Elektroforetické techniky David Zeman 2022 Pojmy a definice • Elektroforéza = pohyb nabitých částic v elektrickém poli; 3 základní techniky: • Zónová elektroforéza: homogenní pufrovací systém - konstantní pH; migrační vzdálenosti během definované doby dělení odpovídají elektroforetickým mobilitám dělených látek; lze aplikovat na neamfoterní i amfoterní molekuly; difúze snižuje senzitivitu detekce i rozlišení • Izotachoforéza (ITP): dělení v diskontinuálním systému pufrů, ionizovaný vzorek migruje mezi vedoucím elektrolytem s vysokou mobilitou a terminálním elektrolytem s nízkou mobilitou; lze dělit buď pouze kationty, nebo pouze anionty (ne obojí současně); všechny složky směsi se pohybují stejnou rychlostí; složky směsi jsou rozdělené podle svých elektroforetických mobilit • Izoelektrická fokusace (IEF): dělení v gradientu pH, lze použít pouze pro amfoterní látky řpeptidy a bílkoviny); molekuly migruji do svých izoelektrických bodů; samozaostřující (fokusacní) efekt brání difúzi • Kapilární elektroforéza (capillary electrophoresis, CE) Teoretické základy elektroforetických metod • P e = q • E ( q = z ■ e ) • Ffr = f c ' V • V rovnováze: Fe — Ffr q-E = fc-v v = — = u • E fc u je mobilita neboli elektroforetická pohyblivost nabité částice, tj. rychlost jejího pohybu v elektrickém poli o jednotkové intenzitě. Je to veličina charakteristická pro danou látku. V průběhu separace se dostávají dopředu nabité částice, Které mají větší pohyblivost, a opožďují se částice s menší pohyblivostí. Tím dochází k oddělení složek směsi. Elektroforetická pohyblivost částice u • Pro kulovitou částici platí: q z - e fc 6n • r\ • r • Peptidy a proteiny však nejsou kulovité. Mobilita uje u nich nepřímo úměrná molekulové hmotnosti podle vztahu — q (exponent ve jmenovateli je udáván různě mezi 1/3 a 2/3) U slabých kyselin a zásad je pro rychlost migrace rozhodující efektivní mobilita uef daná vztahem i Kde a, je stupeň disociace. Ten lze ovlivnit vhodnou volbou pH elektrolytu. nstrumentace - 3 základní komponenty: • Zdroj stejnosměrného napětí • Chlazení (termostat) • Elektroforetická vana/deska • Uspořádání - horizontální - vertikální Elektroforetické komory dle uspořádání vertikální • Gely ve skleněných trubičkách nebo mezi skleněnými deskami obklopeny pufrem • Vzorky se dávkují shora (aplikační jamky vytvořené pomocí hřebínků) horizontální • Gely na inertních fóliích, povrch není uzavřený • Vzorky se pipetují přímo do aplikačních jamek nebo do aplikátorů (event. na proužky filtračního papíru) • Na gel se aplikují proužky filtračního papíru s koncentrovaným pufrem • Lze použít tenčí gely na fóliích, které lze účinněji chladit než vertikální gely - rychlejší dělení s ostřejšími zónami Srovnání vertikálních a horizontálních systémů vertikální • Lze použít gely větší tloušťky, proto lze aplikovat větší množství vzorku • Chlazení z obou stran • Snazší blotting z gelů o větší tloušťce • Lze separovat paralelně na více gelech • Komplikovaná aplikace vzorku u tenčích gelů • Nevhodné pro IEF horizontální • Nelze použít gely větší tloušťky, protože je lze chladit jen zespodu • Lze separovat jen na 1 gelu/přístroj • Univerzální pro nejrůznější metody, ideální pro IEF • Stripy nasycené pufrem místo velkých objemů tekutých pufrů • Snadný provoz a čištění • Vyšší elektrická bezpečnost Průběh vertikální elektroforézy (Mini-PROTEAN Tetra Cell systém, Bio-Rad) začátek - aplikace obarvených vzorků do jamek v průběhu separace migruje k anodě nejrychleji barvivo Průběh vertikální elektroforézy Když barvivo doputuje k anodickému konci gelu, separaci zastavíme. Gel vyjmeme a barvíme. Stanovení fenotypu haptoglobinu v 7,5% polyakrylamidovém gelu (Mini-PROTEAN TGX Precast Gel, Bio- Rad), 150 V, 2,5 hod Horizontální elektroforéza SDS elfo v polyakrylamidovém gelu, aplikace obarvených vzorků ke katodě, elektrody položeny na katodickém (bezbarvém) a anodickém (modrém) gelovém stripu. V průběhu elektroforézy migruje bromfenolová modř (BPB), která je součástí vzorkového pufru, těsně před SDS. Když je BPB kompletně v anodovém stripu, separaci ukončíme. (Lépe: použít předobarvenou sadu markerů molekulové hmotnosti - když je marker 10 kDa těsně před anodovým stripem, STOP.) Zónová elektroforéza • Nativní - dělení bílkovin podle náboje, v gelech se sítovým efektem přistupuje faktor velikosti a tvaru molekuly • SDS-elektroforéza- dělení bílkovin podle velikosti molekuly (SDS = dodecylsíran sodný-váže se na bílkoviny v poměru 1,4 g SDS na 1 § bílkoviny, uděluje jim negativní naboj - všechny bílkoviny migrují k anodě, malé molekuly rychleji, velké molekuly pomaleji); v redukujícím prostředí (beta2-merkaptoethanol, dithiothreitol) se bílkoviny rozpadají na podjednotky a z SDS elfo lze dobře odhadnout M.h. • Kontinuální uspořádání - 1 gel, 1 puf r • Diskontinuální uspořádání (Ornstein a Davis, 1964) -koncentrace vzorku na startu pomocí koncentrujícíno gelu na izotachoforetickém principu - zlepšení rozlišení Zaostřující („stacking") gel má větší póry a obsahuje 0,125 mol/L Tris-HCI puf r o pH 6,8 Separačnígel s malými póry obsahuje 0,375 mol/L Tris-HCI pufr o pH 8,8 Elektrodový pufr obsahuje pouze glycin (pl 6,7 - při pH 6,8 téměř nenabity - nízká pohyblivost) V zaostřujícím gelu migrují bílkoviny na izotachofortetickém principu v pořadí podle svých mobilit. Na hranici se separačním gelem se prudce zvýší odpor pro velké molekuly bílkovin, glycin získá záporný naboj a „přeskočí"proteiny, které se v separačním gelu dělí podle náboje a velikosti Pozn.: pro bílkoviny s pl >7 je nutné použít jiný pufrový systém Média pro zónovou elektroforézu • Papír • Škrob • Acetylcelulóza • Agar • Agaróza • Polyakrylamid Agaróza (vlevo) a polyakrylamid (vpravo - znázorněn princip přípravy z a kry lam id u a N, AT- methylenbisakrylamidu) OH OH H' CH, 9 CWJ S h ■ i ^—Cm ■i' w ■ CH .ynnírn um F+r;J.i»atí TEMED —CM—CHj— CH—CHj— CK—CHj—ÍW—Qri — Ml MH, Výhody a nevýhody agarózových a polyakrylamidových gelů Agarózový gel Polyakrylamidový gel Výhody Netoxické Jednoduchá příprava Ideální pro dělení vysokomolekulárních bílkovin (>500 kDa) Velké póry (150 nm u 1% agarózy) - do nich mohou difundovat imunoglobuliny, proto je možný specifický průkaz bílkovin přímo v gelu pomocí imunofixace Velmi stabilní a průhledné Téměř žádná elektroendoosmóza Dobrý sítový efekt (malé póry - 5,3 nm v gelu s 5% T a 3% C; 3,3 nm v gelu s 20% T a 3% C)) Jednoduchá manipulace s gelem po separaci Vhodné pro řadu barvicích metod Nevýhody Vždy přítomna určitá elektroendoosmóza Malý sítový efekt pro bílkoviny o M.h. <100 kDa Nejsou zcela průhledné Některá barvení (např. stříbření) jsou obtížně proveditelná (dochází k silnému zbarvení pozadí) Monomery jsou toxické Velikost pórů limituje velikost molekul, které lze dělit (proteiny o M.h. >800 kDa nevstoupí do gelu) Zásadité gely mohou být skladovány jen krátkou dobu (časem dochází k jejich hydrolýze) Detekce separovaných bílkovin • V gelu: • Fixace (chemicky - např. 20% TCA, teplem -sušení gelu - denaturace proteinů, zamezení difúze; použitím specifického antiséra s následným odmytím ostatních bílkovin) • Barvení: - Coomassie Blue - Amidočerň - Kyselá violeť - Stříbření - Fluorescenční barvení (např. SYPRO Ruby) Po od mytí přebytku barviva se gel suší. Elf q bílkovin séra - postup heslovitě: MIGRACE -SUŠENI - BARVENI - ODBARVENÍ - SUŠENÍ • Na membráně (nitrocel u lóžové, PVDF) po přenosu proteinů z gelu („western blotting") - Možnost imunodetekce s chromogenní, fluorescenční nebo chemiluminiscenční koncovkou (protilátka značená peroxidasou -> přídavek substrátu - bezbarvého chromogenu, který se v přítomnosti H202 oxiduje na barevný produkt, který musí být nerozpustný (např. diaminobenzidin; nebo: oxidace luminolu -> luminiscence) Izotachoforéza řecky isos = stejný, tachos = rychlost • Všechny ionty migrují stejnou rychlostí • Složky směsi jsou rozděleny v „iontovém vlaku'' • Samozaostřovací efekt • Efekt regulující koncentraci (Kohlrauschova regulační funkce): °A °L V>l(va+Vq) kde Ca = koncentrace analytu; cL = koncentrace vedoucího elektrolytu; /i = pohyblivost (mobilita) analytu (A), vedoucího elektrolytu (L) resp. protiiontu (Q) • Předpokladem ITP separace je diskontinuální pufrovací systém s vedoucím (leading, L) a terminačním (terminating, T) elektrolytem • U běžnější separace aniontů je L (příklad: Cl) na anodické a T (příklad: Gly) na katodické straně. Protiion je společný (příklad: Tris+) Izoelektricka fokusace (IEF) Focusing chamber pH 3456769 10 coon /< rJ»i coon r^/pf J£Sax* co^moh ^^-W Cathode H (+2) (0) (-2) Met charge Izoelektrická fokusace • Dělení amfoterních látek (peptidů, proteinů) podle jejich izoelektrického bodu Apl = rozlišovací schopnost D = difúzni koeficient bílkoviny E = síla elektrického pole (V/cm) d(pH)/dx = pH gradient du/d(pH) = směrnice mobility bílkoviny v izoelektrickém bodu Způsoby provedení IEF podle účelu • ANALYTICKÁ IEF (pro analýzu peptidů a proteinů) • agarózovýgel • polyakrylamidový gel - s nosičovými amfolyty (oligoamino-oligokarboxylové kyseliny) - s imobilizovaným pH gradientem (bifunkční /nikoliv amfoterní!