Izolácie buniek a funkčné testy lymfocytov Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz) Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU Rozdelenie imunologických laboratórnych metód serologické (humorálne)- detekcia antigénov a protilátok, Metódy preukázanie tvorby protilátok proti infekčnému agens bunečné- počty a funkcie jednotlivých typov leukocytov Separace leukocytů - obecný přehled • Pro provedení funkčních testů in vitro je většinou nutná separace leukocytů z plné krve • Výběr separační metody záleží na: • O jaký typ leukocytů máme zájem • Jak velký stres při izolaci buňka vydrží (viabilita) • Jaký potřebujeme výtěžek a čistotu izolované suspenze buněk! • Finanční nákladnost Separace leukocytů - obecný přehled 1. Izolace PBMC (peripheral blood mononuclear cells) 2. Adherence na plastový povrch 3. Rozetové separace 4. Magnetická selekce 5. Modifikace průtokové cytometrie - sorting 1. Izolace PBMC PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells = lymfocyty+monocyty • Izolácia PBMC pomocou gradientovej centrifugácie Krv sa navrství na separačné médium Pri centrifugácii sa oddelia jednotlivé vrstvy na základe odlišnej vznášivej hustoty – hore je plazma, medzi plazmou a médiom je vrstva PBMC, na dno klesnú erytrocyty a granulocyty 1. Izolace PBMC • Odoberie sa plazma • Naberie sa vrstva PBMC pozorovateľná ako biely prstenec na rozhraní plazmy a média • PBMC sa premyje v PBS (opakované stočenie, odliatie supernatantu, rozsuspendovanie peletu v PBS) • Získavame koncentrovanú suspenziu mononukleárov • Spočítání PBMC na analyzátoru  ředění buněk pro funkční test 2. Adherence na plastový povrch • Slouží k izolaci monocytů • Využívá jejich přirozené schopnosti adherovat na plastové povrchy • Provedení: • Izolace PBMC • Izolované PBMC se inkubují několik hodin na plastové misce • Monocyty postupně adherují ke dnu, lymfocyty ne • Nevýhoda – nízká čistota (70-80%) a výtěžnost (získáme kolem 50% monocytů ze vzorku) • Výhoda – levná a málo pracná izolace 3. Rozetové separace • Využívá monoklonálních protilátek spojených do 2 typů tetramerů • Plná krev - pomocí tetramerů se prováží RBC s leukocyty, kterých je nutné se zbavit • Následuje klasická izolace na hustotním gradientu • Nechtěné buňky klesnou ke dnu s RBC • Chtěné buňky zůstanou v prstenci na rozhraní plazmy a separačního média, (tedy ty buňky, vůči kterým nebyly tetramery namířeny) 4. Magnetická selekce • Využívá monoklonálních protilátek navázaných na magnetické kuličky • 2 druhy selekce: pozitivní a negativní • Pozitivní: protilátka namířena vůči specifickému znaku požadované populace (např. pomocí anti-CD4 izolujeme CD4 T-lymfocyty) • Požadovaná populace je pomocí magnetu zachycena ve zkumavce • Vše ostatní je v dalším kroku odmyto • Nevýhoda: vazba protilátky může izolované buňky nespecificky aktivovat, magnetické částice zůstávají v suspenzi spolu s buňkami u některých kitů 4. Magnetická selekce • Negativní selekce: • Koktejl monoklonálních protilátek namířený vůči všemu v krvi/PBMC kromě populace kterou požadujeme • Nechtěné buňky jsou přidrženy pomocí magnetu • Cílové buňky zůstávají v roztoku – odsátí do nové zkumavky • Výhoda: izolované buňky nejsou ovlivněny vazbou protilátek – výhodné