Mikroskopické techniky – seminář Josef Jaroš Ústav histologie a embryologie Lékařská fakulta, Masarykova univerzita Osnova předmětu • Úvod do mikroskopie - vlastnosti světla, základní principy mikroskopie, typy mikroskopů • Kontrastní mikroskopie - temné pole, fázový kontrast, HMC, polarizační mikroskopie, DIC • Fluorescenční mikroskopie - fluorochromy, epifluorescence, konfokální mikroskopie • Příprava vzorků a histologické zpracování - odběr, fixace, barvení, IHC • Elektronová mikroskopie - SEM, TEM, 3D, zpracování vzorků • Holografická mikroskopie • Mikroskopie v embryologii - exkurze Reprofit • Pokročilé zobrazovací metody - dvoufotonová, superrozlišení, korelační mikroskopie • Zpracování obrazu, analýza dat • Laboratoř - barvení, mikroskopie Závěrem předmětu bude písemný test. Světlo, vlny • Do 19. století se bralo světlo jako elektromagnetické vlnění • A. Einstein objevil a popsal také jeho částicovou povahu λ Amp Vlna světla charakterizována (zejména pro optiku) - Amplituda - Vlnová délka - Frekvence Jako částice je charakterizována (zejména pro kvantové jevy) - energií, hmotností, elektrickým nábojem, spinem, … Energie světla závisí na nejen počtu fotonů, ale také na jeho vlnové délce (frekvenci vlnění) Jako příklady částicových projevů elektromagnetického záření lze uvést fotoelektrický jev interakce dopadajících fotonů s volnými elektrony uvnitř materiálu (polovodičů) – Za objasnění dostal A.Einstein Nobelovu cenu. h - Planckova konstanta 6,6 x 1034 J.s f - frekvence c - rychlost světla λ – vlnová délka Znázornění fotonu Refrakce • Lom světla Historie mikroskopie • 1. čočka – kapka vody Malá kapka vody má stejnou funkci jako sférické čočky a umožňuje dosáhnout velkého zvětšení pozorovaného objektu Starověk (3. stol. př. n. l.) • Počátky optiky – zrcadla z mědi a bronzu • První teorie o původu světla a vidění • řečtí filozofové-Pythagoras, Démokritos, Platón; studium lomu světla (Eukleidos, Ptolemaios) • Řekové: skleněné koule naplněné vodou • Plinius – skleněné čočky 1590 Hans a Zacharias Janssenovi • Holandský výrobce brýlí Hans Janssen se svým synem jsou uváděni jako první výrobce mikroskopu složeného z více čoček • Byl tvořen ze dvou tubusů, které při zasunutí poskytovaly zvětšení 3x a po roztažení 9x 1580 Galileo Galilei konvexní konkávní Galileo konstruuje mikroskop z čočky a rozptylky a nazývá jej occhiolino – muší oko Slovo mikroskop zavedl dle teleskopu Giovanni Faber z Bambergu (1574-1629) Předmětová čočka Obrazová čočka Předmětová čočka Obrazová čočka Jednoduchý mikroskop - 1 čočka Bakterie v děšťové vodě a slinách nazýval „Animalcules“ Zvětšení 270x • obchodník se suknem • Zpočátku amatérský brusič čoček • Za život prý vyrobil 500 mikroskopů s 1 silně zvětšující čočkou • Rozlišovací schopnost jeho čoček byla lepší než tehdejší složené mikroskopy • Jako první viděl jednobuněčné organismy • objevitelem mikroorganismů, krevních buněk, spermií, svalových vláken a dalších mikroskopických útvarů a je nazýván „otcem mikrobiologie“. Antony van Leeuwenhoek z Leydenu (1632-1723) Robert Hooke 1670 Složený mikroskop – 2 a více čoček „Cell“ - „Buňka“ 1665 sepsal traktát Micrographia (o mikroskopickém pozorování rostlinných tkání a struktury minerálů) Pozorováním tenkých řezů korku definoval pojem cell - buňka Mikroskopy 20. století https://www.instructables.com/10-Smartphone-to-digital-microscope-conversion/ Konverze chytrého telefonu na mikroskop • Ultramikroskop • částice menší než vln. délka světla (1903 - Richard Zsigmondy) • Fázový kontrast • bezbarvý a průhledný materiál (1930 - Frits Zernike) • Elektronový mikroskop • 10 mil x (1934 Ernst Rask) • Skenovací tunelový mikroskop • Atomy… (1981 Binnig& Rohrer) • Super-rezoluční mikroskopy • 2010 • Chemiskopy • 2017 Vývoj dalších typů mikroskopů Srovnání velikostí Rozlišovací schopnost lidského