/ akrylamidové deriváty s pufrující skupinou /karboxyskupina nebo terc. amin/ navázanou na dusík aminoskupiny) • PREPARATIVNÍ IEF (cílem je získat relevantní množství daného peptidu/proteinu po jeho separaci ze směsi) • Dextranový gel s nosičovými amfolyty • Izoelektrické membrány (polyakrylamid s Imobiliny - každá membrána má příslušnou hodnotu pH) • Off-gel IEF: na IPG - proužcích (frakcionační rámeček s 24 komůrkami se přiloží na povrch IPG proužku) IPG-gely získáme při nalévání gelu kontinuální změnou mísícího poměru Immobilinů (podobně jako při nalévání gelu s gradientem velikosti pórů) - principem je acidobazická titrace, aktuální hodnota pH je definována Henderson-Hasselbachovou rovnicí: Je-li pufrujícím Immobilinem zásada: pH = pKB + log- CA • Je-li pufrujícím Immobilinem kyselina: CB pH = pKA + log--— CA ~ CB Nábojové vlastnosti AK a bílkovin • Při pH < pl jsou kationty • Při pH = pl jsou amfolyty navenek elektroneutrální • Při pH > pl jsou anionty • Disociační konstanty Kx a K2 jsou vyjadřovány logaritmicky jako pK = pH, při kterém se v roztoku nacházejí stejná množství protonovaných (asociovaných) a ne proton ováných (disociovaných) forem • pl = izoelektrický bod = pH, při které molekula existuje jako amfolyt s nulovým výsledným nábojem • pl = Yz [pKx + pK2]; u AK s ionizovatelnou skupinou v postranním řetězci uvažujeme hodnoty pK „na obě strany" od elektroneutrálního zwitteriontu (pl leží mezi hodnotami pK zwitteriontu a jeho konjugované kyseliny) • Při fyziologickém pH je většina bílkovin záporně nabitá Analýza titračních křivek: gel s amfolyty - po lEF (vytvoření pH gradientu) otočíme gel o 90° a do žlábku naneseme analyzované bílkoviny, necháme probíhat elektroforézu. Kde je pl hledané bílkoviny? obr. z: Westermeier R. Electrophoresis in practice. Wiley-VCH, Weinheim 2005 Vysokorozlišovací dvourozměrná elektroforéza • 1. krok: IEF na IPG-proužcích • 2. krok: SDS-PAGE Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) • je analytická a preparativní technika • metoda je schopná účinně separovat komplexní směsi bílkovin. • 2-DE je klíčovou technikou proteomiky Poprvé byla popsána již v r. 1975 (O'Farrellem a Klosem), rozšířena byla až s rozvojem proteomiky v posledních letech. Proteomika je obor, který se zabývá globálním hodnocením exprese genetické informace na úrovni bílkovin (proteomem), rovněž však zkoumá strukturu a interakce proteinů. Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) Podstatou 2-DE je využití dvou odlišných fyzikálně chemických vlastností proteinů: • v prvním rozměru jsou proteiny rozděleny podle jejich izoelektrického bodu (pl) - pomocí izoelektrické fokusace (IFE) •v druhém rozměru se proteiny dělí v závislosti na jejich molekulové hmotnosti použitím elektroforézy v polyakrylamidovém gelu a SDS (SDS -PAGE). First dimension Second dimension Isoelectric Gel rod rebuffered SDS Polyacrylamide focusing in SDS buffer Qel electrophoresis Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) Vizualizace: barvení 2-DE gelů • proteiny jsou vizualizovány některou z barvících či značících metod (chemických nebo radioaktivních). • Výsledné "mapy" proteinů lze porovnávat např. mezi experimentálním a kontrolním vzorkem nebo mezi vzorky odebranými od pacientů s konkrétním onemocněním oproti zdravým kontrolám a identifikovat tak odlišně exprimované proteiny, které mohou mít souvislost s patogenezí daného onemocnění. • Proto je třeba ověřit identitu těchto odlišně exprimovaných proteinů, nejčastěji pomocí "vyříznutí" oblasti gelu vykazující odlišnost a její následné analýzy pomocí hmotnostní spektrometrie. Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) IZOELEKTRJCKÁ FOKUSACE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Komerčně dostupné elektroforetické systémy pro použití v klinické laboratorní diagnostice • Firma Sebia (založena 1967, • Firma Helena Laboratories nadřízená organizace: Montagu (založena 1966) Private Equity) . www.helena.com • www.sebia.com Elektroforetický přístroj Hydrasys2 (Sebia) - pro elektroforézu a izoelektrickou fokusaci Phast System™ t (GE Healthca Multiphorll t (GE Healthcare) s vysokovoltážním zdrojem, chlazený vodovodní vodou (nevhodné!) Elektroforetický přístroj Multiphor II t (uprostřed) se zdrojem (vpravo) a termostatickým cirkulátorem MultiTemp III (vlevo) Elektroforetický přístroj Flatbed Professional (EDC, uprostřed) se zdrojem (Consort, vlevo) a termostatickým cirkulátorem (Huber, vpravo) Hodnocení elektroforeogramů („elektroferogramů") v gelech a na membránách • Převod signálu na digitální signál - Denzitometry (mobilní fotometry - viz dále; výsledný záznam = diagram s píky - denzitogram; plochy pod píky mohou byt kvantifikovány - např. detekce zón albuminu, al-, a2-, (31-, (32-, y-globulinů při elektroforéze sérových bílkovin - Videokamery (pro viditelné a UV světlo; chlazené CCD kamery mají velmi vysoké rozlišeni; výhoda: možnost akumulace signálu po určitou dobu -detekce slabých signálů) - Stolní scannery (levnější než denzitometry, rychlé, vysoké rozlišení, mohou skenovat v transmitancním i reflektančním módu) - Výsledky jsou zpracovány počítačově s pomocí vhodného softwaru -kvantitativně/kvalitativně Denzitometrie Kvantitativní hodnocení intenzity