Chemická a morfologická analýza moče Miroslava Beňovská Historie •1500 př.n.l. – Egypťané zjistili, že někteří pacienti mají zvýšený objem moče, která přitahuje mravence •V 6.stol. – Indové zjistili, že sladká moč je spojena s nemocí •V r.1674 – anglický lékař Thomas Willis zařadil ochutnávání moče do rutinní praxe a zavedl pojem Diabetes mellitus http://3.bp.blogspot.com/_ijVOsJdq68M/TSE_K0pEyUI/AAAAAAAAAG0/LmphTBOURCU/s1600/1-2UrineFlask.jpg http://i.dailymail.co.uk/i/pix/2012/09/10/article-2201221-14F06618000005DC-679_312x486.jpg Analýza moče •Chemická analýza moče • •Automatická morfologická analýza moče nebo mikroskopické vyšetření močového sedimentu • Chemická analýza moče • •Automatizace od 80. let minulého století •Přístroje využívají stanovení parametrů pomocí diagnostických proužků (suchá chemie) •Semikvantitativní stanovení bilirubinu, urobilinogenu, bílkoviny, ketonů, hemoglobinu, leukocytů, dusitanů, pH, glukosy a specifické hmotnosti •Standardizace měřící procedury •Namáčení proužků x pipetování na jednotlivé reakční zóny •analýza na principu reflexní fotometrie Diagnostické proužky •Matrice pro suchá činidla - Impregnovaná vlákna • •Analyzovaný vzorek (moč) je aplikován na povrch pevné fáze •Difunduje do její matrice a rozpouští suché činidlo, které je v matrici dispergováno • •Rozpuštěné činidlo reaguje s analyzovanou látkou za vzniku barevného produktu • •Výsledné zbarvení na povrchu pevné fáze je sledováno vizuálně nebo instrumentálně Celulózová impregnovaná vlákna •Celulózová matrice (firma Bayer – Siemens) porézní či polopropustná • •Reagencie v suché formě distribuovány - do matrice - na povrchu matrice •Postupná impregnace a zasoušení jednotlivých činidel • •Činidla oddělena separační vrstvou polymeru (ta při hydrataci praskne) Reflexní fotometrie Impregnovaná vlákna mají vysokou opacitu (neprůhlednost) Ke stanovení jejich zbarvení nutno využít reflexní fotometrii - měření ze stejné strany jako nanesen vzorek, ale na jiném místě (Roche, vhodné i pro plnou krev – přístroj Reflotron) - měření z opačné strany než aplikován vzorek (vícevrstvé filmy) Chemická analýza moče •Reflexní fotometrie: •zdroj světla - světlo emitující diody •emitují světlo o různých přesně definovaných vlnových délkách – světlo pak dopadá v různých úhlech na reagenční zóny diagnostického proužku •světlo je odráženo na fotodiodu , která slouží jako detektor •intenzita odraženého světla závisí na vybarvení reakční zóny (od bílé zóny se odráží prakticky 100%, čím tmavší zóna, tím víc světla je absorbováno) Chemická analýza moče •semikvantitativní analýza •diagnostické proužky •malá pracoviště ručně, • velké klinické laboratoře na automatech •proužky používané v ČR - Hepta(Okta)Phan (Pliva-Lachema Diagnostika), Combur (Roche Diagnostic), Aution Sticks (Arkray) •10 zón (+ kompenzace) •odčítání po 60 – 90 s • Principy jednotlivých stanovení: Specifická hustota (hmotnost): -na automatech se zóna nevyužívá (provádí se refraktometricky) -pomocí koncentrace iontů v moči -koreluje dobře s refraktometrickým stanovením -v přítomnosti kationtů jsou protony uvolněny komplexotvorným činidlem -mění barevu bromthymolové modře od modré přes modrozelenou ke žluté -při pH =7 a více připočíst hodnotu 5 kg/m3 -bílkoviny v koncentraci 1 - 5 g/l nebo ketoacidóza hustotu zvyšují - pH: -měřeno pomocí acidobazických indikátorů methylová červeň, fenolftalein a bromthymolová modř -kombinace indikátorů umožňuje změnu barvy testační zóny od oranžové přes zelenou na modrou v závislosti na pH moče. • • Nitrity: •vznik dusitanů redukcí dusičnanů vlivem patogenních mikrobů •na principu Griessovy reakce - dusitanový anion s aromatickým aminem v kyselém prostředí tvoří diazo-sloučeninu •ta kopuluje s vhodnou látkou na červené azobarvivo. •již