Pokročilé zobrazovací metody: Dvou foto nová, superrozlišovací a korelační mikroskopie Zuzana Sumbalová Koledová Dvoufotonová mikroskopie • Fluorescenční zobrazovací technika • Vhodná především pro zobrazování živých tkání do hloubky 1 mm • Dvoufotonová absorpce • 1931: Maria Goeppert-Mayer • 2 fotony rovnaké nebo rozdílné frekvence dokáží excitovat molekulu ze stavu 1 (základní) do stavu s vyšší energií v jedné kvantové události • Oba fotony musí zasáhnout molekulu během 1 femtosekundy - lasery produkující velice rychlé pulzy světla (80 MHz) s vysokou energií (150.000 W) Dvoufotonová mikroskopie nm VIS 1 Photon 2 Photon Excitation Emitted Fluorescence Wavelength (nanometers \f Energy (electron Volts) 2.5 Tradiční FM: Jeden foton 390-700 nm Po excitaci návrat do stabilního stavu za emise fotonu s nižší energií než excitační Dvoufotonová FM: dva fotony s dvounásobnou vlnovou délkou Po excitaci návrat do stabilního stavu za emise fotonu jako u ekvivalentu FM Excitace fluorescenčních barviček: Tradiční FM: 400-500 nm Dvoufotonová FM: 800-1000 nm http://www.signaltonoisemag.eom/allarticles/2018/9/17/dissecting-two-photon-microscopy Dvoufotonová mikroskopie 1990: Winfried Denk & James Strickler, laboratoř Dr. Watt W. Webb (Cornell University) dvoufotonová absorpce + laserový skener Galvan nmeter-d rive field X-Y mirror EST ffi^ J_L NB filter 685 nm PMT2 V «■ ■MT dichruic IR-blocking filter * i v scan I_Lj_ i* tube lens " -NB filter 525 nm a I ST Brn IN PMT1 [Piezoelectric translator 5« Objective lens b I « specimen DOI: 10.1063/1.4825319 Dvoufotonová mikroskopie • Výhody: • Delší vlnové délky se méně rozptylují než kratší-vysoké rozlišení • Fotony s nižší energií způsobují méně škod v tkáni/vzorku • Detekce fotonů je účinnější než u konfokální mikroskopie - i rozptýlené fotony přispívají k použitelnému signálu • Nevýhody: • Vyšší pořizovací náklady • Dvoufotonové absorpční spektrum molekuly se může signifikantně lišit od jejího jednofotonového absorpčního spektra Dvoufotonová mikroskopie - barvičky -velmi vysoká účinnost dvoufotonová absorpce 100,000 Klasické fluorescenční proteiny - CFP, GFP, YFP, RFP Squarainové barvy (Seta-670, Seta-700, Seta-660) Squarainové rotaxany (SeTau-647, Se-Tau 665) 1 a> 10,000 CO https://www.setabiomedicalsxom/2-photon-microscopy.html Dvoufotonová mikroskopie: použití • Embryologie a vývojová biologie, fyziologie, neurobiologie, výzkum rakoviny, tkáňové inženýrství • https://www.voutube.com/watch?v=Pmw-KGgM eo Superrozlišovací mikroskopie • Techniky světelné mikroskopie, které umožňují vyšší rozlišení než je difrakční limit Superrozlišovací mikroskopie Axial resolution Standing-wave excitation F Lanni SMLM concept GFP blinking E Betzig WE Moerner l5M concept M Gustafsson, DA Agard, JW Sedat 1994 1999 Lateral resolution 3-dimensional Live-cell Tissue & multiplexing Combinatorial 3D-SIM Time-gated STED M Gustafsson, JW Sedat JR Motfitt / SW Hell MINFLUX ROSE F Balzarotti, SW Hell T Xu, W Ji STED microscopy SW Hell SIM M Gustafsson PALM E Betzig. H Hess FPALM S Hess STORM MJ Rust. M Bates. X Zhuang 2005 2007 3D STORM B Huang. X Zhuang Biplane FPALM S Hess, J Bewersdorf dSTORM M Heilemann, M Sauer 2009 2010 RESOLFT S Jakobs, SW Hell Fast 3D-SIM M Gustafsson Bessel beam E Betzig 2013 LLS 4Pi-SMS E Betzig J Bewersdorf Conical diffraction GY Sirat, SL Shorte Exchange PAINT R Jungmann. P Yin 2015 SIMPLE S Wieser SIMFLUX C Smith, B Rieger S Stalinga ModLoc S. Lévéque-Fort 2018 2021 1993 4Pi concept SW Hell, E Stelzer 1995 1997 STED concept SW Hell 4Pi microscopy SW Hell, E Stelzer 2000 2006 2008 2011 Modulated excitation microscopy Pointillism microscopy R Heintzmann, C Cremer KA Lidke, R Heintzmann l5M 3D CW-STED M Gustafsson. DA Agard, JW