pro výzkum • Nevýhoda: nutné dodržet poměr přidávaných protilátek a suspenze buněk – pokud se buněk přidá moc, protilátka nestačí a výsledná suspenze buněk je kontaminovaná (nízká čistota) 5. Sortrování • Princip: průtoková cytometrie 1. Buňky jsou označeny pomocí monoklonálních protilátek 2. Analýza buněk na cytometru  cílová populace se zagatuje v pc 3. Přístroj rozdělí buňky tak, aby v proudu nosné kapaliny v 1 kapce byla 1 buňka 4. Každé kapce je přiřazen + nebo – náboj  vychýlení kapky s cílovou buňkou do zkumavky pomocí magnetu Výhoda: Nejvyšší čistota buněk Nevýhoda: Velmi drahé, zdlouhavé, nižší viabilita Funkční testy lymfocytů - přehled • Rutinní • Proliferace (blastická transformace) • Výzkumné • Test cytotoxicity • ELISPOT a FLUOROSPOT • Detekce aktivačních znaků pomocí průtokové cytometrie Funkčné testy lymfocytov • test PROLIFERÁCIE lymfocytov (test blastickej transformácie) – sleduje sa schopnosť delenia lymfocytov po stimulácii Definícia: nárast počtu buniek ako výsledok bunečného rastu a bunečného delenia • bujnenie, novo-tvorenie, rast • lat. prolifero prinášať potomstvo: proles deti; fero niesť • dve významné úlohy (role) • embryonálny vývoj • dospelé telo (napr. krvotvorba, obnova tkanív) • typy: symetricky, asymetricky, diferenciačné delenie Kedy indikovať test proliferácie??? • podozrenie na SCID • odpoveď na liečbu (farmaceutika) SCID Severe Combined Imunodeficiency • skupina ochorení, ktoré vykazujú poruchu vo vývoji lymfoidnej rady – niekedy iba porucha vývoja T-lymf., niekedy kombinácia s B-lymf. a s NK bunkami (záleží na genetickej poruche) • klinické prejavy - thymus se nevyvíja normálne (úplne/redukcia), veľmi nízke počty cirkulujúcich lymfocytov (lymfopénia) a T-lymfocytov • lymfocyty nereagujú na stimuláciu mitogénmi – tzn. nemôžu proliferovať v odpovedi na antigény (myeloidná a erytroidná rada je v počtoch a funkcii neovplyvnená) SCID • existuje asi 7 variant, ktoré sú AR, jedna X viazaná • väčšinou ide o defekt v gama reťazci IL-2R (X-viazaná forma), tento reťazec je aj súčasťou receptorov IL-4, -7, -9, 15 Syndrom T-bb B-bb NK-bb Dědičnost Retikulární dysgeneze - - - AR ADA deficit - - - AR RAG 1,2 deficit - - + AR CgC deficit - + - XL JAK3 deficit - + - AR IL-7Ra deficit - + + AR Omennův syndrom + - + AR ZAP-70 deficit CD4+ + + AR SCID • Predĺženie života vyhnutím sa kontaktu s potenciálne nebezpečnými patogénmi – musia žiť v sterilním prostředí!!! • Musia sa vyhýbať kontaktu s ľuďmi a nefiltrovaným vzduchom, všetkým s čím prídu tieto deti do styku – vrátane jedla! David, Bubble boy – strávil v izolační bublině celý svůj život – 12 let Obecné schéma zpracování vzorku na proliferaci 1. Izolace PBMC nebo odběr plné krve do heparinu 2. Umístění leukocytů do sterilního živného média 3. Stimulace leukocytů – přidáme polyklonální mitogen 4. Inkubace několik dní (3-4) – buňky se dělí po reakci na mitogen 5. Detekce proliferace (různé metody) 6. Vyhodnocení Kultivácia lymfocytov in vitro • Pestovanie prebieha v definovanom bazálnom médiu RPMI – obsahuje cukry, AMK, vitamíny, stopové prvky atd. (+ ATB – penicilín, streptomycín) pri 37°C, 5% CO2, 95% vlhkosť • Obsahuje také acidobazický indikátor - fenolovou červeň (je zodpovědná za růžové