Úvod do elektronové mikroskopie Josef Jaroš Srovnání rozměrů a rozlišení Atom vodíku = 0,529-10 m = 0,05 nm Jádro atomu = 10-15 m = 1 fm Co je elektronová mikroskopie • EM je diagnostický nástroj , který umožňuje unikátní vhled do – morfologie vzorku • tvar a velikost částic (TEM) – topologie • povrchové vlastnosti (SEM) – struktury, uspořádání • krystalografické vlastnosti (Elektronová difrakce) – složení materiálů • prvkové složení (Analytická EM) Elektronová mikroskopie, spolu s využitím rentgenového záření a dalších technik, významně podpořila vznik oboru molekulární biologie. Proč elektrony? • Elektron má náboj – negativní • Elektron je velmi lehký - 1800x lehčí než jaderné částice • Je výrazně jednodušší elektrony uvolnit z orbitalů => je možné elektrony urychlit v elektrickém poli • Když se uvolní elektrony z atomů ve vakuu, chovají se jako světlo • Napětím lze regulovat délku vlny elektronu • Při 100 kV je vln délka 0,0038 nm. • Ačkoliv v současnosti jsou TEMy využívány s rozlišením 0,1 nm. Vyšší rozlišení znamená technické obtíže – vibrace atomů v pevných látkách rozmazávají obraz s limitem okolo 0,03-0,07 nm. Atom vodíku = 0,529-10 m = 0,05 nm Jádro atomu = 10-15 m = 1 fm Proton Neutron Elektron λ - vlnová délka U – el. napětí Jak je rozlišovací schopnost ovlivněna vlnovou délkou © 2013 FEI dlouhá vlna krátká vlna Zdroj elektronů (elektronové dělo) • Zdrojem elektronů je ohnutý vodičvlákno, kterým protéká proud – to je katoda – Nejčastější materiály vlákna • Wolfram (W) • Thermionin (LaB6) • Schottky (ZrO/W) – Rozdíly jsou v ceně a vlastnostech – zejména jasu • Elektrony v ohybu vypadávají, proletují štěrbinou wehneltova válce a následně skrze jsou urychleny k anodě a skrze štěrbinu opouští zdroj do vakuovaného tubusu. Shottkyho vlákno Směřování elektronového paprsku • Svazek elektronů soustředí kondenzorová „čočka“ (elektromagnetická cívka) na preparát • „čočky“ = elektromagnetické cívky objektivu směřují elektrony, které prošly preparátem, na fluorescenční stínítko nebo speciální kameru, kde se vytváří obraz. • Stínítko umožňuje převedení elektromagnetického vlnění na světlo. Kondenzorová čočka Vzorek Řez tkáně Čočka objektivu Čočka okuláru Čočka projekční Zdroj elektronů Zdroj světla (lampa) Fluorescenční stínítko nebo/a kamera Oko nebo kamera Obraz pozorovaný okem Obraz pozorovaný na stínítku Světelná mikroskopie Transmisní elektronová mikroskopie Elektrony dopadají na vzorek • Schémata interakce elektronů s hmotou po jejich dopadu • Pro TEM musí být preparát dostatečně tenký, aby elektrony prošly • Elektrony, která vzorkem projdou – ale nereagují s ním, vytváří na fluorescenčním stínítku / kameře světlé body 123 1 Elektronový svazek (primární elektrony) E0 = 0,1-30 keV Vzorek Rozptyl elektronů Sekundární elektrony E ≤ 50 eV Odražené elektrony 50 eV < E ≤ E0 Auger/Rentgen/ Katodoluminiscence + - - - - - Atom vzorku Primární elektrony Neelastický rozptyl elektronů (malý úhel) E= E0 -dE Elastický rozptyl elektronů (velký úhel) E= E0Průchod elektronů bez rozptylu E0 Elektrony dopadají na vzorek • Schémata interakce elektronů s hmotou po jejich dopadu • Pro TEM musí být preparát dostatečně tenký, aby elektrony prošly • Elastický rozptyl ohybem dráhy v blízkosti jádra způsobí odklonění elektronů – žádná energie není z elektronu přenesena do vzorku – el. nedopadnou na stínítko a jsou registrovány jako tmavá místa vzorku – tento rozptyl je pro TEM zásadní 2 Elektronový svazek (primární elektrony) E0 = 0,1-30 keV Vzorek Rozptyl elektronů Sekundární elektrony E ≤ 50 eV Odražené elektrony 50 eV < E ≤ E0 Auger/Rentgen/ Katodoluminiscence 123 + - - - - - Atom vzorku Primární elektrony Neelastický rozptyl elektronů (malý úhel) E= E0 -dE Elastický rozptyl elektronů (velký úhel) E= E0Průchod elektronů bez rozptylu E0 Elektrony dopadají na vzorek • Schémata interakce