Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU1
Molekulárně biologická analýza orálních
patogenů a slin, zubní kaz
Mgr. Jana Mrázková, Ph.D.
Ústav patologické fyziologie LF MU
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU2
Témata
̶ Faktory podílející se na vzniku zubního kazu
̶ Molekulární analýza sliny
̶ Molekulární analýza orálního mikrobiomu
̶ Genetika zubního kazu
̶ Genetické asociační studie ve vztahu k zubnímu kazu
3
Zubní kaz
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU
Dental Health Services Victoria
(www.betterhealth.vic.gov.au)
a faktory přispívající
k jeho vzniku
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU4
Zubní kaz
̶ nejrozšířenější chronické onemocnění
̶ 3,5 miliardy lidí (530 milionu dětí, dle WHO)
̶ infekční
̶ přenos bakterií (např. z matky na dítě slinou při olíznutím dudlíku)
̶ komplexní
̶ multigenní, multifaktoriální (faktory endogenní a exogenní)
̶ na výsledném vzniku se podílí souhra více faktorů
̶ složení orální mikroflory (hlavní faktor)
̶ vlastnosti skloviny a dentinu (kvalita povrchu zubu)
̶ složení a fyzikální působení sliny
̶ genetické predispozice celkový zdravotní stav (poruchy imun. systému, systémová onem.
ovlivňující IS)
̶ behaviorální a environmentální faktory
̶ čas – doba po kterou faktory působí/spolupůsobí
Puwadol Jaturawutthichai
(www.shutterstock.com)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK551699/
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU5
Zubní kaz
DOI:10.5005/jp-journals-10047-0051
Diagrammatic representation of the determining (risk factors) and confounding factors (risk
indicators/predictors) in dental caries disease.
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU6
Zubní kaz
̶ caries dentium
porušen dynamický proces cyklického střídání demineralizace a re-mineralizace
zubní skloviny → ↑ demineralizace →→ tvorba zubního kazu
̶ sklovina → kolem 97 % anorganické hmoty (apatit – kationtová komplexní sloučenina = ligandy Ca2+ a (PO4)2+
proti-anionty → Ca10(PO4)6CO3 (karbonátapatit), Ca10(PO4)6(OH)2 (hydroxyapatit), Ca10(PO4)6F2 (fluorapatit)
̶ organické kyseliny (bakterie, strava) → neutralizace aniontů apatitů → rozpad krystalové jednotky → rozpouštění minerální
složky skloviny → vznik kazu
̶ proteolytické enzymy bakterií → odbourávání organické složky (kolageny, proteoglykany)
̶ kaz → dentin → dentinové kanálky → zubní dřeň → zánět dřeně (pulpitida), ozubice (periodontitida)
Puwadol Jaturawutthichai
(www.shutterstock.com)
Color Atlas of Biochemistry
(3rd edition, 2013)
kyselina mravenčí
strava
léky
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU7
Faktory přispívající ke vzniku zubního kazu
̶ Slina:
̶ komplexní karioprotektivní faktor
̶ udržování homeostázy
̶ fyzikální faktor
průtok slin (omývání a lubrikace tkání dutiny ústní),
orální clearance (odmývání škodlivých látek,
nepřisedlých mikroorganismů)
̶ „chemický“ faktor
gustin (karbonická anhydráza VI → pufrovací kapacita),
vápenaté, fosfátové, fluoridové ionty,
lysozym, laktoferin,
proteiny specifické (IgA, IgG)
a nespecifické imunity (defensiny, katelicidiny, histatiny, statherin),
proteiny bohaté na prolin (PRPs),
muciny
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008058
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU8
Faktory přispívající ke vzniku zubního kazu
̶ Slina:
̶ působení sliny:
→ ↑ rovnováha mezi re- a demineralizací
→ ↓ zbytky potravy, ↓ mikroorganismy,
↓ kyselost prostředí (ředění, pufrovací systémy
– bikarbonát, hydrogenfosfát, proteiny)
→ ↑ látky s antibakteriálními, antimykotickými
a antivirovými vlastnostmi
̶ problém → snížená tvorba slin
 dehydratace, úzkostné stavy, obstrukce/hypofunkce
slinných žláz (DM, Sjögrenův syndrom, AIDS, tumory
a jejich léčba, akutní infekce)
 léky (beta blokátory, antidepresiva, antihistaminika)
 drogy (metamfetamin, THC)
→ podpora vzniku zubního kazu
www.dentalcare.com/en-us/professional-education/ce-
courses/ce410/fluoride-s-mechanism-of-action
9
Faktory přispívající ke vzniku zubního kazu
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU
https://periobasics.com/dental-plaque/
̶ Orální mikrobiom:
̶ dutina ústní → unikátní mikrobiologický habitat → separátní
ekologické niky (ne/deskvamující povrchy, slina) →
kolonizace specifickými druhy mikroorganismů
̶ druhý nejrozmanitější (až 1000 druhů mikroorganismů)
→ udržování homeostázy (kompetice a vytěsňování exogenních
patogenů pro zachování stability ekosystému)
→ modulace imunitního systému
̶ dentální plak = mikrobiální biofilm
→ matrix z extracelulárních polymerních látek (EPS)
→ aerobní bakterie (Streptococcus sanguinis), fakultativně anaerobní bakterie (S. mutans, S. sobrinus, Lactobacillus sp.),
anaerobní bakterie (Actinomyces sp., Veillonella sp.), plísně (Candida sp.)
→ slina → proteiny s povrchovým nábojem (kyselé PRPs, statherin, histatiny) → el.stat. interakce s fosfátovými a
vápenatými ionty apatitu → vznik acelulární pelikuly (muciny, cystatiny, albumin, IgA, IgG, lysozym, alfa-amyláza, cukry,
neutrální lipidy, fosfo- a glykolipidy, glukosyltransferáza) → ochrana před demineralizací a částečně před adhezí
mikroorganismů (proteiny na površích jsou zároveň i ve slině → kompetice bakteriálních vazebných receptorů)
→ substrát pro bakterie → formace biofilmu
https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.03323
̶ Dentální plak
̶ problém: dysbióza orálního mikrobiomu
→ porušení homeostázy → posun z eubiotické rovnováhy
od mutualismu/komensalismu k nevyváženému
parazitickému/patogennímu stavu → podpora vzniku
a rozvoje onemocnění
̶ dentální plak → převaha kariogenních druhů (fermentují sacharidy na org. kyseliny + tolerují
prostředí s nízkým pH) → nejčastější Streptococcus mutans a Streptococcus sobrinus,
Lactobacillus sp., Candida sp.