slabé růžové zbarvení indikuje značnou bakteriurii •falešně negativní výsledky mohou být způsobeny léky • (Antibiotika vysadit tři dny před testem) • • • Bílkovina: •přítomnost proteinů - změna barvy acidobazického indikátoru •test je citlivý na albumin, podstatně nižší citlivost vykazuje vůči globulinům, mukoproteinům a Bence-Jonesově bílkovině. •falešná pozitivita - léky, dezinfekční prostředky obsahující kvartérní amoniové soli • Glukosa: •na principu enzymové reakce glukosooxidáza/peroxidáza •glukosa je enzymaticky oxidována na glukonolakton •v přítomnosti peroxidázy peroxid vodíku oxiduje indikátor za vzniku zelené barvy •test je specifický pro stanovení D-glukózy, ostatní cukry nedávají pozitivní reakci. •při koncentraci glukózy 5,5 mmol/l a vyšší, neovlivňuje výsledky stanovení ani vyšší koncentrace kyseliny askorbové. •test je specifický pro glukosu, ostatní cukry nereagují • • • Ketony: •test je založen na Legalově reakci •ketolátky reagují s nitroprusidem sodným v silně alkalickém prostředí do fialova •reakce je citlivější na kyselinu acetoctovou než na aceton • • Bilirubin: •test je založen na kopulaci bilirubinu s diazoniovou solí •vznik růžového zbarvení testační zóny • • • Urobilinogen: •reaguje se stabilní diazoniovou solí v kyselém prostředí •vznik červeného azobarviva •vzorky moče chránit před přímým slunečním světlem •jinak nižší nebo falešně negativní výsledky • Leukocyty: •na základě přítomnosti esteráz granulocytů •tyto enzymy štěpí ester indoxylu na indoxyl, který dává s diazoniovou solí barevný fialový produkt •test není ovlivněn přítomností bakterií, trichomonád a erytrocytů v •zeslabení reakce - bílkovina v koncentraci nad 5 g/l a • glukóza nad 111 mmol/l • léky (gentamycin) • • Erytrocyty: •erytrocyty jsou hemolyzovány na hemoglobin •ten spolu s myoglobinem katalyzuje oxidaci indikátoru (organický hydroperoxid) – v přítomnosti pseudoperoxidasy •ze žluté na zelenomodrou •lze detekovat mikrohematurii •kyselina askorbová neinterferují • • Další zóny – kompenzace, turbidita Historie •fyzikální vlastnosti moče (barva, zápach) • •klasické chemické reakce ve zkumavce – • - stanovení bilirubinu s alkoholickým roztokem jódu- vznik zeleného prstence biliverdinu • -reakce s Ehrlichovým činidlem – azokopulační reakce diazoniové soli – vznik červeného zbarvení s urobilinogenem a porfyriny Hodnocení chemické analýzy moče č.met. analyt arbitrární jednotky 0 +- 1 2 3 4 144 leukocyty (elem/ul) neg 25 75 250 500 118 nitrity (dusitany) neg +1 +2 122 bílkovina (g/l) neg 0,15 0,3 1,0 3,0 10,0 123 glukóza (mmol/l) norm 3 6 12 30 60 124 ketony (mmol/l) neg 1,5 4 8 15 125 urobilinogen (µmol/l) norm 35 68 150 >150 126 bilirubin (umol/l) neg 8,5 35 100 >100 127 krev-ery (mg/l) neg 0,6 2 10 absolutní hodnoty 147 hustota (g/ml) 1,000 1,005 1,010 1,015 1,020 1,025 1,030 121 pH 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 •Referenční interval: hustota 1.010 – 1.025g/ml •posouzení zřeďovací a koncentrační schopnosti ledvin •přesnější je vyšetření osmolality moče • • •Referenční interval: pH 5,0 – 6,5 •vliv potrava (rostlinná alkalizuje, živočišná naopak acidifikuje) •vliv chronické poruchy acidobazické rovnováhy, léčiva. •alkalické pH patologické • Příčiny: •bakteriální infekce ledvin a močových cest (pozor na arteficiální pomnožení bakterií při delším skladování moči v teplém prostředí!), •renální tubulární acidóza • Referenční interval: nitrity negativní •průkaz svědčí pro uroinfekci (většina bakterií způsobujících močové infekce redukuje nitráty na nitrity). •vyšetření lze použít ke kontrole účinku léčby • • • Referenční interval: bílkovina negativní •prerenální proteinurie • vysoká konc. bílkoviny o malé molekule - projde glomerulem: hemoglobin, myoglobin, Bence-Jonesova bílkovina • zdravé