zbarvení Měření absorpce světla jednotlivými zónami (pásy) Pohyblivý světelný zdroj jlaser nebo lampa s bílým světlem s filtry) je veden nad gelem a na každém miste gelu je měřena a počítačově zpracována absorpce U jednorozměrných gelů získáváme křivku extinkce In L/1 (lQ= intenzita světla ze zdroje, I = intenzita měřená detektorem) podél elektroforetické stopy; u dvourozměrných gelů je extinkce zobrazena jako funkce povrchu gelu Neplatí zde Lambertův-Beerův zákon! (proč?) Závislost absorpce na koncentraci bílkoviny při extinkci >2,5 (lampa s bílým světlem) nebo >4 (laser) se stává hyperbolická nebo sigmoidní Slabé pásy/stopy jsou často nadhodnocené, proteiny ve vysoké koncentraci podhodnocené Denzitometrie Vyhodnocení elektroforeogramů - detekce a kvantifikace • Při denzitometrii se měří intenzita záření procházejícího průhlednou plochou, získává se grafický záznam foto metrová néh o úseku. • Jednotlivé frakce dělené směsi tvoří na záznamu v ideálním případě souměrné křivky zvonovitého tvaru. • Plocha po křivkou těchto píků připadající jednotlivým frakcím, je úměrná relativnímu zastoupení jednotlivých frakcí v dělené směsi • doporučené jednotky (ČSKB): jedniny (př. al globuliny=0,03) • používají se % (př. al globuliny=3%) • přepočet na g/L z S-CB Vyhodnocení elektroforeogramů - detekce a kvantifikace • Elektroforeogram se automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky (400 - 700 nm), v místě frakcí dochází k částečné absorpci záření - to se projeví při dopadu na detektor. • Po zpracování signálu integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých frakcí. Barva Amax [nml Arnidočerň 10B 620 Coornassie Brilant Biu R-250 590 Coornassie Brilant Biu G-250 595 Fast Green 610 Acid violet Alcian Biu 630 Basic Fuschin 550 Methyl Green 635 Ethidiurn Bromide (Fluo rirnetrická detekce) Brorncresol Green Methylene Blue 665 Pyrinin Y 510 Toluidine Biu O 620 Denzitometrické vyhodnocení Normální nález „M" gradient Metody pro kvantifikaci M-komponenty • Odečet z elektroforézy - „Perpendicular drop": ohraničení kolmicemi k ose x v místech, kde M-komponenta „nasedá" na polyklonální pozadí - „Corrected perpendicular drop": ohraničení kolmicemi k ose x, v případě polyklonálního pozadí se pokoušíme toto pozadí kompenzovat zúžením měřené oblasti (velmi subjektivní) - „Tangent skimming": ohraničení M-komponenty zdola úsečkou spojující body, kde M-komponenta „nasedá" na polyklonální pozadí Další možností je odečet z kapilární elektroforézy po imunosubtrakci - zatím nelze používat v rutinní praxi Kvantifikace M-komponenty: 3 používané metody elektroforeogramy z kapilární elektroforézy Keren DF, Schröder L. Clin Chem Lab Med 2016 Albumin Total protein: 7.8 A'<3: 0.81 Fractions % g/dL AA g/dL (6.0-9.3] Ref. g/dL Albumin Ii, 4 L M-Spike 44.9 4.7 13.D 9.5 27.9 ie.a 3.50 0,37 1.01 0.74 2.18 1.47 3.43-4.84 0.21-0.44 0,54-0.97 0.65-1.03 0.70-1.47 Albumin ToteI protein: 7,6 g/dL (6.0-&3) A/G: 0.81 Fractions % g/dL Ref. g/dL Total p rotei n: 7, S g/dL (6.0-8.3) A/G10.B1 Fractions % g/cfL Ref. g/dL Albumin Dt, ár, M-Spike 44.9 4.7 13.0 27.9 14.8 3.50 0.37 1.01 0.74 2.18 1.15 3.43^t.84 0.21-0,44 0.54-0.97 0.65-1,03 0.70-1.47 Albumin Čt M-Spike 44.9 4.7 13.0 9.5 27.9 12.2 3.50 0.37 1.01 0.74 2.1 H 0.95 3.43-4.84 021-0,44 0.54-0,97 0.65-1,03 0.70-1.47 Kvantifikace M-komponenty vlevo: perpendicular drop vpravo: tangent skimming sebia Sample *: \ Depart: Date:7/9/2Q22 ID: S/9/1465 MÉM Serum protein electrophoresis Alpha 1 Alpha 2 Beta 1 Betas 34,94 1,91 7A3 *A2 2,24 3,66 A/G Ratio :1,7B ID: 6/9/146S Serum protein electrophoresis Fractions 1,0 - 2,6 1,91 Alpha 2 L3..& > 7,2 - 11,6 7,43 Betal 8,1 5,6- S,i 4,42 Beta 2 4,1 2,2 - 5,7 2,24 Signature Signatare 28 Kvantifikace monoklonální komponenty vlevo: ohraničení kolmicemi k ose x (^perpendicular drop"): 4,2 g/L vpravo: ohraničení zdola úsečkou mezi body, kde M-pík nasedá na polyklonální pozadí („tangent skimming"): 1,6 g/L Ohraničení monoklonální komponenty - problém polyklonálního pozadí vlevo: ohraničení kolmicemi k ose x (^perpendicular drop"): 3,7 g/L vpravo: ohraničení zdola úsečkou mezi body, kde M-pík nasedá na polyklonální pozadí („tangent skimming"): 0,6 g/L M-komponenta v p2 frakci vlevo: perpendicular drop (26,1 g/L) vpravo: tangent skimming (21,0 g/L) - pro paraproteiny migrující v (3 frakci se nedoporučuje sebia sebfa Sample #: 7 Date:7/9/2022 ID: 6/9/14E9 Sample #: 7 Date:7/9/Z022 Serum protein electrophoresis Fractions % Ref. % Cone Ref. Cone. Albumin 48,2 < 60,3 - 72,6 44,34 Alpha 1 1,8 1,0 - 2,6 1,66 Alpha 2 7,9 7,2- 11,8 7,27 Beta 1 6,4 5,6 - 9,1 5,89 Beta 2 31,4 > 2,2 ■ 5,7 28,89 Gamma 4,3 < 6,2-15,4 3,96 Serum protein electrophoresis Alpha 1 Alpha 2 Beta 1 A/G Ratio:0,93 Signature Signature Clavijo A et al. Lab Med 