̶ faktory podporující převahu kariogenních druhů
→ ↑ přijímané cukry/kyseliny → okyselování, ↓ imunita, zánět, …
→ ↓ slina, ↓ orální hygiena → nárůst tloušťky plaku
→ ↑ plak → nedostatek kyslíku → ↑ anaerobní metabolismus → metabolizace fermentabilních sacharidů → organické
kyseliny → ↓ pH → demineralizace
→ ↑ plak → chrání kariogenní bakterie před obrannými mechanismy hostitele
S. mutans → dextran (α-1,6-D-glukan) → extracelulární nerozpustný polysacharid → ↑ ochrana bakterií proti
vlivům prostředí (nízké pH, antimikrobiální faktory), ↑ koadheze dalších druhů, ↑ přilnavost plaku
10
Faktory přispívající ke vzniku zubního kazu
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2021 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU11
Faktory přispívající ke vzniku zubního kazu
̶ Externí faktory:
→ nedostatečná orální hygiena
→ nevhodné stravovací návyky (nadměrný příjem fermentovatelných sacharidů)
→ kouření (e-cigarety – náplň má vysoký obsah cukru)
→ požívání alkoholu
→ léky (poškozen funkce slinných žláz, okyselující dutinu ústní, antibiotika)
→ nemožnost přístupu ke kvalitní stravě, pitné vodě, hygienickým potřebám, lékařské péči
̶ Čas
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU12
Faktory přispívající ke vzniku zubního kazu
̶ Genetické predispozice:
̶ komplexní onemocnění (genetické, epigenetické a exogenní faktory)
• polygenní
• genetická heterogenita – heterogenita genů ležících na různých lokusech (lokusová), heterogenita uvnitř jednoho
genu (alelická)
• neúplná penetrance – ne u všech jedinců dochází k manifestaci patologického fenotypu (další příznivě působící
alely, příznivý vliv exogenních faktorů)
• fenokopie (patologický fenotyp i u jedinců, kteří nemají sadu patologických alel
• vysoká frekvence patologických alel v populaci
• etnická variabilita (odpovědné geny se mohou lišit, varianty genů mají v různých populacích různý vliv na fenotyp)
→ lze určit pouze geny (alely), které zvyšují míru rizika onemocnění (risk factors) → predispozice (predisponující
genotyp může zvyšovat pravděpodobnost onemocnění, nicméně nedeterminuje jednoznačně jeho přítomnost)
13
Molekulární analýza
sliny
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU
(Salivaomika)
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU14
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
̶ bohatý rezervoár peptidů a proteinů
̶ složky slin se prokazatelně mění v reakci na
určitá onemocnění a stavy
̶ více než 100 molekul detekovaných ve
vzorcích slin je hodnoceno jako potenciální
diagnostické nebo prognostické biomarkery
pro různá onemocnění (např. zubní kaz,
parodontitida, rakovina, cukrovka)
Saliva is composed of biomolecules and fluids from different sources. Saliva is mainly
secreted by salivary glands, and its informative biomolecules (DNA, RNA, proteins,
metabolites and microbiota) are obtained from salivary glands, oral mucosa cells, oral
microbiota and gingival crevicular fluid.
https://doi.org/10.1111/prd.12099
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008058
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU15
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
̶ Salivaomika
→ pojem zaveden 2008
→ spojuje znalosti o různých „omických“ složkách sliny
(proteom, transktiptom, metabolom, mikrobiom, …)
→ využívá high-throughput technologie (genomika,
transkriptomika, proteomika, metabolomika, lipidomika a
mikrobiomika, …)
→ analýza sliny → identifikace biomarkerů
The different and complementary components of salivaomics
https://doi.org/10.1007/978-3-030-37681-9_4
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU16
Molekulární analýza
sliny
̶ Slina jako diagnostické
medium
Výhody:
̶ odběr neinvazivní, snadný, bezbolestný, opakovatelný (trvalá dostupnost materiálu), i nevyškolený
personál, lze u všech věkových kategorií
̶ vzorek o velkém objemu, stabilní v čase, zpracování rychlé, levné
̶ potenciál nahradit krev při screeningu, diagnostice a prognóze onemocnění
https://doi.org/10.3390/ijms17060846
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008058
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU17
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
Limitace:
̶ korelace hladin biomarkerů sérum/slina
↓↓↓ koncentrace analytů v porovnání se sérem → ↑ objem vzorku slin, detekční limit metody, deplece abundantních
proteinů (PRPs, α-amyláza, albumin, muciny and sekreční IgA mohou tvořit až 80 %), osmolalita
̶ vysoká variabilita → horší reprodukovatelnost výsledků
• technická (odběr, zpracování, použitá metoda)
• inter- (věk, pohlaví, fyziologický stav) a intraindividuální (cirkadiánní, cirkanuální)
• biologická (vliv stavu dutiny ústní, cirkadiánní rytmus, systémová onemocnění (Sjögrenův syndrom), léčiva,
chemo/radioterapie) → objem a složení slin
• rychlost a stimulace toku slin → koncentrace slinných biomarkerů
• proteolytické enzymy (mikrobiom/hostitel) → stabilita určitých biomarkerů
̶ otázka standardizace
→ vztažení proteinových markerů k celkovému proteinu sliny (stejná osoba jako vzorek i kontrola)
→ standardizace používaných metod, validace protokolů
→ zohlednění všech proměnných (variabilita složení, místo odběru, rychlost toku, objem vzorku, stimulace,
kontaminace krví, odběrové soupravy, integrita analytu) https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008058
https://doi.org/10.1007/978-3-030-37681-9
https://www.aacc.org/cln/articles/2013/january/saliva
→ otázka validace biomarkerů pro klinické
aplikace
• verifikace → stanovení biomarkeru různými
technikami, dosažení podobných výsledků
• validace → preklinická → definitivní akademická
(prospektivní odběr vzorků, retrospektivní evaluace)
→ multicentrické studie
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU18
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
Spektrofotometrické metody
̶ UV/Vis spektrofotometrie
(enzymy, metabolity, proteiny, anti/oxidanty)
̶ Atomová absorpční/emisní spektrometrie
(elementární atomy a ionty – Ca, Mg, Cr, Mn, Ni, Pb / Na, K)
̶ NIR (near infrared) spektroskopie
(ionty přechodných kovů a kovů vzácných zemin, molekuly
obsahující vazby C-H, N-H, S-H, O-H – thyokyanát, IgA, kortisol,
slinná α-amyláza, močovina, fosfáty, celkový protein)
https://doi.org/10.1007/978-3-030-37681-9
Table describing examples of commonly analyzed biomarkers in whole mouth saliva;
CRP – C-reactive protein; HPLC – high performance liquid chromatography; IC – ion
chromatography; LC-MS – liquid chromatography mass spectrometry; MALDI-TOF MS
- matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry; RT-LAMP
– reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification; AOPP – Advanced
Oxidation Protein Products; TBARS – Thiobarbituric Acid Reactive Substances; TAC –
Total Antioxidant Capacity; FRAS – Free Radical Analytical Systém.
