Fluorescenční mikroskopie Josef Jaroš • Definice a princip fluorescence • Fluorofory • Fluorescenční mikroskop Princip fluorescenční mikroskopie • Viditelné světlo • Vlnění o vlnové délce 400-700 nm • Elementární částice – foton (duální povaha) λ = c / f E = h * f = h * c / λ h – Planckova konstanta Luminiscence • Jev při kterém látka vysílá do prostoru světlo • Dělení dle indukce • Chemiluminiscence – Vyvoláno chemickou reakcí – např. oxidace luciferinu luciferázou u světlušek, ECL detekční činidlo Fotoluminiscence • Záření je vyvoláno jiným zářením • vyzařování světla objektem poté, co byl před tím vystaven záření o (většinou) kratší vlnové délce, než-li je vlnová délka vyzařovaného záření. • Fluorofor (luminofor) = fluorochrom – látka schopná fosforescence • Excitační záření – luminiscenci vyvolává • Emisní záření – vysílané látkou • elektroluminiscence - displeje starších kalkulaček • radioluminiscenci - radioaktivní záření, dopad radioaktivního záření na luminiscenční stínítko vyvolává záblesky. • termoluminiscence, mechanoluminiscence, sonoluminiscence, chemiluminiscence - podtypem chemi- je bioluminiscence Výskyt a využití fluorescence Collection of various fluorescent minerals under UV-A, UV-B and UV-C light Agarose gel following Agarose gel electrophoresis on UV light box Gel from a research project on hepatitis B virus GFP - Aequorea victoria Confocal microscopy - Transformed African Green Monkey Kidney Fibroblast Cells (COS-7 Line) Fluorescence v molekulární biologii • 1930 - použití fluorochromu v biologických aplikacích pro značení částí tkání, bakterií a některých patogenů • 1940 - Coons a Kaplan vyvinuli techniku značení protilátkami v konjugovanou fluorescenční barvou –studium vazby protilátka-antigen prudce změnilo obor imunohistochemie • 1994 - M. Chalfie et al. úspěšně exprimoval přirozeně fluorescenční protein, green fluorescent protein (GFP), u živých organismů. Tento objev se stal milníkem ve vývoji nové třídy metod značení. Fluorescenční mikroskopie Průtoková cytometrie, třídění DNA, RNA, protein arrays FISH Princip fluorescence Princip fluorescence Princip fluorescence Princip fluorescence – Jablonského schéma - molekula absorbuje světlo o vysoké energii - tím se energie molekuly zvýší (excitovaná molekula) - část této energie pohlcena molekulou (vlnovka) - molekula vyzařuje světlo o nižší energii Průběh fluorescence • Excitace – elektronů fotony ze základní energetické hladiny do excitovaného stavu – trvání 10-15 s • Excitovaný stav – pokles na nejnižší hladinu excitace (relaxace) • Ztráta energie ve formě tepla • Trvání 10-14-11 s • Emise světla => fluorescence • Trvání 10-9-7 s = doba dohasínání Recyklace a photobleaching https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope- resource/primer/java/fluorescence/photobleaching/ Fluorochromy jsou schopny recyklace, ale mnohé se velmi rychle vysvěcují. Snaha je používat stabilizované. Excitace Vzorek fluoroforu je osvěcován různými vlnovými délkami a podle toho jsou aktivovány rozdílné počty molekul – absorpční spektrum Emise Fluorofor vyzařuje na různých vlnových délkách – emisní spektrum Absorbční (excitační ) spektrum závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce (měřeno při konstatní emisní vlnové délce) Emisní spektrum závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní vlnové délce excitace • obě spektra mají své maxima • excitační maximum • emisní maximum • vzdálenost mezi nimi – Stokesův posun Fluorofory Vlastní (vnitřní) fluorescence látek • Přirozeně se vyskytující fluorofory • aminokyseliny, kofaktory enzymů, chlorofyl, green fluorescent protein.. Nevlastní (vnější) fluorescence látek • Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné struktury • použití sondy • DNA, buněčná stěna, plazmatická membrána... mitochondriální aktivita - respirační vzplanutí, pH indikátory, membránový potenciál.. • Nepřímá vazba fluorochromu • Použití značky • navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, • phalloidin, annexin V... Nevlastní (vnější) fluorescence • Nepřímá vazba fluorochromu – ZNAČKY • značky jsou vázány k molekulám (proteiny, peptidy, oligonukleotidy..) kovalentní vazbou • proteiny – vazba na aminové (NH2-), thiolové (SH-) skupiny nebo histidinové řetězce požadavky • vysoká intenzita fluorescence • stabilita při ozařování • minimální vliv na biologické vlastnosti vzorku Nejčastěji používané převážně na protilátky Rhodaminy • Ex. 541, em. 572 Fluorescein isothiocyanate (FITC) • Ex. 495, em. 521 Rhodaminy • historicky nejpoužívanější fluorescenční značky • převážně na protilátky • ve formě derivátů • vysoký kvantový výtěžek 0,3-0,8 • photobleaching Fluorescein isothiocyanate (FITC) • Jasně zelený fluorofor • omezeně rozpustný ve vodě a v alkoholech • Používá se běžně jako fluorescenční značka ve fluorescenční mikroskopii • Vysoký kvantový výtěžek až 0,9 • Významně podléhá bělení (photobleachingu) Alexa Fluor Dyes (Molecular Probes) • sulfonovaný derivát rhodaminu • vyšší kvantový výtěžek - svítivost • zesílená fotostabilita (↓photobleaching) • pH stabilita • dlouhodobě stabilní • využití – živé buňky, tkáňové řezy, fixované preparáty • velký výběr rozsahu ex. a em. maxim • od UV po near-infrared oblast • označení podle vlnové délky zdroje excitačního záření Fluorescenční proteiny (GFP) GFP - Aequorea victoria Aequorea victoria Pomocí bodových mutací lze modifikovat excitační a emisní spektra Mutace S65T – EGFP (enhanced GFP) EGFP je základem pro další barevné varianty https://www.cell.com/trends/cell-biology/fulltext/S0962-8924%2898%2901434-2 Kvantové tečky (Quantum dots) Polovodičové fluorofory, CdS, CdSe, InP, InAs, PbSe Výhody Vysoký excitační koeficient Úzké emisní spektrum Poloha emisního spektra souvisí s velikostí částic Nedochází k vybělování Nevýhody Částice o velikosti několika nm Je důležité používat monodisperzní částice Chemicky inertní – při navázání funkčních skupin může fluorescence zmizet DOI:10.1007/s41061-020-0296-6 Výběr fluorochromu ➢ Zvážit jas fluorochromu ➢ Zvolit nejjasnější pro nejméně exprimované proteiny ➢ Vice versa - méně jasné pro nejvíce expr. Proteiny ➢ selektivita (např. sondy pro Ca2+ mohou vázat i Mg2+ , ...) Objektiv Světelný zdroj Vzorek Zaostřená rovina Epifluorescenční mikroskop (widefield) Exitace fluorochromu Epifluorescenční mikroskop (widefield) Objektiv Světelný zdroj – rtuť výbojka Oko/Kamera Polopropustné zrcadlo Vzorek Zaostřená rovina Fluorescenční Exitace fluorochromu a emise probíhá současně. Avšak barvy jsou odděleny poloprop. zrcadlem a filtrem Filtr Konfokální mikroskop Konfokální bodové clony Objektiv Světelný zdroj Fotodetektor Polopropustné zrcadlo Vzorek Zaostřená rovina Filtr Rozdíl mezi konfokální a epifluorescenční mikroskopií céva žilnatění listu pylové zrno epifluorescenční konfokální Laserová skenovací konfokální mikroskopie 3D rekonstrukce obrazu 200um jádra cytoskelet Live imaging časosběrná zobrazení buněk • Různé režimy zobrazení • Procházející světlo • Fluorescenční značení • Využití v medicíně • Analýzy změn chování buněk (morfologie, proliferace, apoptóza) • Evaluace vlivu rozpustných látek a substrátů (Stanovení toxických/podpůrných účinků) Apoptóza a mitochondrie Jaroš, Vinarský, UHE LF MU hESCControlhESC+Camptothecin Time [hours] Fluorescenční mikroskopie Kmenové buňky – diferenciace Fluorescenční mikroskopie Neuronální kmenové buňky Sox1, Sox2, Pax6, NeuroD1 Oct3/4, Nanog, SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 MAP2, Tuj1 BLBP, GFAPO1, O4 Fluorescenční mikroskopie funkční eseje - vápníková signalizace Bohaciakova, Jaros 3D fluorescenční mikroskopie https://www.youtube.com/watch?v=yk7TWOtrphM Zebrafish development Video SPIM mikroscopie - selective plane illumination microscopy Drosophila embryogenesis Vzorek je uložen v tubě a je rotován během snímání Rekonstrukcí obrazu lze pak vytvořit dynamický 3D model https://www.youtube.com/watch?v=yk7TWOtrphM Zebrafish development http://vimeo.com/51955484 - zebrafish http://phys.org/news/2012-06-life-fast-lane.html http://openspim.org/Welcome_to_the_OpenSPIM_Wiki