2020 Automatizované (Helena SPIFE Touch) vs. manuální vyhodnocení M komponenty Figure 1 Serum protein electrophoresis and densitometric scanning: A, Low-level, broad-based monoclonal immunoglobulin Lab Med, Volume 51, Issue 3, May 2020, Pages 252-258, https://doi.orE/10.1093/labmed/lmz055 The content of this slide may be subject to copyright: please see the slide notes for details. C\ OXFORD 7 UNIVERSITY PSESS Elektroforetické metody v klinické laboratoři Elektroforéza bílkovin séra a moče (agaróza, CE) - zejména screening monoklonálních gamapati Imunofixační elektroforéza bílkovin séra a moče jagaróza) NEBO imunosubtrakční elektroforéza (CE) - typizace monoklonálních imunoglobulinů (paraproteinů) SDS elektroforéza bílkovin moče - diferenciální diagnostika proteinurií (glomerulární, tubulární, postrenální) Elektroforéza hemoglobinů - detekce abnormních hemoglobinů Elektroforéza izoforem některých enzymů-ALP, LDH, CK Elektroforéza lipoproteinů Izoelektrická fokusace - detekce oligoklonálních pásů (zejm. IgG) v likvoru u chronických zánětlivých onemocnění CNS (zejm. roztroušené sklerózy); fenotypizace alfal-antitrypsinu Elektroforéza nebo izoelektrická fokusace s detekcí izoforem transferinu (průkaz likvoru v sekretech - v likvoru je přítomna kompletně desialovaná frakce, tzv. (32-transferin neboli asialotransferin; CE pro relativní kvantifikaci CDT-disialofrakce, popr. s mono- a asialofrakcí) Elektroforéza bílkovin se provádí s cílem zjistit abnormality bílkovin krevního séra. HP Bílkoviny jsou rozděleny podle svých elektroforetických pohyblivostí do skupin (frakcí), které vytvářejí charakteristický obrazec. (U Změny v tomto obrazci souvisí s různými druhy onemocnění nebo s různými patologickými stavy. Bílkoviny se dělí na 5 - 6 hlavních frakcí: + Albumin 56 - 66 % + al globulíny 2 - 3 % + a2 globulíny 8-12 % + P globulíny (pl, p 2) 7-10 % + y globulíny 10 -18 % Typ: Nosič: Nanášení: Denaturace: Barvení: Odbarvení: Hodnocení: Poznámka: ELFO na papíře chromatografický papír mikroskop, podložní sklo tepelná amidočerň 10B zředěná kyselina octová fotometrický dlouhá doba dělení První typ elektroforézy používaný v klinické praxi Elektroforéza na papírovém nosiči 4-Albumin ■ ^-Atfal globulíny <_Alfa2 globulíny <- Beta globulíny <- Gama globulíny Typ: ELFO na agaru Nosič: agaróza + agaropektin Nanášení: papír, hřeben, fólie Denaturace: kyselina octová Barvení: anionická barviva Odbarvení: kyselina octová Hodnocení: vizuálně Poznámka: elektroendoosmóza Typ: ELFO na agaróze Nosič: agaróza Nanášení: hřeben, fólie Denaturace: kyselina pikrová Barvení: anionická barviva Odbarvení: kyselina octová Hodnocení: vizuálně nebo denzitometricky Poznámka: automatizace HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 oif^'^ Sefaia -1 ^ 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 ťTl Agaróza Agaróza je polysacharid z mořských řas. ^ Jde o lineární polymer galaktózy a 3,6 - a n hyd roga laktózy. ^ Rozpouští se v horké vodě a po ochlazení tuhne. Tvoří dvoušroubovice ve svazcích, které se spojují do trojrozměrné struktury. Vodíkové vazby. ^ Vysoké koncentrace agarózy generují gel s malými póry a naopak. 1% gel má póry 150 nm. Agarózový gel má větší póry než PAG - větší molekuly snadněji putují v agaróze. Přítomnost reziduálních nábojů generuje elektroendoosmózu (použít extrémně čistou) Typ: ELFO na acetylcelulóze Nosič: acetylcelulóza (výroba esterifikací celulózy směsí acetanhydridu a kyseliny octové) Nanášení: speciální tiskátko Denaturace: kyselina trichloroctová Barvení: anionická barviva Odbarvení: směs - methanol + kyselina octová Hodnocení: denzitometricky (po zprůhlednění) Poznámka: dovozové fólie Zprůhledňovací směs: Methanol s ledovou kyselinou octovou Cyklohexanol Typ: ELFO na polyakrylamidu H II H2C=C^C- NH2 + V CH- O H II ^C—C NH 'CH Acrylamide Methylenebisacrylamide persulfate s2ty 2 SO, CONH. CONH CH2—CH—CH2—CH 2 CH- sulfate free radical CH- I CONH CH. CONH —CH2—CH—CH2—CH—CH2—CH- CONH, CONH- Polyakrylamidový gel Tvořen polymerací akrylamidu a N,N'-methylenbisakrylamidu v pufru, zahájenou volnými radikály. Ty vzniknou při rozkladu persíranu amonného nebo při rozložení riboflavinu v přítomnosti 02. Fyzikální vlastnosti gelu a velikost pórů dány podílem polyakrylamidu v gelu a stupněm zesíťování. D Nejčastěji používané koncentrace polyakrylamidu jsou 5-10%. D Koncentrace N,N'-methylenbisakrylamidu je obvykle 3-5% celkového množství akrylamidu. D Podpůrná matrice je prakticky nenabita. barvičky: Amidočerň 10 B, Coomassie Brilliant Blue, Ponceau S, Bromfenolová modř, Kyselá violeť, barvení stříbrem (není kvantitativní, ale je 50x citlivější než coomassie: Ag+ ionty se v proteinech vážou na -SH a -COOH skupiny) Coomassie Brilliant Blue R-250 Coomassie Violet R -150 1 2 34 5 6 