zbarvení média) • V průběhu dělení buňky spotřebovávají živiny a tvoří kyselé metabolity  posun pH do kyselé oblasti  změna barvy fenolové červeně z růžové na žlutou • Žlutá indikuje vyčerpané médium – nutno vyměnit za nové!! RPMI médium - čerstvé RPMI médium – buňky vyčerpaly živiny  nutnost výměny média Stimulancia • Rastlinné lektíny - PHA (phytohaemagglutinin) ConA (Concanavalin A) • monoklonálne protilátky proti receptorom a koreceptorom (anti-CD3,+ anti-CD28) • bakteriálne antigény – tetanický toxoid, tuberkulin • Stimulancia fungují jako polyklonální mitogeny! • Aktivace velkého počtu lymfocytů nezávisle na jejich antigenní specifitě! Metody detekce proliferace Bez využití průtokové cytometrie Inkorporace H3 thymidinu DELFIA S využitím průtokové cytometrie CFSE Detekce Ki-67 Metódy – 1. Inkorporace 3H thymidinu • Nejstarší metodika • Detekcia novo syntetizovanej DNA pomocou thymidínu značeného radioaktívne (tríciom), který se zabuduje do nově syntetizované DNA • Meranie na beta-counteru (scintilačný detektor) • Zastaralá metodika – dnes se již rutinně nepoužívá 2. DELFIA (PerkinElmer) • BrDU- BromoDeoxyUridin • analóg Tymidínu • Cheláty lathanidů - Eu- Európium • Detekcia novo syntetizovanej DNA pomocou BrDU, začlení sa do novo vznikajúcej DNA, BrdU je potom detekované pomocou protilátky anti-BrdU značenej Eu • jednotlivé stimulancia v tripletoch Detekce - TRF- Time resolved fluorescence Časově modulované měření fluorescence Výhoda: Cheláty lathanidů mají dlouhou dobu fluorescence a velký rozdíl mezi excitační a emisní vlnovou délkou Pulzní excitace chelátu lathanidu  Měření fluorescence se zpožděním – v době, kdy již pominula nespecifická fluorescence pozadí  vysoká přesnost a citlivost metody Výsledok DELFIA – počet záblesků v každé jamce Príprava vzorky • cca 2,5 hod • cca 72 hod Počítání buněk – přístroj Vicell XR • Vitální barvení trypanovou modří • Živé buňky – barvivo skrze membránu nepronikne – aktivní metabolismus (jsou průhledné) • Mrtvé buňky – průnik barviva skrze porušenou membránu (modré zbarvení) • Stroj vyfotí 50 zorných polí – informace o % viability + výdej výsledku o počtu buněk – miliony na 1 ml • Cílovou koncentraci buněk pro proliferaci nutno dopočítat a příslušně naředit 3. CFSE • Cytometrická detekcia pomocou fluorescenčného farbiva CFSE (karboxyfluoresceinsukcinimidylester), ktoré sa viaže nešpecificky na rôzne štruktúry v bunkách, sleduje sa pokles fluorescencie po delení buniek • S každou nově vzniklou generací buněk klesá intenzita fluorescence • Informace nejen o proliferaci, ale také o počtu proběhlých buněčných cyklů 4. Cytometrické stanovenie – Ki-67 – in house metoda • Ki-67 - jadrový proteín • asociovaný (možno nevyhnutný) s bunečnou proliferáciou a s transkripciou rRNA • interfáza- bunečné jadro • mitóza- povrch chromozómov • prítomnosť G1, S, G2, mitóza • absencia G0 HeLa cells Ki-67 proteín (červená) tubulín (zelená) DNA (modrá) Spracovanie • značenie živé mrtvé buňky - L/D- 30 min • Live/dead barvička – váže se na aminoskupiny na buňkách – živé jsou pozitivní slabě (barvička je pouze na povrchu buněk, mrtvé jsou pozitivní silně – porušenou membránou barvivo proniklo dovnitř buňky a navázalo se také na aminoskupiny proteinů