Janšáková et at.,
Klin. Biochem. Metab., 26 (47), 2018, No. 1, p. 21–26
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU19
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
Imunoeseje
̶ Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
(přímá, nepřímá nebo sendvičová – adiponektin, kortison, kortizol,
C-reaktivní protein, D-dimer, laktoferrin, IgA, IgM, IgG, IgE, myoglobin)
̶ Chemiluminiscenční imunoesej (kortizol, testosteron, laktát)
̶ Fluoroimunoesej (slinná α-amyláza, Haptoglobin, C-reaktivní protein)
̶ Radioimunoesej (kortizol, estradiol, oxytocin)
̶ Neznačené imunoeseje (nefelometrie, turbidimetrie,
imunochromatografie, biosenzory/čipy)
https://doi.org/10.1007/978-3-030-37681-9
Table describing examples of commonly analyzed biomarkers in whole
mouth saliva; CRP – C-reactive protein; HPLC – high performance liquid
chromatography; IC – ion chromatography; LC-MS – liquid chromatography
mass spectrometry; MALDI-TOF MS - matrix assisted laser desorption
ionization-time of flight mass spectrometry; RT-LAMP – reverse transcriptase
loop-mediated isothermal amplification; AOPP – Advanced Oxidation Protein
Products; TBARS – Thiobarbituric Acid Reactive Substances; TAC – Total
Antioxidant Capacity; FRAS – Free Radical Analytical Systém.
Janšáková et at.,
Klin. Biochem. Metab., 26 (47), 2018, No. 1, p. 21–26
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU20
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
Tekutá biopsie (liquid biopsy)
̶ u nádorových onemocnění
̶ nahrazují tradiční tkáňovou biopsii
̶ testy, které detekují cirkulující nádorové buňky, exomy,
nádorovou DNA, nádorovou RNA a proteiny, které se šíří
do krevního řečiště nebo slin z primární léze
https://doi.org/10.1007/978-3-030-37681-9
Table describing examples of commonly analyzed biomarkers in whole
mouth saliva; CRP – C-reactive protein; HPLC – high performance liquid
chromatography; IC – ion chromatography; LC-MS – liquid chromatography
mass spectrometry; MALDI-TOF MS - matrix assisted laser desorption
ionization-time of flight mass spectrometry; RT-LAMP – reverse transcriptase
loop-mediated isothermal amplification; AOPP – Advanced Oxidation Protein
Products; TBARS – Thiobarbituric Acid Reactive Substances; TAC – Total
Antioxidant Capacity; FRAS – Free Radical Analytical Systém.
Janšáková et at.,
Klin. Biochem. Metab., 26 (47), 2018, No. 1, p. 21–26
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU21
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
„Omiky“
̶ DNA (genomika a epigenomika - rakovina),
̶ RNA (transkriptomika - biomarkery pro chronickou parodontitidu,
Sjögrenův syndrom, rakovinu plic, vaječníků, prsu a slinivky),
̶ proteiny (proteomy pro Sjögrenův syndrom, Downův syndrom, schizofrenii)
̶ metabolity (metabolomika – rakovina ústní dutiny, hepatocelulární a kolorektální karcinomy, parodontitida, chronické
onemocnění ledvin),
̶ lipidy a mikrobiom (lipidomika, mikrobiomika) a další
̶ souběžná analýza stovek analytů → přesná detekce malých změn
̶ vysoká citlivost, kvantitativní výsledky
̶ analýza souboru biomarkerů pro dané onemocnění
̶ zatím žádná v klinické aplikaci → snahy o „point-of-care“ testování
https://doi.org/10.1007/978-3-030-37681-9
https://doi.org/10.3390/bios11100396
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU22
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium – zubní kaz
̶ žádný diagnostický test
̶ testy náchylnosti k zubnímu kazu → mikrobiologická laboratoř
→ stanovení přítomnosti kariogenní mikroflóry
→ kvantitativní určení přítomnosti fermentujících mikroorganismů (okyselujících prostředí) ve slině
→ stanovení pufrovací kapacity slin a rychlosti sekrece slin
→ kvantifikace kolonií plísně Candida albicans
̶ snahy o vztažení prevalence zubního kazu k fenotypu určeném ze sliny → rozporuplné výsledky
https://doi.org/10.1007/978-3-030-37681-9
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU23
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium – náchylnost k zubnímu kazu
̶ proteinové biomarkery sliny asociované s náchylností ke vzniku zubního kazu:
↑ celkový protein, celková aktivita antioxidantů
↑ alfa-amyláza, muciny (MUC1 a MUC5B)
↓ arginin deiminázový systém, albumin, proteináza 3, PRP1/3, statherin, histatin 1
↓ koncentrace vápenatých a hydrogenuhličitanových iontů
↓ aktivita ureázy
̶ proteinové biomarkery sliny asociované s náchylností ke vzniku ECC:
↑ PRPs, histatiny, IgA, IgG
↓ statherin
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU24
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium – parodontitida, rakovina DÚ
̶ parodontitida
→ ↑ slinné biomarkery – IL-1β, MMP-8, MMP-9, TNF-α, AST, ligand pro receptor aktivátoru nukleárního faktoru κB
(RANKL), osteoprotegerin, prostaglandin E2
– lze je použít pro detekci počínající parodontitidy, pro rozlišení parodontitidy, gingivitidy a pro
predikci progrese parodontitidy a sledování prognózy)
→ ↑ bakterie červeného komplexu (Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola)
→ ↑ Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia (G- anaerobi)
→ genetické predispozice pro náchylnost → polymorfismus v genu pro IL-1
̶ rakovina (dlaždicobuněčný karcinom dutiny ústní – OSCC)