ledviny •renální proteinurii • při onemocnění ledvin: glomerulární • - selektivní – poškození mírné, ztráta negativního náboje glomerulární membrány vazbou kyseliny sealové (albumin a bílkoviny o molekulové hmotnosti do 100 tisíc) • - neselektivní – poškození větší (prochází i bílkoviny o největší molekule) • tubulární • - nedostatečné vstřebávání proteinů, které prošly glomerulem (mikroproteiny - a1 a b2-mikroglobulin). • při intoxikaci – sloučeniny Cd, Hg • smíšená •subrenální proteinurie (bílkovina pochází z močových cest) – při zánětech • doprovází ji leukocyturie. • Referenční interval: glukóza normální •reabsorbována tubulárními buňkami ledvin •renální práh (9 – 10 mmol/l) - glykosurie • Příčiny : •hyperglykémie (diabetes mellitus) •snížený renální práh pro glukózu •těhotenství (zvýšení glomerulární filtrace + snížení renálního prahu) • • • Referenční interval: ketony negativní •vznik při získávání energie z mastných kyselin • Příčiny: •hladovění (nedostatek sacharidů, rychle u dětí), •diabetes mellitus •při tkáňové hypoxii ( šok) - falešně negativní • rovnováha mezi kyselinou acetooctovou a b- hydroxymáselnou je posunuta na stranu kyseliny b- hydroxymáselné – ta nereaguje • Referenční interval: urobilinogen normální • Příčiny: •funkční nedostatečnost jater – hepatální ikterus •překročení funkční kapacity jater – prehepatální ikterus (hemolytické anémie, krvácení do GIT, …) • • • Referenční interval: bilirubin negativní •bilirubin v moči pozitivní při zvýšení přímého (konjugovaného) bilirubinu v plazmě •u obstrukčních a hepatálních ikterů • • Referenční interval: leukocyty negativní • Příčiny : •bakteriální zánět močových cest nebo ledvin • • • • Referenční interval: krev - erytrocyty negativní •Hematurie - makroskopická • mikroskopická (okem ji nevidíme). • Příčiny : •Renální (glomerulonefritida, nádor ledvin) •Prerenální (hemoglobinurie a myoglobinurie – hemolýza, svalová traumata, popáleniny) •Subrenální (krvácení do močových cest – zánět, kámen, nádor; hemoragická diatéza) •Ponámahová – fyzická námaha, chlad • Močový sediment, mikroskopické vyšetření • • Specifikace vzorku : • první nebo častěji druhá ranní moče •v noci zakoncentrování - patologické hodnoty nejvýraznější • močové proteiny a uráty méně rozpustné - hodnocení zejména válců a krystalů kyseliny močové zatíženo menší chybou •během dne příjmem potravy moč alkalizuje • vliv diuretik •druhá ranní moč - elementy neleží dlouho v močovém měchýři, nedochází k jejich rozpadu • Příprava pacienta : •běžný příjem tekutin •omytí genitálií vodou – ne desinfekcí •středního proud moče (mimo období menstruace) • • • Příprava analytického vzorku – manuální provedení: •sediment z 4 ml nativní moči •odstředěním při 2000 rpm, 5 minut, pokojová teplota •speciální zkumavky k tomuto účelu •supernatant odlít - zbývá 0,4 ml zahuštěné moče • Mikroskopické vyšetření: •10x zakoncentrovaná moč •400 násobném zvětšení •preparát na mikroskopickém sklíčku - počet částic na zorné pole • v komůrce Fast Read - počet částic na 1 µl nativní moče • •Erytrocyty, leukocyty, válce a epitelie - na 1 ul •Bakterie, kvasinky, hlen a krystaly - přítomny, četné, záplava.. •do jedné hodiny • • Supravitální barvení dle Sternheimera: •Doc. Timo Kouri - standardizace barvící procedury •dvojsložkovou barvu - modř a červeň. •lepší rozeznatelnost epitelií a válců •potíže při větším počtu erytrocytů (růžová) a leukocytů (modrá) •rychlý rozvoj automatizace v močové analýze (flow cytometrie a automatizované mikroskopické vyšetření) •barvení se v ČR v masovém měřítku neprosadilo Hamburgerův sediment: •kvantitativní stanovení počtu erytrocytů, leukocytů a válců v moči sbírané 3 hodiny •výsledek je přepočten - diuréza - na rychlost vylučovaných elementů za časovou jednotku •umožňuje