oka d d Oko je schopno rozlišit 2 objekty – „mravence“ ϴ = 1’ Při vzdálení objektů se sníží úhel ϴ, rozlišovací schopnost. Oko tedy není schopné rozlišit 2 objekty. V praxi jedna úhlová minuta ϴ znamená, že budeme-li za ideálních světelných podmínek sledovat předmět z běžné čtecí vzdálenosti (20 cm), budou nám splývat všechny body bližší než cca 1/6 mm, tedy 0,166667mm. Mikroskop musí poskytnout Rozlišení Schopnost přenést informaci o jemných detailech ze vzorku do obrazu Kontrast Rozdíly v obrazu mezi hlavním prvkem a pozadím Zvětšení Vytvořit obraz dostatečné velikosti, aby byly okem rozeznatelné podrobnosti. Binokulární mikroskop vs stereomikroskop • Pozorování oběma očima je méně únavné • Každé oko pozoruje svým okulárem meziobraz objektu • Tedy binokulární mikroskop není stereomikroskop Stereomikroskop Stereomikroskop má dvě samostatné optické dráhy – pro pravé a levé oko zvlášť. Toto uspořádání poskytuje prostorové vidění, trojrozměrný pohled a přímý obraz. Čím je větší úhel φ tím je výraznější stereovjem Binokulární mikroskop Části mikroskopu ČÁST OPTICKÁ: • objektivy, okuláry ČÁST OSVĚTLOVACÍ: • zdroj světla, polní clona • kondenzor, aperturní clona ČÁST MECHANICKÁ: • rám, tubus, • revolverový měnič objektivů, • stolek, makrošroub, mikrošroub, • vypínač, ovládání intenzity světla Polní clona • Clona polní – v blízkosti zdroje světla (žárovky) Polní clonou se reguluje osvětlená oblast v zorném poli. Při uzavřené polní cloně je osvětlena jen malá část zorného pole okolo středu, vždy je nutné polní clonu otevřít tak, aby bylo osvětleno celé zorné pole. • Clona aperturní součást kondenzoru Aperturní clonou se reguluje velikost prostorového úhlu kužele světla, které osvětluje pozorovaný preparát, což ovlivňuje vlastnosti mikroskopického obrazu, které určují jeho kvalitu: kontrast, hloubku ostrosti a rozlišení podrobností. Ideální je takové nastavení aperturní clony, kdy aktuální numerická apertura odpovídá apertuře objektivu. • Je nezbytné nastavit správné otevření clon pro tzv. Kohlerovo osvětlení Postup pro nastavení mikroskopu Kohlerovo osvětlení 1. otevřít polní a aperturní clonu 2. vložit preparát a zaostřit ho při zvětšení 10x a více 3. zavřít polní clonu 4. zaostřit polní clonu pohybem kondenzoru (nahoru/dolů) tak, aby byly její hrany ostré zároveň s preparátem 5. Vycentrovat polní clonu horizontálním pohybem kondenzoru 6. otevřít polní clonu, aby právě zmizela za obzorem zorného pole 7. nastavit aperturní clonu tak, aby odpovídala max. hodnotě numerické apertury (NA) objektivu a nastavení respektovalo charakter preparátu. Postupným uzavíráním aperturní clony se zvyšuje hloubka ostrosti a zvyšuje kontrast, postupně však vystupují i různé nečistoty nebo nežádoucí vrstvy buněk. Obvykle bývá dosaženo nejlepších výsledků při hodnotě nastavení aperturní clony na 70 až 80 % numerické apertury použitého objektivu. Mikroskop přímý a inverzní Přímý mikroskop Objektiv Světelný zdroj Polopropustné zrcadlo Vzorek Zaostřená rovina Světlo prochází vzorkem odspodu nahoru Jednodušší konstrukce mikroskopu Používá se pro fixované vzorky, sklíčka Invertovaný mikroskop Objektiv Světelný zdroj Polopropustné zrcadlo Vzorek Zaostřená rovina Polopropustné zrcadlo Pozorování vzorku zespodu Používá se pro živé vzorky – buňky kultivované na Petriho misce v laboratoři HoffmanDICFázový kontrastProch. světlo Světelná mikroskopie • Procházející světlo –tenký řez tkáně se jeví jako transparentní - nutno barvení vzorku, nebo kontrasty • Fluorescence – epifluorescenční, konfokální, superrezoluce Struktura povrchu Plasticita Optické řezy Žádný halo effekt Sklo, ne plastic Zvýrazněné okraje, vnitřní struktura, organely Ne povrch Obojí – vnitřní struktura i povrch Sklo i plastic IVF oblíbené Nízký kontrast Barvení vzorků Skrze mikroskop se nedíváte na vzorek.. Pozorujete obraz vzorku!