elektronů s hmotou po jejich dopadu • Pro TEM musí být preparát dostatečně tenký, aby elektrony prošly • Neelastický rozptyl elektronů – reakce s elektrony vzorku – způsobuje malý odklon elektronu a tyto vytváří v obraze vzorku nespecifické rozmazání – pro TEM je nežádoucí – navíc část energie z elektronu je přenesena do vzorku, tzn. – změní se vlnová délka elektronu Pozn. Při srážce elektronu s jádrem dochází k produkci rentgenového záření 3 123 + - - - - - Atom vzorku Primární elektrony Neelastický rozptyl elektronů (malý úhel) E= E0 -dE Elastický rozptyl elektronů (velký úhel) E= E0Průchod elektronů bez rozptylu E0 Elektronový svazek (primární elektrony) E0 = 0,1-30 keV Vzorek Rozptyl elektronů Sekundární elektrony E ≤ 50 eV Odražené elektrony 50 eV < E ≤ E0 Auger/Rentgen/ Katodoluminiscence https://is.muni.cz/do/rect/el/estud/lf/js19/mikroskopicky_atlas/web/index.html TEM vzorku kosti (tkáň byla kontrastována těžkými kovy) Většina eletronů prošla tímto místem až na stínítko V místě membrány buňky je vyvázán těžký kov, který způsobil odklon většiny elektronů, nebo jeho pohlcení Skenovací elektronový mikroskop (SEM) Kondenzor Vzorek Řez tkáně Čočka objektivu Čočka okuláru Čočka projekční Zdroj elektronů Zdroj světla (lampa) Kondenzor Vychylovací Cívka (Usměrňovač svazku) Detektor odražených elektronů Čočka objektivu Zpětně odražené elektrony Stínítko nebo kamera Oko nebo kamera Pokovený vzorek Obraz pozorovaný okem Obraz pozorovaný na stínítku Světelná mikroskopie Transmisní elektronová mikroskopie Skenovací elektronová mikroskopie Obraz pozorovaný na obrazeovce Směřování paprsku u SEM • kondenzorová „čočka“ (elektromagnetická cívka) soustředí svazek elektronů do malého místa-“bodu“ (méně než 4 nm v průměru) na preparátu • směřování svazku elektronů je regulováno usměrňovačem svazku, což umožňuje skenování preparátu řádek po řádku • z povrchu pozorovaného objektu jsou vyráženy sekundární elektrony, které jsou zaznamenávány detektorem elektronů • obraz povrchu pozorovaného objektu vzniká podobně jako u skeneru – rastrováním povrchu elektronovým svazkem TEM SEM Elektronový svazek široký, statický fokusovaný do bodu, vychylovaný řádek po řádku Urychlovací el. napětí v rozsahu 60-300.000 voltů Urychlovací napětí mnohem nižší, netřeba penetrovat vzorek (100 V) Interakce elektronů Vzorek musí být velmi tenký (50 nm) Možné skenovat široké spektrum vzorků - jednoduchá příprava Snímání Elektrony musí projít skrze vzorek Potřebná informace je získána v blízkosti povrchu vzorku Vyobrazení Svazek elektronů je zaostřený na stínítko čočkou objektivu a zvětšeny k vytvoření obrazu Obraz je vytvářen v průběhu rastrování (řádkování) povrchu vzorku Srovnání TEM a SEM Elektronová mikroskopie buňky SkenovacíTransmisní 2 μm 50 μm 1934 - první TEM • 1934 první TEM • Ernst Raska - University of Berlin • 1938 – první obrázek viru • 1986 – Nobelova cena • Rozlišení 100 nm • Zvětšení 400x • V Československé republice • 1949 – první český EM v Tesle Brno prof. Armin Delong FEI 2020 – TEM – Titan FEI • Dosažen teoretický limit prostorového rozlišení 0,05 nm • Precizně nastavitelné parametry pro specifická vlákna, řízení vakua, napětí • Zpřesnění manipulace se svazkem elektronů – kolimátory, redukce sférické a chromatické aberace • Digitální kamery, fotonásobiče Získávání 3D struktur v kapalině s atomárním rozlišením. Schéma znázorňuje kapalný vzorek umístěný mezi dvěma listy grafenu. Nanočástice v kapalině volně rotují, zatímco TEM pořizuje tisíce snímků nanočástic. Snímky se pak analyzují a určují polohu každého atomu v každé nanočástici. 