789 10 11 12 1. prealbumin 8. Transferin 2. albumin 9. Beta-lipoprotein 3. a-lipoprotein, a-fetoprotein 10. C3 4. AlAT,orosomukoid 11. IgAJgM, fibrinogen, „M", VLR 5. a1antichymotrypsin/ Gc 12. IgG, CRP^^M", VLR globulin 6. A2M,Hp 7. hemoglobin Bílkoviny, které reálně ovlivňují tvar a intenzitu zón elektroforeogramu sérových bílkovin zóna Bílkoviny podílející se na tvaru zóny Referenční meze (pro kity Hydragel ßl-ß2 firmy Sebia) albumin Albumin 60,3 - 72,8 % al-globuliny al-antitrypsin 1,0 - 2,6 % a2-globuliny a2-makroglobulin, haptoglobin 7,2-11,8% ßl-globuliny Transferin (+Hb u hemolyzovaných vzorků) 5,6-9,1% ß2-globuliny C3 (+ IgA) 2,2-5,7% y-globuliny IgG (+ IgM) 6,2-15,4% Elektroforéza bílkovin séra (pozice 2, 5,7,9-11,13-16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30) a moče (pozice 1, 3,4, 6, 8,12, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29) - Hydragel 01-02 15/30 (Sebia) Paraprotein v pozicích 6 (moč), 16 (sérum), 20 (sérum), 22 (sérum), 23 (moč), 24 (sérum), 25 (moč - v beta frakci), 28 (sérum) a 30 (sérum); v sérech na pozicích 20, 22, 28 a 30 je patrná výrazná redukce polyklonálních gamaglobulinů; zvýšená frakce alfa2-globulinů v pozicích 2,10, 24, 30 (séra) K 4 b S ' v 5 10 tl 1» 13 14 IS ■l Elektroforéza bílkovin séra (pozice 1, 3, S, 7, 9,11,13,15,17,19, 21, 23, 25, 26, 28, 30) a moče (pozice 2, 4, 6, 8, 10,12,14,16,18, 20, 22, 24, 27, 29) - Hydragel pl-p2 15/30 (Sebia) Paraproteiny v pozicích 1, 3, 7, 9,11,13,15,19, 23, 26 a 28 v gama zóně, v pozici 21 v beta2 zóně. V pozici 9 je silně hemolytický vzorek s patrným zastřením alfa2-betal interzóny Hb-Hp komplexy, v této interzóně linie imitující paraprotein; výrazné zesílení betal-zóny volným hemoglobinem může rovněž mylně imponovat jako paraprotein Date 1, v séru <1; poměr A/D v sekretu s příměsí likvoru je vyšší než v séru. Elektroforéza hemoglobinu Hydragel 7 Hemoglobin(e), Sebia vzorky 1 a 2: frakce HbA2 > 15%, což značí pravděpodobnou přítomnost HbC nebo HbE vzorky 3-6: normální nález vzorek 7: kontrola 7 HEMOGLOBIN( E) 1 2 3 4 S S sebia Elektroforéza izoenzymů alkalické fosfatasy (Hydragel 15 ISO-PAL, Sebia) v pozicích 2, 4, 6,... je kostní izoenzym vyvázán přítomným lektinem blízko startu v pozicích 3, 4 je patrná střevní frakce (I) v pozicích 11,12 je výrazná druhá jaterní frakce (L2) \£- A iífi 15 iso-pAL sebte 6 7 B 9 10 11 12 13 14 15 I SDS-elfo vzorky smíchány s SDS (sodium dodecyl sulfáte - laurylsíran sodný), který se váže na bílkoviny za tvorby negativně nabitých micel (v poměru 1,4 g SDS na 1 g bílkoviny). Často se používají denaturační podmínky (inkubace vzorků s p-ME nebo DTT, zahřátí - redukce disulfídových vazeb). SDS (0,1%) je i v gelu (zprav. polyakrylamidovém). Mezi log M a relativní pohyblivostí bílkoviny je pak v určitém rozsahu M přibližně lineární vztah. Obr.: Monomery a dimeryfLQ SDS-PAGE v neredukujfcfch podmínkách/AIB, chemiluminiscenčnf detekce (2018) IEF/AIB: typizace LŘ v Ig jako pomoc v diagnostice nemoci těžkých řetězců Kušnierová et al. Klín Onkol 2020; 33(4): 280-5 SDS elfo jako pomoc v diagnostice nemoci těžkých řetězců Kušnierová et al. Klin Onkol 2020; 33(4): 280-5 m ■ - mm b Sir F SI S2 S3 S4 MfK MfL Sir F SI S2 S3 S4 MfK MfL F Sir F SI S2 S3 S4 MfK MfL Detekce multimerů vWF (SDS elfo v agarose, Sebia) • Multimery vWF jsou sníženy nebo chybí u některých případů von Willebrandovy nemoci (typ ii) • Na obr. vlevo nálezy bez hrubé patologie; vysokomolekulárni formy v gelu dole (migrují nejpomaleji) Co+ Co- Cl SI C2 S2 C3 S3 C4 S4 C5 S5 C6 S6 C7 S7 C8 S8 I Co+ Co- Cl SI C2 S2 C3 S3 C4 S4 C5 S5 C6 S6 C7 S7 C8 S8 IEF a detekce o-lgG: Metody Zeman D et aI. Ces Slov Neurol N 2019;82/115(l):68-75 • Agarosový gel, imunofixace v gelu (Hydrasys, Sebia) - AGA IEF/IF • Polyakrylamidový gel (Flatbed Professional, EDC), imunoblotting -PAG IEF/IB • Obě metody poskytly prakticky shodné kvalitativní výsledky Detekce intrathekální protilátkové odpovědi: Historie • 1921 - zlatosolová křivka (C. Lange) • 1942 - elektroforéza v roztoku (moving boundary electrophoresis - A. Tiselius 1930): zmnožení gamaglobulinů v likvoru pacienta s neurosyfilis, úvaha o jejich intrathekálním původu (E. Kabát) • 1959 - elektroforéza v agarovém gelu: denzitometricky detekovaná heterogenita gamaglobulinů likvoru u pacienta s SSPE (D. Karcher et al.) • 1960 - elektroforéza v agarovém gelu: vizuálně detekovaná heterogenita gamaglobulinů likvoru u pacientů s RS, neurosyfilis, SSPE a neurotrypanosomiázou (A. Lowenthal et al.) • 1971 - izoelektrická fokusace (IEF) likvorových bílkovin v polyakrylamidovém gelu: charakteristický obraz v gamaglobulinové oblasti u pacientů s RS, vyšší senzitivita oproti elektroforéze v agarovém gelu (P. Delmotte) Zlatosolová křivka (Likvorologická laboratoř Hennerovy