→ ↑ slinné biomarkery – IL-6, IL-8, IL-1α, IL-1β, CD59, MRP14 (myeloid related protein), profilin 1, kataláza, protein
vázající Mac-2 (M2BP)
→ další potenciální markery ve slině → telomeráza, Cyfra21-1, tkáňový polypeptidový antigen, nádorový marker CA 125,
CD44, glutathion, transferrin, mRNA (IL8, IL-1β, fosfatáza DUSP1, hemaglutinin HA3, enzym OAZ1, S100 calcium-binding protein P,
acetyltransferáza SAT) některé aminokyseliny, laktát, mimobuněčná DNA, mikroRNA, buňky karcinomu
doi: 10.3390/bios11100396
https://www.mdpi.com/2075-4418/7/1/7/htm
https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.013
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU25
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
̶ testovací sady pro ordinace (point-of-care testování, chair-side kits):
̶ zlepšení individualizované péče
• stanovení rizika vzniku zubního kazu
• riziko nástupu a posouzemí progrese parodontitidy
• screeningu rakoviny DÚ
̶ zubní kaz
• fyzikální parametry: množství, rychlost toku, viskozita, konzistence
pH sliny a pufrovací kapacita
• laktát
• stanovení kariogenních bakterií S. mutans a Lactobacillus sp.
komerční kity (stanovení
vizuálně, kolorimetricky)
komerční kity
(kultivační, imunochromatografická
detekce antigenu)
komerční kity
(stanovení kolorimetricky)
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU26
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
̶ testovací sady pro ordinace (point-of-care testování, chair-side kits):
̶ parodontitida
• detekce ve slině – aktivní MMP-8 → PerioSafe® PRO DRS (imunochromatografie) a ORALyzer® (analyzátor)
• detekce v tekutině dásňového sulku – aMMP-8 (ImplantSafe DR®), AST (PerioGard, PocketWatch)
̶ rakovina (OSCC)
screening
https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.112995
https://doi.org/10.3390/diagnostics11060932
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU27
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
̶ parodontitida
https://doi.org/10.3390/diagnostics11060932
https://decisionsindentistry.com/article/diagnostic-utility-oral-fluid-biomarkers/
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU28
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
– onemocnění a příklady biomarkerů
̶ autoimunitní onemocnění
Sjögrenův syndrom – α-amyláza, karbonická anhydráza VI,
laktoferin, β2-mikroglobulin
̶ neurodegenerativní onemocnění
Alzheimerova choroba – celkový tau protein, fosforylovaný tau
protein, amyloid-β a alfa-synuklein
̶ genetické onemocnění
cystická fibróza – Ca, PO4
2-, Na, K, Cl, ↓ objem slin, močovina, kyselina močová, prostaglandin E2
̶ rakovina
spinocelulární karcinom – IL-8, IL-6, IL-1β, IL-4, IL-1, VEGF, HER2, tissue polypeptide antigen (TPA) and EGFR, LDH,
N-α-acetyltransferase 10 protein (Naa10p), carcinoembryonic antigen (CEA) protein, serum basic fibroblast growth
factor (bFGF), transferin, cyklin D, Maspin, specifické mRNA ………….
r. prsu - HER2/neu (C-erbB-2), VEGF, EGF, specifické mRNA, autoprotilátky proti HER2 a MUC-1
r. slinivky – transkriptomické markery mRNA (KRAS, MBD3L2, ACRV1 a DPM1), specifické miRNA, laktoperoxidáza,
Cyklofilin B, Cytokeratiny (14, 16 a 17)
̶ alergie
potravinová alergie - IgE a IgG1 doi:10.7759/cureus.7708
https://doi.org/10.1016/j.medntd.2022.100115
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU29
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické mediu
– biomarkery onemocnění
̶ kardiovaskulární onemocnění
CK-MB, myoglobin, troponin I, myeloperoxidáza,
markery zánětu (CRP, TNF-α, MMP-9),
markery adheze (rozpustný CD40 a ICAM-1)
̶ metabolismus
diabetes melitus 2. typu – 1,5-anhydroglucitol, CRP,
leptin, IL-6, TNF-α
̶ infekční onemocnění
HIV – protilátky proti HIV
viry – přítomnost protilátek IgM/IgA, virová RNA
Kandidóza, amébiáza – přítomnost Candida sp., Entamoeba histolytica (protilátky)
Hepatitida – přítomnost DNA viru HBV
Peptidické vředy, gastritida, – přítomnost Helicobacter pylori (IgG protilátky, DNA H. pylori)
̶ hormonální nemoci
Cushingův syndrom a Addisonova choroba – kortizol
pohlavní hormony – syndrom polycystyckých ovarií, menopauza/andropauza, anovulace,
hypogonadismus, hyperestrogenismus
doi:10.7759/cureus.7708
https://doi.org/10.1016/j.medntd.2022.100115
30
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium – laboratorní biomarkery
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU31
Molekulární analýza sliny
̶ Slina jako diagnostické medium
– laboratorní biomarkery
https://www.oraldna.com/trends-in-salivary-testing/
https://www.ada.org/en/member-center/oral-health-topics/salivary-diagnostics
32
Molekulární analýza
orálního mikrobiomu
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU
(„Oralom“)
https://www.jorthodsci.org/viewimage.asp?img=
JOrthodontSci_2014_3_4_125_143233_f6.jpg
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU33
Molekulární analýza OM
̶ Orální mikrobiom
̶ společenství až 1000 různých druhů mikroorganismů → bakterie, houby, viry, archea, prvoci
→ bakteriální převaha
̶ „oralom“ → souhrnné označení pro dynamické interakce mezi orální mikrobiotou a hostitelem
(Např. orální mikroflóra je důležitá pro dozrávání a vývoj vhodné orální imunitní odpovědi → imunitní systém hostitele
se musí bránit před patogenními mikroby, ale zároveň harmonizovat a chránit komenzální orální mikroby.)