Sedat SW Hell sptPALM SOFI J Lippincott-Schwartz J Enderlein STED-FCS C Eggeling. SW Hell iPALM DNA PAINT H Hess P Tinnefeid, FC Simmel DH-PSF R Piestun, WE Moerner iSIM A York, H Shroff 2014 2017 ExM ES Boyden TIRF-SIM E Betzig 2019 Nobel Prize Chemistry E Betzig. SW Hell, WE Moerner RIM T Mangeat, A Sentenac Hessian SIM S Tan, L Chen GI-SIM J Lippincott-Schwartz, E Betzig, D Li Commercial instruments API/GE OMX 3D-SIM Zeiss Elyra PALM/SIM Leica 4Pi Leica GSD Abberior STED Leica 3D STED Zeiss Airyscan 3i LLS VisiTech iSIM Yokogawa SoRa Zeiss Elyra 7 SIM2 2006 2010 2012 2016 2018 2019 2003 2009 2011 2014 2017 2020 Leica STED Nikon N-SIM Nikon N-STORM GE OMX Blaze Leica gated STED Abbelight SAFe Abberior STEDYCON Bruker Vutara Confocal.nl RCM ONI Nanoimager Abberior MINFLUX Genoa Instruments PRISM BioAxial CODIM Nikon N-SIM S Kirti P, Benedict D, Rainer H, Lothar S. Phil. Trans. R. Soc. A.2022 http://doi.org/10.1098/rsta.2021.0110 Superrozlišovací mikroskopie: SIM Strukturní iluminační mikroskopie (SIM) • Excitace struktury neuniformním světelným vzorem - posun v prostorových frekvencích vzorku, vznik „Moiré fringes" • 3D SIM: laterální posun iluminační mřížky (5 fází), 3 úhly, záznam prostorově modelovaných obrazů Conventional illumination Y Structured illumination 3 angles 5 phases 120 #// M// 240 ^ Resolution Enhancement Y Y *—X * ■ "x- - • ( * x ) • (e) Superrozlišovací mikroskopie: SIM • Strukturní iluminační mikroskopie (SIM) • Excitace struktury neuniformním světelným vzorem - posun v prostorových frekvwencích vzroku, vznik „Moiré fringes" • 3D SIM: laterální posun iluminační mřížky (5 fází), 3 úhly, záznam prostorově modelovanách obrazů Superrozlišovací mikroskopie: STED • Stimulovaná deplece emise • Dva pulzy laseru: excitační a Ar - Laterální rezoluce A-FWHM/PSF Imax ~ vrcholová intenzita STED laseru /s- hraniční intenzita púro saturovanou depleci emise STED • FWHM Ar A Superrozlišovací mikroskopie: STORM, PALM, FPALM • Stochastická optická rekonstrukční mikroskopie (STORM) • Fotoaktivační lokalizační mikroskopie (PALM) • Fluorescenční PALM (FPALM) • Sekvenční aktivace a časově rozlišená lokalizace fotopřepínatelných fluoroforů a b c Nature Photonics, 2009 Superrozlišovací mikroskopie SIM PALM/STORM Nenáročná příprava vzorků Náročná příprava vzorků Možnost použití konvenčních fluoroforů Fotoaktivovatelné fluorofory, Alexa, Atto Snímaní živých dějů Vhodné zejména pro fixované preparáty Rozlišení cca 80-100 nm (x,y), 250 nm (z) Rozlišení 10-20 nm (x,y), 50 nm (z) Vysoká rychlost Korelační mikroskopie • Kombinace dvou technik mikroskopie pro analýzu toto samého vzorku • Nejčastěji světelná a elektronová • CLEM: korelační (C) světelná (L) a elektronová (EM) \ / kontext + vysoké rozlišení Korelační mikroskopie 1. DNA transfection of cells grown on 2. GFP-based time-lapse confocal microscopy CELLocate coverslip. and fixation of the cells. Korelační mikroskopie kroskopie; Kommnick, C, Lepper, A. & Hensel, M. Sci Rep 9, 17079 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-53085-6 Korelační mikroskopie A-12:43 -01:16 00:00 1 00:25 00:51 01:16 01:42 02:07 02:33 I 2:58 03:23 03:49 Konfokální + skenovací elektronová mikroskopie; Infekce epitelových buněk salmonelou Polarized Lifeact-eGFP MDCK cells (green) were infected with STM WT (red). Kommnick, C, Lepper, A. & Hensel, M. Sci Rep 9, 17079 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-53085-6 Korelační mikroskopie Konfokální + skenovací elektronová mikroskopie; Infekce epitelových buněk enteropatogenní E. coli (EPEC) Polarized Lifeact-eGFP MDCK cells (green) infected with EPEC (red) Kommnick, C, Lepper, A. & Hensel, M. Sci Rep 9, 17079 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-53085-6