Andrologie
Soňa Kloudová
sona.kloudova@med.muni.cz
28.3.2023
• Pouhé vyšetření spermiogramu mnohdy není dostatečné pro posouzení plodnosti
muže
• I přes velký posun v technikách IVF je nárůst PR a IR nízký
• Bylo vyvinuto mnoho funkčních testů zaměřujících se na různé funkční vlastnosti
spermií nebo procesy spojené s fertilizací
-spermií musí být dostatečný počet a i jejich funkční kvalita musí být
dostatečná (kvalita membrán, funkce akrozomu, funkce mitochondrií, vhodně
kondenzovaná a intaktní DNA)
-spermie musí dostávat patřičné živiny ze semenné plasmy
-spermie musí být chráněny před účinkem RMK
• Volba metody oplození
• Ideální test funkce spermií by specifikoval chybnou funkci spermie, předpověděl
úspěšnost léčby a indikoval patřičný postup léčby
Testy funkčních vlastností spermií
Vitalita spermií
• Integrita membrány -membrána živé buňky nepropustí barvivo
• Eosin – v kombinaci s nigrosinem (podbarvení)
• Roztěr, světelná mikroskopie
• Propidium Iodide (často v kombinaci se SYBR green)
• Suspenze, fluorescenční mikroskopie
živé živé
mrtvé
Hypoosmotic sweeling test (HOS)
• Integrita membrán spermií
• Transport tekutiny přes intaktní membránu probíhá v
hypoosmotickém prostření dokud není dosaženo
rovnováhy
• Buňka se roztáhne
• Změny lze pozorovat na bičíku (svinutí) ve světelném
mikroskopu
• Buňky s poškozenou membránou nereagují
• Dříve využití i v klinické praxi, dnes neexistuje
certifikované hypoosmotické médium
AnexinV binding assay
• Detekce časných apoptických změn (přesun fosfatidylserinu
z vnitřní na vnější stranu membrány)
• Annexin V, propidium iodid
• Živé spermie (annexin V-negativní and PI-negativní);
• Mrtvé spermie –pozdně apoptické, nekrotické(annexin Vpozitivní
and PI-pozitivní);
• Buňky se zhoršenou integritou membrány –časně apoptické
(annexin V-pozitivní and PI-negativní)
• Průtokový cytometr/ fluorescenční mikroskop
https://www.abpbio.com/product/annexin-v-binding-assays/ http://www.bioline.org.br/request?rm07025
Fragmentace DNA spermií
• Porušení integrity DNA spermií – nejčastěji jedno nebo dvojřetězcové zlomy
• Chybná kondenzace DNA během vývoje spermií, apoptóza, oxidační stres
• Schopnost spermie fertilizovat oocyt zůstává nenarušena!
• Negativní vliv na vývoj embryí, implantaci nebo průběh těhotenství in vivo i in
vitro
• Jedno z nejpoužívanějších doplňkových vyšetření
TUNEL test (Terminal deoxynucleotidyl transferase nick and
labelling)
Comet assay (Single cell ge electrophoresis)
SCSA (Sperm chromatine structure assay)
SCD Sperm chromatine disperion test
Tunel test
• detekce zlomů řetězce DNA in situ označením
fluorochromy nebo sondami s biotinem (následná
konjugace se streptavidinem-HRP (křenová
peroxidáza) a chromogenním substrátem HRP)
• Principem je značení zlomů v DNA s deoxynukleotidy
(obvykle dUTP, deoxyuridinfosfát), ten je přímo
značen fluorescenčním barvivem nebo značen
biotinem
• 3´-OH konce zlomů slouží jako primery, jsou značeny
bromodeoxyuridinem (Brd-U) v reakci katalyzované
terminální deoxynukleotidyl transferázou (TDT, DNA
polymeráza nezávislá na templátu)
• Komerční kity
• Průtokový cytometr, fluorescenční mirkoskop
WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen
Sixth edition
Sperm cromatine dispersion test
• Světelná mikroskopie-možnost provést v
andrologické laboratoři
• Hodnotí se náchylnost DNA spermií ke kyselé
denaturaci
• Expanze smyček DNA následující po
denaturaci a extrakci jaderných proteinů v
případě intaktní DNA
• V případě fragmentované DNA je tato
expanze minimální nebo žádná
• Kolem hlaviček s intaktní DNA spermií se po
expozici kyselému a následně lyzačnímu
roztoku v agaru tvoří tzv. halo – svatozáře
(odpovídají smyčkám relaxované DNA
připojeným ke zbytkovým jaderným
strukturám a uvolněným po odnětí jaderných
proteinů)
Komerčně dostupný, snadno
proveditelný test –Halosperm
nebo Gold Cyto