https://doi.org/10.1016/j.csbj.2021.02.010
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU34
Molekulární analýza OM
̶ Orální mikrobiom
̶ dysbióza → onemocnění DÚ
 strava hostitele
 zánětlivé reakce
 systémová onemocnění (DM 2, hyperglykémie)
 návyky hostitele (kouření, alkohol, chronický stres)
̶ zubní kaz → ↑ příjem sacharidů ve stravě → ↑ produkce kyselin → ↓ pH a pufrační schopnosti slin
→ ↑ produkce ECM biofilmu → zakoncentrování kyselin na povrchu skloviny → podpora růstu
acidurických a acidogenních druhů → dysbióza
̶ parodontitida → dysbióza subgingiválních mikrobiálních společenstev (biofilmu) → vytvoření a
udržování zánětu gingivy a parodontu → nepříznivý vliv na IS hostitele → zabránění subverzi IS a
obnově tkáně
→ určité druhy OM biofilmu → etiologické agens (bakterie červeného komplexu)
→ Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola → vykazují schopnost řídit procesy
zapojené do patogeneze onemocnění parodontu tím, že řídí restrukturalizaci mikrobioty a podporující zánět
→ orální virom může být v patogenezi onemocnění stejně významný jako orální bakteriom
https://doi.org/10.1111/prd.12393
https://doi.org/10.1038/s41579-018-0089-x
Microbial colonization occurs on
all available surfaces, and
microorganisms can also
penetrate epithelial tissues and
cells. The microbiota assembles
into biofilm communities on the
abiotic and biotic surfaces. In
health (left), eubiotic biofilms
maintain a homeostatic balance
with the host. In disease (right),
caries and periodontitis ensue
when biofilms become dysbiotic,
resulting in increased levels and
duration of low pH challenge and
the induction of destructive
inflammatory responses,
respectively. EPS, extracellular
polymeric substance; GCF,
gingival crevicular fluid.
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU35
Molekulární analýza OM
̶ Orální mikrobiom
̶ dysbióza → mikroby DÚ mohou ovlivňovat imunitní
odpověď a patogenezi nemoci i mimo DÚ
(rezervoár pathobiontů)
→ dutina ústní → vysoká míra vaskularizace, vstupní
místo dýchací a trávící soustavy
̶ systémová onemocnění → primární mechanismy spojující or. infekci se systémovými patologiemi
→ šíření infekce z dutiny ústní v důsledku přechodné bakteriémie
→ cirkulace mikrobiálních toxinů
→ systémový zánět způsobený nepříznivými imunologickými reakcemi na orální mikroby
̶ mikroby spojené s DÚ detekovány v mnoha vzdálených orgánech (tenké střevo, plíce, srdce,
mozek, placenta) → kolonizace závisí na zdrav.stavu dané tkáně
̶ prokázána asociace mezi mikroby podílejícími se na parodontitidě a chronickými stavy
(kardiovaskulární onemocnění, hypertenze, zánětlivá onemocnění)
→ subgingivální biofilm → zdroj bakterií a prozánětlivých mediátorů → cirkulace
https://doi.org/10.1111/prd.12393
https://doi.org/10.1038/s41579-018-0089-x
Microbial colonization occurs on
all available surfaces, and
microorganisms can also
penetrate epithelial tissues and
cells. The microbiota assembles
into biofilm communities on the
abiotic and biotic surfaces. In
health (left), eubiotic biofilms
maintain a homeostatic balance
with the host. In disease (right),
caries and periodontitis ensue
when biofilms become dysbiotic,
resulting in increased levels and
duration of low pH challenge and
the induction of destructive
inflammatory responses,
respectively. EPS, extracellular
polymeric substance; GCF,
gingival crevicular fluid.
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU36
Molekulární analýza OM
̶ Orální mikrobiom – potenciální biomarker systémových onemocnění
https://doi.org/10.1111/prd.12393
https://doi.org/10.3390/microorganisms8020308
Oral and systemic diseases associated with the oral microbiome. A representation of the associations found between diseases with
increases or decreases of the abundances of organisms in the oral cavity. Organisms listed in blue have been shown to be increased in
abundance in the oral cavity in individuals presenting with the noted disease, and organisms listed in red have been shown to be
decreased. Those in purple may be either increased or decreased depending on the conditions or progression of the disease.