hodnotit a srovnávat exkreci uvedených elementů a upřesňuje v indikovaných případech základní vyšetření moče •vyšetření ze sedimentu získaného odstředěním sbírané moče – při manuálním provedení •masivní hematurie, leukocyturie, krystalurie - z nativní sbírané moče •zpracovat do 1 hodiny •V současnosti vyšetření ztrácí význam Hodnocení močového sedimentu: •Leukocyty (shluky) a erytrocyty – viz chemické hodnocení moče • •Epitelie : • • Dlaždicové (ploché nebo-li skvamózní) – pochází z uretry a vagíny • nepravidelný tvar, velké, dobře viditelné jádro • minimální klinický význam – kontaminace • častý nález • • Buňky přechodného epitelu – jedná se o buňky epit. výstelky • urinálního traktu – močový měchýř, proximální část • uretry u mužů • z hlubších vrstev - hustší a kulatější • kontakt s močí, absorbce vody • menší než dlaždicové epitelie • možnost dvou jader • menší počet může být normální • velké množství - infekce, léky • •Epitelie : • Renální tubulární – významný nález, velmi zřídka •při renální tubulární nekróze nebo virové infekci •malé, asi dvakrát větší než neutrofily •polyedrické, mají často excentrické ohraničené jádro • • •Oválná tuková tělíska : • renální tubulární epitelie nebo makrofágy naplněné tukem • • při velké permeabilitě glomerulu - snížený albumin, • zvýšená syntéza proteinů a lipoproteinů Válce: •precipitací proteinu v tubulech ledvin •základ tvoří Tamm – Horsfallův glykoprotein, který •je sekretován z renálních tubulárních buňěk •tvorbu válců podporuje - kyselejší pH, přítomnost větší koncentrace plasmových bílkovin, dehydrataci organismu, náročná fyzické aktivitě •definovaná vnější linie, paralelní strany, zakulacené konce, tvar tubulu •úlomky válců •bez barvení pod mikroskopem špatně viditelné •fázová kontrastní mikroskopie •hyalinní, buněčné, granulované, tukové, voskové a směsné sejmout0022 •Hyalinní válce - barví se světle růžově nebo světle modře •nález, který není patologický •objevují se v koncentrované kyselé moči •ve velkém počtu - záněty •úzké v důsledku otoku tubulů • •Buněčné válce – erytrocytární, leukocytární (granulocytární), z renálních tubulárních epitelií, bakteriální •patologický nález • •Erytrocytární –při glomerulární nefritidě, nejkřehčí, • nalezeny vyjímečně • Leukocytární – nejčastěji z neutrofilů při zánětech a infekcích • • Z renálních tubulárních epitelií – •po otravě Hg nebo etylenglykolem, hepatitidě, kdy dochází • k poškození tubulů • • Nelze-li určit částice - válec buněčný • • Přeměna válců: •po vytvoření nezůstávají ve stejném stavu •postupně se vyvíjí. •čím déle v ledvině (tlak), tím pozdější stádium válců •buňky v buněčných válcích postupně degenerují •zborcení, ztrátě buněčné membrány •tvorba granulí •granule podléhají další degeneraci, ztrátě struktury, válcová hmota zhoustne, zkřehne a zvoskovatí •Granulované válce: • •granule vznikají po rozbití buněčné membrány ve válci či tubulech • malý počet po intenzivní fyzické aktivitě (velký počet u otužilců) •větší počet je silně patologický. •obsahují agregované plasmatické proteiny, fibrinogen, globuliny •nelze určit původ buňek •několik granulí - válce hyalinní •Voskové válce - nejzávažnější •při chronickém onemocnění ledvin - válce renálního selhání •homogenní struktura, mohou přecházet ve válec jiného • typu – např. granulovaný •nejširší, nepravidelné zlomené konce •vypovídají o poškození tubulů, obsahují částečky ledvin • •Tukové válce – při silné renální dysfunkci, nefrotickém syndromu •v moči s pěnou, silně zvýšenou CB a Alb, u diabetiků, po intoxikaci Hg •obsahují oválná tuková tělíska •speciálním barvením lze rozlišit převahu Chol či TG • •Pseudoválce – např. vlákna hlenu, shluk buněk • • • •Krystaly a drť: • •nepříliš významný nález •oxaláty, kyselina močová, fosfáty a tripelfosfáty •vyjímečně lékové, bilirubinové, cystinové a myoglobulinové Barvený sediment •Erytrocyty – růžová • V kyselé moči světle růžové, se vzrůstajícím pH až červenofialová •Leukocyty – modré až modrofialové jádro • Leu s nepoškozenou cytoplasmatickou membránou neobarvené jádro, poškozené • výrazně modré, rozpadající se neobarvené jádro Barvený sediment •Epitelie •Dlaždicové epitelie – růžová •Přechodné – fialovo-růžové, někdy jádro tmavě fialové •Renální tubulární – fialovo-růžové, někdy jádro tmavě fialové •Válce •Hyalinní – světle modré případně světle růžové •Buněčné, granulované – buňky či granula tmavě fialová či tmavě růžová Barvený sediment •Krystaly – nebarví se •Drť – nebarví se, výjimečně nafialovělá •Bakterie – většinou modrá •Kvasinky – světlé •Tukové kapky - nažloutlé •Hlen – modrá Urinalysis and Body Fluids • • • K.M. Ringsrud, J.J. Linné sejmout0006 sejmout0008 sejmout0009 sejmout0010 1 2 1 1 2 sejmout0016 sejmout0017 sejmout0018 sejmout0019 1 sejmout0020 sejmout0021 sejmout0023 sejmout0024 sejmout0025 sejmout0026 sejmout0027 sejmout0028 sejmout0029 sejmout0030 1 2 Ukázky z atlasu barvených preparátů dle Doc. Kouriho •Obrázek A – zorné pole v běžném mikroskopu • •Obrázek B – zorné pole s fázově kontrastní optikou •Granulocytv (šipka a) s vícelaločnatými (segmentovanými) jádry Hyalinní válce a bakterie (šipka b) Rozdíl ve viditelnosti bakteríi sejmout0031 • Lymfocyt (šipka) - téměř celá buňka je vyplněna jádrem Erytrocyty sejmout0032 • Makrofág, Ery • V jádře je často vidět nepravidelný chromatin. sejmout0033 • Močové akantocyty (šipka) - dysmorfní erytrocyty -puchýřky pučící z buněčného povrchu. Podíl 5% akantocytů či větší - renální původ krvácení. sejmout0034 • Buňka dlaždicového epitelu a dvě tubulární buňky (šipka) ukazují rozdíl ve velikosti. sejmout0035 • Rozdíl mezi buňkou tubulárního epitelu (šipka a) ( granul. cytoplazma uvnitř hyal. válce), buňkami přechodného epitelu (šipka b) (jemně granulované, jasné jádro) a velkou buňkou dlaždicového epitelu (světlá cytoplazma, degenerované jádro) sejmout0036 • Karcinom buněk přechodného epitelu s atypickými epitelovými buňkami sejmout0033 • Buňky tubulárního epitelu uvnitř hyalinního válce sejmout0037 • Válec Ery, granulocyty - erytrocyty, granulocyty (šipka) (segmentovaná jádra) sejmout0038 • Válec s erytrocyty - renální hematurie • Rozdílnosti ve velikosti a tvaru mezi erytrocyty, dysmorfie sejmout0039 • Válec z renálních tubulárních buněk • Několik červených krvinek (šipka) vně válce sejmout0040 • Bakteriální válce - bakterie infikovaly ledviny. Pozor na záměnu s granulovaným válcem. Jasné tyčky (šipka) na jednom konci válce. sejmout0041 • Granulovaný válec - degenerace buněk— granulární srážení nebuněčného organického materiálu v renálním tubulu. Tubulární buňka již nemá plazmat. membránu. sejmout0042 •Voskový válec s ulomeným koncem sejmout0043 • Kousek toaletního papíru •Ostré hrany a zalomené konce sejmout0044 •Bakterie a buňky kvasinek (šipka) sejmout0045 • Tukový válec - kapénky tuku - ve fázovém kontrastu jako světlé skvrny - lipidurie (obvykle naznačující glomerulární chorobu) sejmout0046 Speciální nálezy Tyrozin C:\Users\27232\Documents\moc\Pacienti\Tyrozin\PC050329.JPG Tyrozin C:\Users\27232\Documents\moc\Pacienti\Tyrozin\PC050337.JPG Pylová zrna C:\Users\27232\Documents\moc\Pacienti\Pyl\PC060404.JPG Pylová zrna C:\Users\27232\Documents\moc\Pacienti\Pyl\PC060399.JPG •Elportál, MU Brno: • http://elportal.cz/publikace/vysetreni-moce Mikroskopické vyšetření moče Autoři: Miroslava Beňovská, Ondřej Wiewiorka, Jana Tůmová Oddělení klinické biochemie FN Brno; Katedra laboratorních metod LF MU - Mikroskopické nálezy barveného sedimentu - Mikroskopické nálezy nativního sedimentu - Nálezy z automatického analyzátoru FUS-2000 a iQ 200