNA může cílit přibližně na 100 až 200 různých mRNA. Mnoho miRNA je epigeneticky regulováno. • Asi 50% genů kódujících miRNA se nachází v oblastech CpG ostrovů, které mohou být methylovány a umlčeny. lncRNA • Dlouhé nekódující RNA (lncRNA) jsou velkou rodinou RNA (přibližně 50 000 v lidském genomu), jejichž délka přesahuje 200 párů bází. lncRNA jsou hojné v nervových tkáních. • lncRNA regulují transkripci a ovlivňují aktivitu miRNA. • lncRNA jsou schopné hybridizovat s pre-mRNA a blokovat tak některá jejich sestřihová místa, může dojít k alternativnímu sestřihu. Inaktivace chromozomu X • V ženských somatických buňkách je jeden ze dvou chromozomů X inaktivován, aby se vyrovnala dávka genových produktů vázaných na pohlaví mezi ženskými a mužskými buňkami. • Cílem inaktivace je, aby byl v každé buňce aktivní pouze jeden chromozom X. • Pravděpodobně nejznámějším reprezentantem lncRNA je XIST (X Inactivation Specific Transcript), který se uplatňuje v procesu inaktivace chromozomu X. • Imprintované geny jsou transkribovány pouze z jedné alely, a to z alely určitého rodičovského původu. Některé lokusy jsou exprimovány pouze paternálně, to se označuje jako maternální imprinting, tj. maternální umlčení. Jiné lokusy jsou exprimovány výhradně maternálně, což značí paternální imprinting. Druhá alela genu je neaktivní, tj. imprintovaná. • Odhaduje se, že tento jev ovlivňuje několik stovek lidských genů. • V případě imprintovaných alel neplatí identita reciprokých křížení, kterou zjistil Gregor Mendel, protože paternální a maternální informace nejsou ekvivalentní. Imprinting • Genomický imprinting se vytváří během gametogeneze, přechází na zygotu prostřednictvím oplodnění, udržuje se po celý vývoj a dospělý život, ale v primordiálních zárodečných buňkách je vymazán. • Nejznámějším případem vlivu imprintingu jsou Angelmanův a Prader-Williho syndrome • Oba jsou způsobeny stejnou genetickou mutací (částečná delece chromozomu 15q). Konkrétní syndrom, který se vyvine, závisí na tom, zda je mutace zděděna od matky nebo otce. • Delece na chromozomu matky souvisí s Angelmanovým syndromem a ztráta příspěvku otce souvisí s PWS. Imprinting Epigenetika a choroby • Mnoho environmentálních expozic může vyvolat změny v epigenomu, které mění vzorce genové exprese, aniž by přímo měnily základní sekvenci DNA. Tyto změny mohou být spouštěčem chorob. • Ukázalo se, že kombinace epigenetických znaků předurčuje jednotlivce k určitým chorobným stavům, jako je cukrovka, nádory, kardiovaskulární onemocnění a obezita. • Například prostředí, kterému jste byli vystaveni v děloze (špatná strava, kouření, vysoká úroveň stresu, znečištění atd.), přímo ovlivňuje váš výsledný epigenom. • Epigenetické modifikace působí jako mediátoři nebo rizikové faktory a poukazují na vzájemně propojený vztah mezi prostředím a nemocí. Nádorová onemocnění • U různých typů nádorů může být narušena celá řada různých epigenetických mechanismů. • U sporadických nádorů jsou velmi časté epigenetické změny genů pro opravu DNA nebo genů pro kontrolu buněčného cyklu • Epigenetické změny jsou důležité při maligní transformaci a jejich manipulace je velkým příslibem pro prevenci, detekci a terapii nádorů. Example: Histone modification profiles Normal vs Cancer Psychologie a psychiatrie • DNA-metyltransferáza 1 (DNMT1) je nadměrně exprimována v GABAnergních interneuronech v mozcích schizofreniků. • U schizofrenie a bipolární poruchy byla prokázána hypermetylace potlačující expresi Reelinu (protein požadovaný pro normální neurotransmisi, tvorbu paměti a synaptickou plasticitu) v mozkové tkáni. • Aberantní metylace byla též detekována jako faktor podílející se na vzniku Alzheimerovy choroby. • Martinův-Bellové syndrom (syndrom fragilního chromozomu X) je známou X-vázanou mentální retardací. Jde o poruchu proteinu FMR1, který je zásadní pro správné fungování mozku. V promotorové oblasti genu FMR1 se nachází opakující se sekvence tripletu CGG (20 až 50 opakování). Pokud je počet opakování tripletu neúměrně navýšen (amplifikace tripletu), může dojít k inaktivaci genu FMR1 v důsledku metylace amplifikovaných CpG sekvencí. Děkuji za pozornost Ústav patologické fyziologie, LF MU Mgr. Martina Raudenská, Ph.D. / Ing. Hana Holcová Polanská, Ph.D.