orálního
mikrobiom
jako
neinvazivní
biomarker
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU37
Molekulární analýza OM
̶ Orální mikrobiom
https://doi.org/10.3390/microorganisms8020308
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU38
Molekulární analýza OM
̶ Orální mikrobiom – metody analýzy
̶ místo odběru vzorku
→ OM na různých místech dutiny ústní (slina, jazyk, patro, bukální sliznice, povrchy zubů, dásně, supra/subgingivální
plak, mandle, hrdlo) sice vykazuje celkovou podobnost, ale s rozdíly → ekologické niky
→ obecný mikrobiální screening pro diagnostiku se provádí ze sliny nebo místně specificky
z tekutiny dásňového sulku nebo z dentálního biofilmu
https://doi.org/10.1111/prd.12393
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU39
Molekulární analýza OM
̶ Orální mikrobiom – metody analýzy
̶ mikrobiologické kultivace
→ 250 druhů izolováno a charakterizováno
→ OM komplexní → některé druhy se dosud nepodařilo kultivovat
̶ sekvenování z jedné buňky (single-cell sequencing NGS)
→ původně vyvinuto pro účely imunitního profilování
→ upraveno, aby umožňovalo hodnocení jednotlivých mikrobiálních buněk
→ ↑ míru detekce nekultivovatelných organismů
̶ sekvenace 16S rRNA
→ sekvenace konzervovaného genu pro 16S rRNA (bakterie) nebo ITS (internal transcribed spacer) oblasti DNA (plísně)
→ nejčastější sekvenační metoda, levná
→ pouze taxonomické údaje (omezená rozlišovací schopnost fylogeneticky příbuzných druhů/kmenů)
̶ celogenomové sekvenování (WGS – whole genome shotgun sequencing)
→ DNA je náhodně fragmentována a pak podrobena Sangerovu sekvenování nebo NGS
→ nástroj pro metagenomickou analýzu, paralelní hodnocení všech říší (bakterie, plísně, viry) v jednom vzorku
→ nejen taxonomické údaje, ale i biologické funkční profily mikrobiální komunity
→ evoluční analýza specifických organismů spojených s konkrétní chorobou nebo prostředím
https://doi.org/10.1111/prd.12393
genomika
qPCR
→ nejen gen pro 16S rRNA, ale také
jiné geny, umožňuje také kvantifikaci
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU40
Molekulární analýza OM
̶ Orální mikrobiom – metody analýzy
̶ transkriptomika → vymezení exprese mikrobiálních a hostitelských genů v kontextu orálního
zdraví a patologie
̶ sekvenování mRNA (metatranskriptomika)
→ pomocí náhodných hexamerových primerů
→ přehled o životaschopných a transkripčně aktivních mikrobech
→ paralelní hodnocení mikrobiálních a hostitelských transkriptomů → zkoumány za účelem posouzení
interaktomu
̶ metabolomika → metabolické a funkční aktivity hostitele a jeho mikrobiomu → pohled na složité
mezidruhové interakce
→ nízkomolekulární metabolity, proteiny
→ kapalinová/plynová chromatografie s hmotnostním spektrometrem, NMR
→ parodontitida → charakteristický posun ve složení orálních bakterií, který je zčásti zprostředkován bakteriálními
metabolity → metabolomika → jak a proč k tomuto posunu dochází
→ může nabídnout vodítko pro kritické časové body, ve kterých by mohly být přínosné terapeutické zásahy
https://doi.org/10.1111/prd.12393
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU41
Molekulární analýza OM
̶ Orální mikrobiom– metody zkoumání
̶ proteomika → profil všech proteinů v organismu, tkáni, buňce nebo biologické tekutině nebo
podsložce kterékoli z nich → pohled při zdraví/nemoci
→ proteiny e vzorku → ne/jsou, množství, posttranslační modifikace, izoformy, molekulární interakce
→ 1-D/2-D gelová elektroforéza s hmot. spektrometrií, kapalinová chromatografie s hmotnostním spektrometrem
→ k charakterizaci změn při gingivitidě, mírné, středně těžké a chronické parodontitidě
̶ vysoce rozlišovací techniky + klinické údaje + longitudinální studie → pochopení interakcí
mikrobiálních hostitelů od druhové úrovně po molekulární úroveň a jejich důsledků na orální zdraví
https://doi.org/10.1111/prd.12393
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU42
Molekulární analýza OM
https://doi.org/10.3390/microorganisms8020308
Schematics of standard techniques used in microbiome studies. (A) Marker gene sequencing techniques can use primers to target certain conserved regions of a genome to capture intermittent variable regions, which can then be used
to identify organisms in a sample rapidly and inexpensively. The 16S rRNA gene is the most commonly used marker gene in bacteria and archaea, and in the figure, primers are used to capture the V3 and V4 variable regions together, a
common approach for 16S sequencing. The internal transcribed spacer (ITS) region of the nuclear rRNA cistron in fungi is made of two segments, which can be captured with primers targeting the 18S, 5.8S, and 28S rRNA sections that
surround them. (B–D) Instead of targeting one small segment of the genome, these techniques capture the entirety of the genetic material from an organism. (B) Single virus genomics (SVG) uses a fluorescent stain to isolate individual
virus particles in a sample by fluorescence-activated virus sorting (FAVS), wherein they are embedded in an agarose bead before undergoing whole genome amplification and sequencing. (C) Whole metagenome shotgun sequencing
(WMS) involves the fragmentation of all DNA in a sample, sequencing of the fragments, and assembly of the sequences, which can then be mapped to reference genomes, or de novo assembly can be performed. (D)
Metatranscriptomics also involves a shotgun sequencing approach, but it is performed after mRNA extraction. The outputs then allow for differential gene expression analysis. (E) Metabolomics and metaproteomics allow for
quantification of the metabolites and proteins produced by the microbiome in a sample, respectively. Mass spectrometry is a common approach to quantification.
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU43
Molekulární analýza OM
https://doi.org/10.3390/app11094050
̶ Orální mikrobiom
→ klinická uplatnění
→ predikce náchylnosti k onemocněním DÚ
→ mikrobiální screening na systémová onemocnění
→ včasná diagnóza onemocnění (ještě před výskytem symptomů)
→ sledování průběhu onemocnění a účinnosti léčby (posun mikrobioty z dysbiózy), cílená léčba
→ účinný nástroj pro prevenci (viditelný důkaz přístupu pacienta k péči o chrup)
→ vývoj nových terapeutických přístupů, personalizovaná dentální léčba
→ výzkum – snaha o úplnou charakterizaci „zdravého“ mikrobiomu
(Které komponenty mikrobiomu je nejvhodnější sledovat, aby bylo možné vyhodnotit návrat mikrobiomu ze stavu
dysbiózy do stavu kompatibilního se zdravím? Stačí sledovat pouze vybrané klíčové druhy nebo je nutné
používat vícedruhové eseje?)