vyskytujících se intracelulárně • extracelulárne značenie (anti-CD25, anti-CD8)- 30 min • CD25- súčasť receptoru pre IL-2 (α reťazec) • fixácia (paraformaldehyd)- 60 min – zafixuje buňky – zabránení rozpadu • permeabilizácia – vytvoření pórů do buněčné a jaderné membrány, umožní průnik protilátek • intracelulárne značenie (anti-CD3, anti-Ki-67)- 30 min L/D Gatovacia stratégia Gatovacia stratégia Pacient 1: ↓ expresia Ki-67 Pacient 2: ↑ apoptóza buniek •nestimulované •stimuláciaaCD3 Pacient 2: ↑ apoptóza buniek Pacient 3: silnejšia stimulácia→ zvýšená úmrtnosť bb EXBIO Ki-67 KIT – metoda certifikovaná firmou • Stimulancia lyofilizované v skúmavkách • Krv odobraná do heparínu • Všetky potrebné reagencie prítomné v sete • Detekcia: CD3 + Ki67 • Štandardizovaný a testovaný postup: • Zkumavka obsahuje vysušený mitogen  • Přidáme 45ul plné krve + 500ul RPMI média • Inkubace 3 dny • Značení anti-CD3 na povrchu • Fixace a permeabilizace buněk  • Značení anti-Ki-67 uvnitř jádra buněk Gatovacia stratégia Proliferačné vyšetrenie • Výsledok: porovnanie kontrola vs. pacient - počet zábleskov (DELFIA) - % Ki67+ buniek (cyt. stanovenie) • Kontrola prevedenia: odber?, viabilita buniek po izolácii PBMC?, spotrebované médium?, • Cytometer: dostatok buniek na analýzu, veľkosť FSC vs. SSC, L/D, % Ki67+ CD3+ buniek Cytotoxický test • Schopnost CD8 T-lymfocytů a NK buněk zabíjet jiné buňky pomocí systému granzym/perforin • Provedení: • V testu musí být kromě pacienta zpracována i zdravá kontrola! (aby bylo pacienta s čím srovnat) 1. Izolace CD8 T-lymfocytů/NK buněk pacienta a kontroly 2. Aktivace in vitro pomocí polyklonální stimulace (PHA) + namnožení (IL-2)  efektorové buňky 3. Příprava cílových buněk – označení nádorových buněk pomocí radioaktivně značeného 51Cr 4. Smíchání konstantního množství cílových a efektorových buněk  pokud je systém granzym/perforin funkční, dojde k apoptóze rakovinných buněk a 51Cr se uvolní do supernatantu 5. Měření gama záření v supernatantu Cytotoxický test - uplatnění • Diagnostika familiární hemofagocytující lymfohistiocytózy (HLH) • Nejčastější příčina - mutace v genu pro perforin • CD8 T-lymfocyty a NK buňky nejsou schopny cytotoxicky likvidovat virem napadené buňky, ale mají zachovalou schopnost aktivace, proliferace a produkce cytokinů • Virová infekce – nejčastěji EBV  nadměrná produkce INF-δ  aktivace makrofágů  nadměrná proliferace a produkce IL-6, IL-1, TNF cytokinová bouře  horečka, splenomegalie, hemofagocytóza v kostní dřeni • Test cytotoxicity – výrazné snížení/absence schopnosti cytotoxicky likvidovat cílové buňky • Léčba – transplantace KD • Expresi perforinu lze vyšetřit i pomocí průtokové cytometrie – intracelulární detekce pomocí fluorochromem značené monoklonální Ab proti perforinu Makrofágy v KD s pohlcenými RBC, jádry buněk a trombocyty Cytotoxický test - uplatnění Zdroj: M.Suková et al. Hemofagovytující lymfohistiocytóza; Vnitřní lékařství, 2010, č.2, s. 25457-25169 Detekce perforinu v CD8/NK buňkách pomocí průtokové cytometrie: • Nejprve je nutné buňky fixovat (4% formaldehyd) a perforovat buněčnou membránu (saponin, triton X-100) • Poté protilátka značená fluorochromem pronikne skrze membránu a naváže se na perforin intracelulárně (v