3D snímky částic platiny o průměru 2-3 nm rotujících v kapalině pod elektronovým mikroskopem. Každá nanočástice má přibližně 600 atomů. Bílé kuličky označují polohu každého atomu v nanočástici. Měřítko 1 nm. https://analyticalscience.wiley.com/do/10.1002/was.00020045 2020 - Ukázka lokalizace atomů v nanočásticích Metody přípravy biologického materiálu pro TEM Standardní metody: • ultratenké řezy • metoda negativního kontrastování • imunoznačení • freeze fracture and etching (mrazové lámání a leptání) • stínění kovem Specializované metody: • kryo- transmisní elektronová mikroskopie Příprava vzorků pro TEM - ultratenké řezy • Vzorek musí být velmi tenký (50 nm) a pro elektrony prostupný • Nejčastěji se připravuje zaléváním do pryskyřice a poté se upravuje krájením řezů o požadované tloušťce, které se „dobarvují“ těžkými kovy, či protilátkami s navázanými nanočásticemi kovu (Au, Ag) Fixace - aldehydy (zejména glutaraldehyd) - cílem je stabilizovat preparát (1 mm3) co nejblíže nativnímu stavu Postfixace - OsO4 – šetrně a jemně gelifikuje intracytoplazmatické proteiny, dobře zachovává strukturu biologických membrán a nadto stabilizuje a kontrastuje lipidy - vysoce toxická látka Odvodnění - vzestupná řada alkoholu, aceton Prosycení a zalévání - vzorek je prosycen rostoucí koncentrací pryskyřice – dle typu tkáně a použité techniky snímání. • na epoxidové bázi – e.g. Durcupan • na akrylátové bázi – e.g. LR White • na polyesterové bázi - Vestopal W Nejčastěji LR White. vzorek zalitý v pryskyřici Černý díky postfixaci v OsO4 Příprava vzorků pro TEM - ultratenké řezy Polymerace – Vzorek přenesen do formy a přelitý vytvrzen teplem nebo ozářením UV světlem Krájení – vzorku v pryskyřici ultramikrotomem na hladinu dH2O. Přenesení vzorku – Na mřížky (síťky) potažené formvarovou blánou se naberou z hladiny ultratenké řezy a následuje mikroskopie Nosné mřížky (síťky) Příprava vzorků pro TEM - ultratenké řezy Mřížka Držák mřížky-vzorku Držák mřížky-vzorku Oxid osmičelý – lipidy (membrány) Octan uranylu - nukleové kyseliny a proteiny Citrát olova – (precipitát, zrna) – membrány, nukleové kyseliny, glykogen (Pozitivní) Kontrastování ultratenkých řezů Bez s kontrastováním Ultratenké řezy Ultratenké řezy mají minimální kontrast. Ten zvýšíme adsorpcí těžkých kovů na buněčné struktury. . Používají se převážně kovy, které dovedou zvýšit rozptyl primárních elektronů: U, W, Pt, Pb a Mn, nazývané též elektronová barviva. OsO4 • lokalizace antigenu na vzorku probíhá navázáním specifické primární protilátky a následně označený pomocí sekundární protilátky značené těžkým kovem (ferritin, částice koloidního zlata, stříbra. aj.) • Značeny jsou ultratenké řezy – vzorky fixovány, odvodněny a zality do hydrofilních pryskyřic • velikost nanočástic 3-40 nm Imunoznačení pro TEM Primární protilátka anti-aktin produkovaná v myši Anti-myší sekundární protilátka značená částicemi koloidního zlata Imunoznačení v EM Nanočástice Vzorek tkáně - Lidská buňka Protein Jádro Imunocytochemie Imunoznačení zlatem - lokalizace specifického antigenu pomocí částic koloidního zlata (3-40 nm) navázaných na sekundární protilátku Imunoznačení periplazmatického prostoru ultratenkých kryořezů Escherichia coli konjugátem zlata s proteinem A. https://www.emsdiasum.com/microscopy/products/immunogold/im munogold.aspx Imunogold barvení vzorku rotavirům podobných částic v transdukovaných buňkách rVLPs pomocí polyklonální protilátky a sekundární protilátky spojené s 12 nm koloidním zlatem. Měřítko = 100 nm. http://www.microscopy.cz/html/2141.html Negativní kontrastování • Je určena pro pozorování vzorků jejichž velikost je hluboko pod tloušťkou ultratenkých řezů, např. různých biologických makromolekul (proteinů, lipoproteinů, polysacharidů, nukleoproteinových komplexů), isolovaných buněčných organel (mitochondrie, membránové systémy) a celých buněk (bakterie, viry). • Smíchání vzorku v roztoku s fixačním roztokem – kyselina wolframová – uranyl acetát, etc. • Nanesení na mřížku, zaschnutí, pozorování • Rychlá metoda • Kontrastovací látka obalí a zčásti penetruje vzorek. Díky rozdílu