̶ Orální mikrobiom– metody analýzy
̶ testovací v ordinaci (chair-side/point-of-care testování):
náchylnost k zubnímu kazu – přístroj CariScreen Susceptibility Testing Meter (Oral BioTech LLC)
→ bakteriální aktivita S. mutans
→ po setření plaku ze zubní plošky dojde ve speciální štětičce k bioluminiscenční reakci ATP, která je
změřena přístrojem
parodontitida – BANA-Enzymatic test™ kit, Evalusite kit (imunoesej)
̶ laboratorní analýza
komerční testy - příklad
parodontitida – kit MyPerioPath® (OralDNA Lab)
→ testuje ze sliny přítomnost a množství 11 bakterií, které přispívají ke vzniku
parodontitidy (analýza metodou kvantitativní PCR v reálném čase)
ELISA test → antigeny P. gingivalis
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU44
Molekulární analýza OM
https://www.creative-bioarray.com/support/atp-
cell-viability-assay.htm
https://carifree.com/product/pro-cariscreen-testing-meter/
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU45
Molekulární analýza OM
https://doi.org/10.3390/diagnostics11060932
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU46
Molekulární analýza OM
̶ Orální mikrobiom
̶ databáze
47
Genetické asociační
studie kandidátních
genů
(case-control studies)
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU
http://www.discoveryandinnovation.com/BIOL20
2/notes/lecture25.html
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU48
Genetické asociační studie
̶ Kandidátní geny
̶ Výběr vhodných kandidátních genů
→ na základě známé biologické, fyziologické anebo funkční významnosti ve vztahu k danému onemocnění
→ hledání nových potenciálních genů (alel) v celém genomu (GWAS, QTL – lokusy kvantitativních znaků)
̶ Výběr vhodných kandidátních genů pro studie zubního kazu
→ geny, které se účastní vývoje zubu a ovlivňují tak jeho morfologii
→ geny, které souvisí s imunitní odpovědí
→ geny, které souvisí s produkcí a složením sliny
→ geny, které souvisí s chuťovými preferencemi
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU49
Genetické asociační studie
̶ Kandidátní geny
̶ Výběr alel (polymorfismů)
→ SNP (Single Nucleotide Polymorhism), CNV (Copy Number Variation), VNTR (Variable Number of Tandem Repeat)
→ na základě studií, které již byly provedeny v rámci jiných populací
→ alela má v dané populaci dostatečnou frekvenci
(větší soubor případů/kontrol → můžeme si dovolit studovat alely i s nižší frekvencí v populaci)
→ vazebná nerovnováha mezi SNPs → tagSNP
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU50
Genetické asociační studie
̶ Metody genotypizace
̶ výběr vhodného metodického přístupu
→ počet polymorfismů, které budou stanovovány
→ celkový počet vzorků, které budou genotypizovány
→ kvalita analyzované DNA (genomová DNA – krev, slina, bukální stěr)
→ náklady na přístroje, chemii a spotřební materiál
→ dostupnost komerčních služeb pro genotypizaci
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU51
Genetické asociační studie
̶ Metody genotypizace
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU52
Genetické asociační studie
̶ Metody genotypizace
https://doi.org/10.1016/j.jim.2004.10.007
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU53
Genetické asociační studie
̶ Metody genotypizace
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU54
Genetické asociační studie
̶ Metody genotypizace
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU55
Genetické asociační studie
̶ Metody genotypizace
̶ Single Nucleotide Polymorphism
Detection with the iPLEX® Assay
and the MassARRAY® System
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2021 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU56
Genetické asociační studie
̶ Metody genotypizace
̶ výběr vhodného metodického přístupu – podle čeho vybírat
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU57
Genetické asociační studie
̶ Kandidátní geny asociované s rizikem
vzniku zubního kazu
̶ Proteiny zapojené do vývoje skloviny
AMELX – gen pro amelogenin
ENAM – gen pro enamelin
TUFT1 – gen pro tuftelin
KLK4 – gen pro kallikrein 4
AMBN – gen pro ameloblastin
TFIP11 – gen pro protein interagující s tuftelinem
MMPs (MMP20) – geny pro matrixové metaloproteinázy
Schematic diagram of histological changes in amelogenesis. The histological development of enamel crystals goes
hand in hand with changes in ameloblast morphology. Undifferentiated epithelial cells receive signals to transform into
secretory ameloblast cells of some 75 μm tall and ∼5 μm in diameter with a specialized distal cell process (Tomes’
process) which plays an important role in matrix exocytosis. These same cells will retransform into shorter cells
(∼35 μm tall) during maturation devoid of the Tomes’ process. In maturation stage, ameloblasts undergo cyclical
changes from a cell with a distal ruffled border, the ruffled‐ameloblast (RA), to a cell with a smooth distal border, the
smooth‐ameloblast (SA). Tight junctions are found at the basal and apical pole of secretory ameloblasts. The apical or
distal pole is closest to the enamel crystals. In RA cells, tight junctions are found only at the apical pole but in SA cells
they are located at the basal pole. Organellar distribution differs in cells at each stage (see text for details).