Sperm chromatine structure assay
• akridinová oranž – metachromatická
(zelená vs. červená)
• průtokový cytometr
• populace nezralých spermií - nízká
kondenzace chromatinu
• Software –vysoká míra standardizace
Evenson 2016
https://abdominalkey.com/sperm-dna-
damage-causes-and-laboratory-detection/
Commet assay
• Principem je rozdílná migrace zlomených řetězců DNA pod vlivem elektrického pole
závisející na náboji a velikosti řetězců
• Fragmenty DNA spermií v agaróze jsou odděleny od hlavičky spermie
elektroforetickým pohybem→ vzhled komety
• Fluorescenční mirkoskop, ethidium bromid
abnormální normální
Anilin blue staining
• Světelná mikroskopie, zralost spermií
• Rozdíly ve sbalení chromatinu spermií
• Nepřímo měří poměr histonů/protaminů
• Anilinová modř má vyšší afinitu k histonům
• Vyšší počet aniline blue pozitivních spermií indikuje poruchy v
kondenzaci chromatinu
• modré spermie považujeme za nezralé, nicméně existuje
mnoho škál zabarvení a výsledky není snadné interpretovat
Chromomycin A3
• Fluorescenční mikroskopie, zralost spermií
• Úroveň protaminace a sbalení chromatinu
• CMA3 se váže specificky k regionům bohatým na G-C
(současně jde o místo vazby protaminů)
Hodnocení leukocytů v ejakulátu
• Dominují polymorfonulkeální leukocyty
(neutrofily)
• Papanicolauovo barvení – tvar a velikost
jádra, zabarvení cytoplasmy
• U ostatních barvení bohužel hrozí záměna
s degenerujícími spermatidami
(G) Neutrophil (G1). (H) Two small neutrophils (H1,
H2). (J) Spermatid (J1), possible degenerate/damaged
neutrophil (J2), neutrophil (J3), possible degenerate
monocyte (J4). (K) Neutrophils (K1, K2), spermatid
(K3). (L) Cytoplasmic remnant (L1), spermatocyte
(L2). (M) Spermatocyte (M1), spermatids (M2).
Barvení cytoplasmatické peroxidázy pomocí ortho-toluidinu
• peroxidáza-enzym typický pro granulocyty
• Jednoduchá histochemická metoda, která ale:
nedetekuje aktivované (degranulované) granulocyty
nedetekuje ostatní typy leukocytů
Imunocytochemické značení antigenu
CD45
• Všechny leukocyty
• Časově i finančně náročnější
• Fluorescenční mikroskop/ průtokový
cytometr
• Sperm Flow Ex Kit- informace o počtu
spermií, počtu leukocytů, viabilitě a
integritě akrozómů
Oxidační stres
Luminol
• Chemiluminiscence při kontaktu s volnými
radikály
• Luminometr, počel RLU (relative light units)
na milión spermií
• Neakreditované pro laboratorní diagnostiku
Oxidoredukční potenciál
• Celkové měřítko oxidačního stresu
Mioxsys rychlý IVD prostředek ke
kvantitativnímu měření (milivolty) statického
oxidoredukčního potenciálu v ejakulátu za
využití elektrochemické technologie
Oxisperm
• -měří redoxní aktivitu pomocí Nitrotetrazoliové modři ( v přítomnosti oxidoreduktáz tvoří
modré nerozpustné krystalky)
• Castleton et al. 2022 – nebyl potvrzen potenciál predikovat funkci spermie nebo
oxidační stres v ejakulátu (ani u MiOxsys ani u Oxisperm)
Protilátky proti spermiím
• Aglutinace – motilní spermie, hlavička/hlavička, bičík/bičík nebo mix
• Mohou se vyskytovat i bez aglutinací a stejně tak aglutinace může být způsobena
něčím jiným
• Pouhá přítomnost protilátek proti spermiím není dostatečná pro diagnózu
autoimunitní reakce proti spermiím
• Narušují interakci s cervikálním hlenem, ovlivňují vazbu na ZP a akrozomální
reakci
• IgA a IgG, velmi zřídka IgM
• IgA jsou klinicky významnější
• Detekce přímo na spermiích nebo v tělních tekutinách
• Mixed antiglobuline reaction, Immunobead test, Elisa
MAR test (Mixed antiglobulin reaction test)
• Světelná mikroskopie
• Levný, rychlý, senzitivní
• Protilátky proti IgG nebo IgA konjugované s latexovými částicemi -„beads“
(kuličky/korálky)
• Přímý test: ejakulát smíchán se suspenzí latexových částic konjugovaných s antihuman
IgG/IgA → konjugáty
• Počítají se spermie s navázanými částicemi IgG/IgA – podíl
• v současné době není stanovena „evidence-based“ referenční hodnota