hustoty ve vrstvě kontrastovací látky na vzorku a v okolí se pak částice jeví v některých oblastech transparentní. Okolo částic je charakteristické tmavé ohraničení způsobené vzlínáním kontrastovací látky http://cryoem.life.tsinghua.edu.cn Stínění kovem • Stínování spočívá v pokrývání preparátu tenkou vrstvou kovu. Při pokovování je preparát nakloněný, což zajistí zvýraznění jemných fibrilárních struktur a detailů malých makromolekul, např. kolagenu, DNA, RNA, ribozomů nebo buněčné stěny. • pokovování se provádí ve vakuu (10-4 Pa) pokovovačka s komorou pro vytvoření podtlaku vzorek podložka Stínování – pokrytí těžkým kovem pod úhlem Zpevnění naprášením uhíkové vrstvy Stínění kovem - výsledný obraz DNA Polio virus Mrazové lámání a leptání Freeze fracturing and etching • Fixace, nahrazení části vody v preparátu kryoprotektivem (PEG) • Zmrazení v tekutém freonu (-160°C), přenesení do tekutého dusíku (-196°C) • Lom vzorku (aparatura pro mrazové lámání, vakuum, -190°C) • Odsublimování části vody z lomné plochy při (etching, -100°C) • Pokovení lomné plochy: Pt (pod úhlem 45°) a C (pod úhlem 90°) - vytvoření tzv. uhlíkové repliky (20 nm) • Čištění replik - odstranění veškerého biologického materiálu kyselinami • Přenos řezů na nosné síťky s formvarovou blánou, pozorování Metoda pro zobrazování povrchu lomných ploch membránových struktur http://www.tobiasrose.co.uk/mrbevis/ebpf.html Platinum Carbon nůž Rovina lomu Uhlík Platina Sublimace Leptání Pokovení Lámání Plasmatická membrána Cytoplasmatická vrstva Extracelulární vrstva Proteiny nůž Kvasinka Saccharomyces cerevisiae Mrazové lámání a leptání - výsledný obraz jádro cytoplasma mitochondrie póry v jaderné membráně Leukemická buněčná linie HL-60 Mrazové lámání a leptání - výsledný obraz detailního pozorování povrchu jaderné membrány živočišná buňka - freeze-etchingživočišná buňka - ultratenký řez TEM Srovnání ultratenkého řezu a repliky z freeze-etching 3D elektronová mikroskopie TEM tomografie Nakláněním (otáčením) vzorku v mikroskopu a následným prosvěcováním eletronovým svazkem, je získána série obrazů, ze kterých je zpětnou projekcí vytvořena 3D morfologie objektu. Technika poskytuje vysoké rozlišení, ale je limitována velikostí analyzovaných objektů. Řádově desítky nm. Proto se využívá pro analýzy struktury molekul, proteinů, krystalů. Zejména pro krystalografii má své výhody vzhledem k tomu, že lze vynechat nezbytný krok krystalizace vzorku. Při využití technik kontrastování biologických vzorků dochází ke vzniku množství artefaktů. Proto se v současnosti technika tomografie využívá nejvíce v souvislosti s Cryo-eletronovou mikroskopií, při které je vzorek pozorován za nízkých teplot (- 180oC) bez nutnosti kontrastování. Viz následující přenášky. https://www.youtube.com/watch?v=nvXuq9jRWK E&feature=youtu.be&t=40 Příprava vzorku je obdobná jako pro transmisní EM, avšak řezy jsou kladeny na fólii jeden za druhým. Z milimetru tkáně je získáno vice než 10 tisíc vzorků. Tyto jsou následně skenovány pomocí SEMu a z obrazů je vytvořena 3D rekonstrukce. 3D elektronová mikroskopie Síťová tomografie (Array tomography) SBF-SEM a FIB-SEM Serial block-face SEM Focused ion beam SEM SBF-SEM FIB-SEM Obraz seříznutého bloku sféroidu s buňkami v SEMu Ohraničením objektů zájmu v každém obrazu – segmentace lze následně vytvořit 3D obraz SBF-SEM – 3D rekonstrukce obrazu buněk a organel sféroidu Využití EM • Věda (biologie, chemie – např. ke kvantitativní • prvkové analýze, geologie ...) • Lékařství (studium bakterií a virů ...) • Soudní lékařství (forensní EM) • Metalurgie (studium vlastností materiálů) • V mikroelektronice (studium čipů, mikroprocesory) Nevýhody EM • Drahý a prostorově náročný přístroj • Pozorování jen ultratenkých řezů (náročné na přípravu preparátů) • Umístění preparátu ve vakuu znemožňující pozorování živých organismů