SI = stratum intermedium, PL = papillary layer, EMPs = enamel matrix proteins. MMP20 and KLK4 are the main
proteases in AMEL processing. See also organellar distribution at each stage.
https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.11.071
https://doi.org/10.1113/JP272775
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU58
Genetické asociační studie
̶ Kandidátní geny asociované s rizikem
vzniku zubního kazu
̶ Chuťové receptory → asociace s preferencí ke sladké chuti → ↑ příjem cukrů
TAS2R38 – gen pro chuťový receptor (Taste receptor 2 member 38) – receptor spřažený s G-proteinem, zodpovědný za
citlivost k hořké chuti
TAS1R1/TAS1R3 – geny pro chuťové receptory (Taste receptor 1 member 1/3) – receptory spřažené s G-proteinem,
zodpovědné za citlivost ke sladké chuti
https://doi.org/10.3390/s100403411
https://doi.org/10.1080/00016357.2020.1832253
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU59
Genetické asociační studie
̶ Kandidátní geny asociované s rizikem
vzniku zubního kazu
̶ Glukózový transportér → asociace s preferencí ke sladké chuti → ↑ příjem cukrů
GLUT2 – gen pro glukózový transportér 2 – potřebný pro glukózou stimulovanou sekreci inzulinu (β-buňky pankreatu),
řídí vnímání glukózy (nervový systém) → kontrola přijmu potravy, jeho exprese nutná pro fyziologickou
kontrolu genů citlivých na glukózu a její inaktivace vede ke zhoršené glukózou stimulované sekreci inzulínu
(játra).
https://doi.org/10.1080/00016357.2020.1832253
https://doi.org/10.3390/s100403411
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU60
Genetické asociační studie
̶ Kandidátní geny asociované s rizikem
vzniku zubního kazu
̶ Proteiny imunitní odpovědi
MBL2 – gen pro lektin vázající manózu (mannose-binding lectin) – rozpustný sérový lektin rozpoznávající specifické
sacharidy na površích bakterií → ↓ aktivace komplementu
Schematic representation of the lectin pathway of the complement system. The lectin pathway (LP) is
triggered by five pattern recognition receptors (PRR): mannose-binding lectin (MBL), ficolin-1, -2, and -3,
and collectin 11 (CL11 or CL-K1). The LP is initiated when these PRRs bind to pathogen-associated
molecular patterns (PAMPs) on the surface of pathogens or to apoptotic or necrotic cells (damageassociates
molecular patterns, DMAPs). Circulating MBL, CL11, and ficolins form complexes with MASP-1
and MASP-2. After the binding of MBL, ficolins, and CL-11 to their targets, MASP-1 auto-activates and
triggers MASP-2. Activated MASP-2 cleaves C4 and C2 allowing the assembly of the C3 (C4bC2a) and C5
(C4bC2a(C3)n)convertases and the subsequent activation of the terminal pathway. Activated MASP-1 also
cleaves C2. MAC = membrane attack complex. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-9209-2_7-1
https://doi.org/10.1080/08927014.2020.1856821
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU61
Genetické asociační studie
̶ Kandidátní geny asociované s rizikem
vzniku zubního kazu
̶ Proteiny sliny
DEFB1 – gen pro beta defenzin 1 – antimikrobiální peptid z rodiny defenzinů (alfa, beta), která zahrnuje cyklické kationtové
peptidy bohaté na cystein. Jsou součástí vrozené imunity, vytváří kanály v cytoplasmatické membráně bakterií,
stimulují imunitní systém vč. komplementu (klasická cesta), působí jako chemoatraktanty.
LTF – gen pro laktoferin – transportní globulární glykoprotein, váže volné železo. Součást vrozené imunity, antibakteriální
(při interakci s bakteriální membránami vznikají peroxidy), antivirová (kompetice adheze virových částic na buňky
hostitele, vazba na částice určitých typů virů), antifungální (proti C. albicans) aktivita, stimulace fagocytózy.
LYZL2 – gen pro lysozymu podobný protein 2 (lysozyme-like protein 2) – součástí rodiny lysozymů typu C.
Hydrolyzuje glykosidické vazby v peptidoglykanech (rozkládá buněčnou stěnu G+ bakterií).
https://doi.org/10.1590/1807-3107bor-2017.vol31.0041
https://doi.org/10.1590/1807-3107bor-2017.vol31.0041
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU62
Genetické asociační studie
̶ Kandidátní geny asociované s rizikem
vzniku zubního kazu
̶ Proteiny sliny
CA6 – gen pro karbonickou anhydrázu VI – enzym gustin, katalyzuje hydrataci oxidu uhličitého za vzniku
hydrogenuhličitanového iontu a protonu, kontrola pH sliny (bikarbonátový pufrační systém).
MUC7 – gen pro mucin 7 – nízkomolekulární glykoprotein (MG2), podílí se na vzniku pelikuly a tím na bakteriální adhezi.
MUC5B – gen pro mucin 5B – glykoprotein, podílí se na vzniku pelikuly a tím na bakteriální adhezi.
PRH1 – gen pro kyselý PRP – protein bohatý na prolin (proline-rich protein), podílí se na vzniku pelikuly a tím na
bakteriální adhezi.
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU63
Genetické asociační studie
̶ Úskalí genetických asociačních studií ve vztahu k zubnímu kazu
▪ příliš mnoho faktorů majících úlohu v etiopatogenezi → pacienty (cases) nikdy nejde dokonale roztřídit do kategorií
→ nelze vytvořit dokonale definovaný soubor → maximálně definovaný soubor dle možností
▪ většina studií nepotvrdí asociaci pouze naznačí, ale málokdy potvrdí (některé studie dávají dokonce protichůdné
výsledky) → další studie, nezbytné k porozumění předchozích nalezených korelací
▪ Další asociační studie s více vzorky → studie jednotlivých polymorfismů (ale jejich efekt může být malý), ale i genů
a lokusů (gene-based a gene-cluster analýzy → další posílení výsledků
▪ meta-analýza – kombinace dat získaných vyčerpávajícím vyhledáváním publikovaných i nepublikovaných
světových dat → zvyšování konzistence výsledků (tím, že se zvyšuje síla výsledku). Mnoho primárních studií je
příliš malých nato, aby mohly prokázat důležitý klinický účinek (nemají dostatečnou sílu). Kombinací všech studií,
které odpovídají na stejnou klinickou otázku → zvýšení statistické, klinické nebo významové síly.
▪ podrobné dotazníky pro zhodnocení vlivu psychologických, sociologických, ekonomických a behaviorálních faktorů
→ rozmělnění souboru na příliš velké množství skupinek o příliš malém počtu pacientů
Genetika v zubním lékařství, Jaro/2022 – Zubní lékařství, Ústav patologické fyziologie LF MU64
https://doi.org/10.1111/adj.12262