Neurologické kliniky VFN a 1. LF UK v Praze, 1997) „Zlatosol mění barvu podle stupně dispersity koloidních částic. Jsou-li v roztoku koloidní částice malých rozměrů, zůstává purpurově červená barva zlatosolu nezměněna. Čím jsou koloidní částice hrubší, tím více se mění barva zlatosolu přes červeně fialovou, modrofialovou, modrou, modrobílou až bílou za současné tvorby sedimentu. Na změnu barvy zlatosolu mají vliv globulíny, zejm. gama frakce." (Hanzal, Skaličková, Viklický: Mozkomíšní mok v klinické a laboratorní praxi. Praha, SZN 1963.) Oligoklonální pásy • Pokus o definici: pásy (imunoglobulinových molekul, volných lehkých řetězců) produkované několika málo (oligo-) klony B lymfocytů, resp. plazmatických buněk • Detekovány po separaci bílkovin likvoru a paralelně vyšetřeného séra elektroforetickými metodami (preferovaná metoda pro o-lgG: izoelektrická fokusace) • Starší metody s nespecifickou detekcí měly potenciál detekovat oligoklonální pásy IgG, IgA i volných lehkých řetězců (bez možnosti rozlišení), ale také non-lg proteiny v alkalické oblasti (beta trace, gama trace aj.) • Metody se specifickou detekcí používané v běžné klinické praxi detekují pouze IgG (při použití protilátky proti Fc fragmentu IgG), popř. také volné lehké řetězce (při použití protilátky proti celé moleKule nebo Fab fragmentu IgG) • Metody se specifickou detekcí jiných imunoglobulinů/volných lehkých řetězců jsou používány vzácně a spíše výzkumně Klasifikace nálezů o-lgG - 5 typů podle mezinárodních doporučení Andersson M et al. J NeurolNeurosurg Psychiatry 1994;57:897-902 Freedman MS et al. Arch Neurol 2005;62:865-70 Typ 4 Typ 5 CSF S CSF S • Typ 1: jen „polyklonální" IgG v likvoru i séru • Typ 2: >2 IgG pásy v likvoru, jen „polyklonální IgG v séru • Typ 3: IgG pásy shodné v likvoru i seru + IgG pásy přítomné pouze v likvoru • Typ 4: IgG pásy shodné v likvoru i seru • Typ 5: monoklonální IgG v likvoru i seru Oligoklonální IgG - typy IEF nálezu: IEF/IF (Sebia) typ 1 - typ 2 - typ 3 - typ 4 - typ 5 dvojice likvor (vlevo), sérum (vpravo) Vzorek EHK (SEKK 2/2016): Typ 4 nebo Typ 5? CSF S Co+(S) Co-(F) CSF S Co+(S) Co-(F) CSF S Co+(S) Co-(F) CSF S Co+(S) Co-(F) CSF S IgG (Sebia) Ig G kappa IgG kappa (Hevylite) IgG lambda IgG lambda (Hevyiite) imunofixační elektmforéza (sérum) lEF v polyakrylamidovém gelu (Pannewitz-Makaj K et al, Diagnostics 2021, 11(1): 37) OCB patterns Oligoklonální volné lehké řetězce (o-fLC) Zeman D et al., PLoS ONE 2016;ll(ll):e0166556 fKLC agarose PAG agarose Co+ Co- C1S1C2S2C3S3C4S4 PAG Oligoklonální volné lehké řetězce (fLC): agarózový vs. polyakrylamidový gel Zeman et al. Cesk Slov Neurol N 2019; 81/115(l):68-75 48 vzorků Výtečná shoda mezi separací v agarózovém a polyakrylamidovém (PAG) gelu (kappa > 0,8 pro všechna srovnání) Počet pásů poněkud vyšší v PAG Klinické korelace lepší v PAG (cut-off 6 o-fKLC pásů) Výtečná shoda mezi hodnotícími (kappa > 0,9 pro všechna 4 srovnání) o-lgM u pacientky s RS při diagnostické LP (A), po 18 měsících bezprostředně před AHSCT (B) a po dalších 12 měsících (C) Oligoklonální IgA pH gradient 4-8, anodická aplikace, bez prefokusace pozitivní nález ve vzorku 3 (pacientka s CIS) Kapilární elektroforéza (CE) - princip (obrázek převzatý z https://www.creative-proteomicsxom/pra • Dělení v křemenných kapilárách • Dvě elektrody • Dva rezervoáry pro pufry • Zdroj vysokého napětí (+/- 30 kV) • On-column detektor V obvyklém uspořádání: Aplikace k anodě, detekce u katody; vlivem elektroosmózy migrují nakonec ke katodě i kladně nabité částice A C G G A CGA A aAaaa A/A a, time capillary "D o migration direction detecto letor j -®- n Ol T O CL source vial destination vial Kapilární elektroforéza Tenké křemenné kapiláry (vnitřní průměr 25 - 75 |im, délka 20 - 100 cm), na jejich povrchu jsou záporně nabité silanolové skupiny - způsobí elektroosmotický tok kladně nabitých iontů pufru ke katodě-všechny složky vzorku nakonec dorazí ke katodě, kde jsou detekovány Detekce nejčastěji UV/VIS (200 nm - peptidová vazba; 280 nm -aromatické zbytky) Capillary Anode- Source Vial Sample Vial High Voltage I'ower Supply Integrator or Computer Detector Buffer 1 1—1 Buffer Deitination Vial Cathode OKB FN Brno: Přístroj Capillarys 2 Flex-piercing využití: 1) stanovení HbAlc, 2) stanovení CDT (%) Přístroje pro kapilární elektroforézu firmy Sebia Volume of tests Low Medium High Configuration standalone Standalone Standalone Workcell On Track Instrument MINICAP FLEX-PIERCING CAPILLARYS 3 CAPILLARYS 3 CAPILLARYS 3 CAPILLARYS 3 OCTA TERA TERA MC 1, 2 or 3 TERA TLA Number of capillaries 8 12 12 to 36 12 Available menu HbAlc, Hemoglobin, CDT, Serum Protein, Urine Protein, Serum Immunotyping, Urine Immunotyping HbAlc, Serum Protein, Serum Immunotyping Odkazy na internetové stránky dvou