Interakce spermií s cervikálním hlenem
• Postkoitální test
• Cervikální hlen je pro spermie dobře průchozí po omezený čas v období před ovulací (vliv
estrogenu), délka tohoto období se u žen liší
• Cílem je určení počtu pohyblivých spermií v cervikálním hlenu a vyhodnocení přežití
spermií
• Imunologický faktor ze strany ženy
• Načasování styku – běžná délka cyklu, ultrazvuk, bazální tělesná teplota, hormonální
screening
• Hlen musí být vyšetřen 9-14 hodin po styku-cervikální hlen (živé spermie, vaginální hlen –
mrtvé spermie), světelný mikroskop
Cervikální hlen: spermie nenalezeny → negativní
progresivní spermie → není imunologický faktor
pohyb na místě → imunologický faktor
Funkce přídatných pohlavních žláz
• Abnormální sekrece přídatných pohlavních žláz může
mít negativní efekt na funkce spermií
• Dočasné změny v sekreci mohou být způsobeny infekcí, ,
v některých případech jsou změny ireverzibilní
• Funkce žláz může být kontrolována měřením jejich
sekrece:
prostata: kyselina citrónová, zinek a kyselá
fosfatáza
nadvarlata: L-carnitin, glyceofosfocholin (GPC),
neutrální α- glukosidáza
semenné váčky – fruktóza
• Spektrofotometrie, kolorimetrie
Akrozom
• Pisum sativum aglutinin (PSA) –FITC
• Fluorescenční mirkoskop
• Lze i indukovat akrozomální reakci (ionofor, progesteron)
Kombinace s HOS ( hypoosmotic sweeling test)
Test mitochondriální aktivity spermií
• Mitochondriální oxidoredukční enzymatický aparát
• Nintrotetrazoliová modř modrý nerozpustný pigment
kolem střední části spermie, světelná mikroskopie
• Korelace s motilitou spermií
• JC-1 – fluorescenční karbokyaninové barvivo
→žlutooranžová fluorescence- vysoká mitochondriální
aktivita (vysoký membránový potenciál), zelená
fluorescence –nízká mitochondriální aktivita
• Tvoří agregáty při vysokém membránovém potenciálu
• MitoTracker Green – zelená fluorescenční látka selektivně se
akumulující v matrix mitochondrií. Kovalentně se váže k
mitochondriálním proteinům reakcí s volnými thiolovými skupinami
cysteinových residuí-pouze detekce mitochondrií, nikoli jejich aktivity
https://www.mdpi.com/2076-3921/10/8/1204
MitoTracker green + DAPI
Pokusné promytí spermií
• Před IVF, doplňkové vyšetření k
SPG
• Vhodnost použití metodiky
zpracování spermií
• Výběr metody oplození
• Hodnotí se zisk spermií (počet)
a funkční kvalita po zpracování
(pohyb)
Hyaluronan binding assay - HBA
• Vazba spermií k hyaluronanu
• Zralost spermií v ejakulátu
• Jednoduchá metoda, světelná mikroskopie
• HBA skore (%)- počet navázaných spermií/celkový počet
motilních spermií
• Vazbu vykazují spermie maturované, s intaktní DNA,
intaktním akrozomem a lepší morfologií, nižší podíl
aneuploidií
• HA receptor CD 44- spermie s lepším fertilizačním
potenciálem, lepší struktura plasmatické membrány,
lepší mitochondriální aktivita
• (princip metody PICSI)
Testy interakce s oocytem
Sperm penetration assay (SPA)
• lidské spermie x oocyt křečka zbavené ZP – kapacitace, akrozmální
reakce, penetrace, dekondenzace –rutinně se nepoužívá, nízká
vypovídací hodnota
Sperm zona pellucida binding test
• HZA Hemizona assay nebo Competitive intact zona sperm binding
assay - primárním výstupem je pevná vazba spermie na ZP oocyt,
vysoká prediktivní hodnota
• HZA: spermie fertilního muže jako kontrola →hemizona index (HZI:
počet navázaných spermií testovaného/počet spermií kontrolního
fertilního muže x 100)
• HZI ˂ 30 –signifikantně nižší pregnancy rate po IUI (intrauterinní
inseminace)
Fluorescence in situ hybridization FISH
• Chromozomy X, Y, 13, 18 and 21 (Klinefelterův
syndrom [XXY-XXXXY], Turnerův syndrom [XO],
Patauův syndrom [trisomy 13], Edwardsův
syndrom [trisomy 18] and Downův syndrom
[trisomy 21]).
• Ideální je detekce všech aneuploidií (ale vysoké
náklady)
• Genetická konzultace (předchozí selhání,
astenozoospermie, těžké oligozooseprmie)
• WHO
(WHO 2021, 6th edition)