granulích) ELISPOT a FLUOROSPOT • Sledování produkce cytokinů T-lymfocyty a cytokinů a protilátek B-lymfocyty • Analýza na úrovni 1 buňky • Princip: • Stimulace izolovaných buněk • Nasazení buněk do ELISPOT destičky, její dno je pokryto protilátkou proti hledanému analytu • Buňka produkuje cytokin  jeho zachycení protilátkou v bezprostředním okolí buňky • Detekce cytokinu pomocí detekční protilátky značené: • U ELISPOTU enzymem  substrát  barevný produkt na dně membrány (spoty) • U FLUOROSPOTU fluorochrom  osvit excitačním zářením  světelná emise (svítící spoty na černém pozadí) ELISPOT 5 x 105 2,5 x 105 1,25 x 105 0,63 x 105 7 dní po očkovaní TNFR2B cells TNFR2+ B cells Produkcia IL-10 B lymfocytmi Využití ELISPOTu/FLUOROSPOTu Doplňková diagnostika protilátkových imunodeficitů: • CVID  pacienti přijímají intravenózní Ig  při rutinním nefelometrickém stanovení měříme hladinu Ig z infuze, ne jejich vlastní Ig • Nevíme, zda a kolik Ig tvoří samotné B-lymfocyty pacientů (např. jsou schopni pacienti reagovat na vakcinaci?) • Vakcinace pacientů/izolace B-lymfocytů a stimulace in vitro  nasazení B-lymfocytů na ELISPOT • Sledování odpovědi na úrovni 1 buňky Kontrola Pacient CVID Pacient CVID vakcinován tetanickým toxoidem  sledování produkce specifických protilátek ve třídě IgG po 14 dnech od vakcinace X-vázaný Hyper-IgM syndrom Defekt CD40L • Příčina – mutace v genu pro CD40L  deficit  selhává izotypový přesmyk v B-lymfocytech, tvoří se pouze IgM • Klinický obraz: • Od časného dětství recidivující respirační infekce (oportunní patogeny - Pneumocystis jiroveci, CMV, mykobakteria) • Chronické průjmy (kryptosporidiová infekce) • Neutropenie • Zvýšené riziko malignit • Diagnostika: • Nefelometrie – vyšetření hladin IgG, IgA, IgE (snížené), IgM (norma, zvýšené) • Průtoková cytometrie – B lymfocyty - většina je naivních, paměťové formy téměř chybí • Průtoková cytometrie – stanovení exprese CD40L na CD4 T-lymfocytech • Genetické vyšetření – potvrzení mutace v genu pro CD40L • Léčba – intravenózní imunoglobuliny Stanovení upregulace CD40L na T-lymfocytech diagnostika X-vázaného hyper-IgM syndromu Provedení: 1. Izolace PBMC 2. Stimulace lymfocytů pomocí PMA+ionomycin (4 h, 37 stupňů, 5 % CO2)  lymfocyty se aktivují a zvyšují expresi CD40L (CD154) na svém povrchu 3. Označení lymfocytů pomocí monoklonálních protilátek (anti-CD3, CD8, CD25, CD69, CD40L) 4. Promytí 5. Měření na průtokovém cytometru Interpretace: • Negativní kontrola -nestim.bb. - modrá – nízký signál, pík vlevo – v pořádku) • Zdravá kontrola po stimulaci CD40L navýšila • Pacient po stimulaci CD40L nezvýšil (srovnatelný s negat. Kontrolou) • Matka pacienta – dvojí populace lymfocytů – jedna populace CD40L po stimulaci zvýšila, druhá ne  matka je přenašečkou mutace (X chromozom  postiženi muži) Protokol • Z naměřené koncentrace buněk spočítejte, jak si PBMC naředíte v RPMI médiu tak, aby v 1 jamce mikrotitrační destičky bylo 200.000 buněk v objemu 190ul • Celkem potřebujeme 5 jamek • Jak naředíte stimulancia PHA (zásobní roztok 1mg/ml) a ConA (zásobní roztok 1mg/ml) aby v jamce destičky byla koncentrace: • PHA: 5ug/ml • ConA: 2ug/ml • V jamce máme již 190ul buněk  počítejte tak, aby konečný objem v jamce i se stimulancii byl 200ul