hlavních výrobců • Sebia: https://www.sebia.com/solutions/instruments/ • Helena: https://www.helena-biosciences.com/en/clinical-electrophoresis/ Kapilární elektroforéza (CE) - metody metoda zkratka Dělení podle Aplikace Kapilární zónová elektroforéza CZE Velikosti/náboje (mobility) Malé ionty, peptidy, proteiny Izotachoforéza ITP Velikosti/náboje (mobility) Malé ionty, proteiny Kapilární afinitní elektroforéza ACE Velikosti/náboje (mobility) Interakce ligandů Bezvodá kapilární elektroforéza NACE Velikosti/náboje (mobility) Malé ionty s malou rozpustností ve vodě Micelární elektrokinetická chromatografie MEKC/MECC Hydrofobicity/náboje Neutrální částice Kapilární gelová elektroforéza CGWE velikosti Proteiny, DNA Kapilární elektrochromatografie CEC Chromatografická retardace Malé ionty a neutrální částice Izoelektrická fokusace CIEF Náboj (izoelektrický bod) Proteiny Kapilární elektroforéza (CE) - detektory • Absorpční - UV-detektor - detektor diodového pole • Fluorescenční - excitace lampou - excitace indukovaná laserem • Hmotnostní spektrometr • Elektrochemický • Radioizotopový • Vodivost ní • Indexu lomu • Nukleární magnetická rezonanční spektrometrie Literatura R. Westermeier: Electrophoresis in Practice. 4. přepracované a rozšířené vydání. Wiley-WC H, Weinheim, 2005. ISBN 3-527-31181-5 R. Westermeier, A. Görg: Elektrophoretische Verfahren. In: Lottspeich F, Engels JW (Eds.) Bioanalytik. 3. vydání. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg 2012. Str. 269-302. P. Schmitt-Kopiin, C Schwer: Kapillarelektrophorese. In: Lottspeich F, Engels JW (Eds.) Bioanalytik. 3. vydání. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg 2012. Str. 303-333. ISBN 978-3-8274-2942-1. Keren DF, Schröder L. Challenges in measuring M proteins in serum. Clin Chem Lab Med 2016, 54: 947-961 Engliš M. Interpretace elektroforézy plazmatických bílkovin vagarózovém gelu. Praha, Avicenum 1992. Tichý M. Laboratorní analýza monoklonálních imunoglobulinů (paraproteinů). FINIDR, Český Těšín 1997. Maisnar V., Tichý M. a kol. Monoklonální imunoglobuliny - výskyt, význam a možnosti jejich průkazu. Nucleus HK2012. Stern P. Základy instrumentální analýzy v klinické biochemii. Dostupné na: http://wwwl.lfl.cuni.cz/~kocna/biochem/textll.htm Přednášky Mgr. Jany Gottwaldové (t.č. v laboratoři Masarykova onkologického ústavu) - s poděkováním za laskavé svolení Internetové stránky výrobců • Firmy Sebia a Helena s dominantním podílem na trhu v oblasti rutinních klinických aplikací elektroforézy - viz výše • Serva Electrophoresis GmbH: https://www.serva.de/ • Cytiva Life Sciences: https://www.cytiyalifesciences.com/en/us/shop/protein-analysis/electrophoresis-and-isoelectric-tocusing • Bio-Rad: https://www.bio-rad.com/en-cz/category/electrophoresis-blotting?ID=1616a788-c555-4b35-a33d-2735Q71eM65 • Thermo Fisher Scientific: https://ww\A/.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/protein-biology/přotein-gel-electrophoresis.html • Electrophoresis Development & Consulting (Dr. Hanspeter Schickle, Wolfgang Gstrein): https://www.electrophoresis-development-consulting.de/inaex.html Reflexní fotometrie • měří záření odražené od homogenně zbarvené podložky • Matrice: impregnovaná vlákna nebo vícevrstvý (želatínový) film (homogenní matrice) • Zdroj světla: žárovka s halogenovou atmosférou, Xe výbojka s interferenčním filtrem nebo LED (světlo emitující diody) • Detektor: fotonásobič (citlivější) nebo fotonka, na níž je veškeré odražené světlo z reagenčního políčka fokusováno bílým kulovým reflektorem (vyduté zrcadlo - Ulbrichtova koule) • Vzorek: plná krev, sérum, plazma, moč • Suchá činidla aktivovaná vodou obsaženou ve vzorku • Použití zejména v glukometrech - suchá chemie • močová analýza • denzitometrické hodnocení tenkovrstevných chromatogramů Reflexní fotometrie - testovací proužky („su chemie") https://www.dastacr.cz/dasta/hvpertext/JVABM.htm Průhledná Fólie Rtetänf zóna i hranná sitka Sfi-paracfii vrstva .Vrsflva pomocnycti miiide Transportní vrstva Magneticky Iccí Schéma konstrukce proužku pro Reffotron 71 Vertikální fotometrie - uspořádání absorpční fotometrie, při které paprsek prochází kyvetou vertikálně • Použití pro měření v mikrotitračních destičkách • Světlovody (skleněná vlákna) vedou světlo do více (zprav, osmi) jamek současně a další světlovody odvádějí prošlé světlo k detektoru • Při konstantní ploše kruhové základny je pro stejnou koncentraci konstantní součin absorbance a délky optické dráhy roztokem: A1-l1=A2-12 • Při krátké optické dráze (cca 3 mm) tak lze docílit solidních výsledků i navzdory malým nepřesnostem v pipetování multikanálovou pipetou DĚKUJI ZA POZORNOST. V případě zájmu možná návštěva Laboratoře likvorologie a analýzy proteinů - po dohodě e-mail: zeman.david@fnbrno.cz