Speciální koagulační vyšetření II Zavřelová J. Testy k diagnostice VWF  Screeningové testy  doba krvácení  PFA  APTT  Specifické testy  F VIII:C (funkční aktivita)  funkční aktivita VWF (VWF:RCo, VWF:Ac)  antigen VWF (LIA, ELISA, EID)  kolagen vazebná kapacita VWF  Diskriminační testy  agregace po ristocetinu  F VIII vazebná kapacita VWF  multimerní struktury VWF  Molekulární diagnostika Vyšetření aktivity VWF Metody stanovení schopnosti vazby VWF na GPIb vyšetření ristocetin kofaktorové aktivity (VWF:RCo) metody ristocetin nezávislé (VWF:Ac) Metoda VWF:RCo Reagencie lyofilizované normální promyté trombocyty + ristocetin Využívá antibiotikum ristocetin, který indukuje vazbu plazmatického VWF na GPIb cílových trombocytů a jejich aglutinaci detekce metodou agregační turbidimetrickou na koagulačních automatech  aglutinační Metoda VWF:RCo Agregační metoda sledování změn transmise světla ve směsi trombocytů a ristocetinu po přídavku vyšetřované plazmy (PPP) vyhodnocení změny transmise/min z agregační křivky vyjádření výsledku v % odečtením z kalibrační křivky Turbidimetrická metoda sledování změn turbidity ve směsi trombocytů a ristocetinu po přídavku vyšetřované plazmy (PPP)  vyhodnocení změn absorbance z kinetického měření  vyjádření výsledku v % odečtením z kalibrační křivky Metoda VWF:RCo Aglutinační metoda sledování aglutinace v suspenzi trombocytů a ristocetinu po přídavku titrované vyšetřované plazmy (PPP) na skleněné desce makroskopické odečtení posledního titru při kterém ještě nastává aglutinace, vynásobení titru udanou citlivostí reagencie vyjádření výsledku v % semikvantitativně např. >16% a < 32%) Metoda ristocetin nezávislá Kvantitativní automatizovaná metoda  standartizovaná Princip vyhodnocení vazby VWF na rekombinantně připravený GPIb s mutacemi, která nevyžaduje přítomnost antibiotika ristocetinu detekce aglutinace latexových částic s navázanou protilátkou proti GPIb metodou imunoturbidimetrickou na koagulačních automatech – vyhodnocení změn absorbance z kinetického měření – vyjádření výsledku v % odečtením z kalibrační křivky 7 Kolagen vazebná kapacita vWF Princip vazba VWF na koňský kolagen navázaný na stěnách mikrotitrační desky následná detekce vázaného VWF enzymatickou imunochemickou reakcí (EIA) Vyhodnocení odečtení absorbance Vyjádření výsledku v % normálu odečtením z kalibrační křivky Agregace po ristocetinu (RIPA) Princip destičkový agregační test v plazmě bohaté na trombocyty (PRP) pacienta v přítomnosti antibiotika ristocetinu použití různých koncentrací ristocetinu  z důvodu detekce zvýšené citlivosti vWF pacienta na nízkou koncentraci u typu 2B vWF choroby Vyhodnocení maximální amplituda A max (%)  strmost křivky (%/min) Korekce normální PPP při  RIPA 4 díly PRP pacienta + 1 díl PPP normálu Faktor VIII vazebná kapacita vWF Princip vazba VWF na stěny mikrotitrační desky potažené monoklonální protilátkou proti VWF eluce F VIII pacienta inkubace s definovaným množstvím rekombinantního faktoru VIII detekce vázaného F VIII na VWF fotometrickou metodou Vyhodnocení odečtení absorbance Vyjádření výsledku v % normálu odečtením z kalibrační křivky Multimerní analýza Princip detekce multimerní struktury VWF elektroforéza vzorku v SDS-agarózovém gelu specifická detekce autoradiograficky Western blot Význam vyšetření odlišení různých typů a podtypů VWF choroby Molekulární analýza detekce specifických genetických defektů VWF řetězovou polymerázovou reakcí a mutační analýzou Testy fibrinolytického systému Rutinní testy euglobulinová lýza D-Dimery FDP Speciální testy (aktivita - fotometricky, antigen - ELISA, EID) plazminogen (klinický význam, riziko trombózy) a-2-antiplazmin (klinický význam, riziko krvácení) PAI-1(klinický význam, riziko trombózy) tPA (klinický význam, riziko trombózy) Molekulární markery (ELISA) komplex PAP Diagnostika krvácivých stavů Screening poruch primární hemostázy a vWF v systému koagulačních faktorů v systému fibrinolýzy Speciální testy primární hemostáza vWF systém koagulačních faktorů systém fibrinolýzy Diagnostika trombofilních stavů Vyšetření hyperkoagulace nutné provedení speciálních testů k vyšetření jednotlivých trombofilních markerů zkrácení časů APTT (málo citlivé) v porovnání s předchozím výsledkem za vyloučení arteficiálního ovlivnění při odběru vyšetření molekulárních markerů D-Dimery - aktivace koagulace i fibrinolýzy – sledování dynamiky změn kvantitativně FPA, F1+2, TAT - aktivace koagulace – metody ELISA nejsou dostupné statim Trombofilní markery Defekty systémů  Přirozených inhibitorů krevního srážení  Koagulačních faktorů  Fibrinolýzy  Trombocytů Přítomnost protilátek Nespecifických (LA) Specifických (inhibitor PC, PS, F V, AT..) Přirozené inhibitory Antitrombin Systém PC/PS Protein C Protein S APC-rezistence Antitrombin Vyšetření funkční aktivity fotometricky (IIa, Xa) Vyšetření antigenu u vrozených defektů LIA, EID, ELISA Systém proteinu C XIIa FVIIa-TF XIa FVIIIi FIXa FVIIIa FVIII FX FXa FX FVi FVa FV FII FIIa fibrinogen FIBRIN Ca2+ TM PC APC PS Protein C Vyšetření funkční aktivity koagulační metody fotometrické Klinický význam - snížení Normální hodnoty 60 - 130 % Vyšetření antigenu u vrozených defektů EID, ELISA Protein C – koagulační metoda Stanovení prodloužení koagulačního času (APTT) způsobené inaktivací F VIIIa a Va aktivovaným proteinem C. Postup ředěná vyšetřovaná plazma + aktivátor proteinu C neředěná protein C deficitní plazma APTT reagencie, inkubace CaCl2 stanovení koagulačního času odečtení funkční aktivity z kalibrační křivky lin/lin závislost vyjádření výsledku % normálu Protein C- fotometrická metoda Sledování vzniku zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu aktivovaným proteinem C. Postup ředěná vyšetřovaná plazma + aktivátor proteinu C specifický chromogenní substrát sledování vzniku zbarvení  kineticky ( A/min) „end point“ (A) odečtení funkční aktivity z kalibrační křivky lin/lin závislost vyjádření výsledku % normálu Protein S Vyšetření funkční aktivity koagulační metody Klinický význam - snížení Normální hodnoty muži 65 - 140 % ženy 50 - 140 % Vyšetření antigenu - volný, celkový LIA ELISA EID Protein S – koagulační metoda Stanovení prodloužení koagulačního času (PT) způsobené inaktivací Va systémem PC (PS + aktivovaný PC). Postup ředěná vyšetřovaná plazma neředěná protein S deficitní plazma aktivovaný PC PT reagencie stanovení koagulačního času odečtení funkční aktivity (%) z kalibrační křivky lin/lin závislost Rezistence na aktivovaný PC = snížená antikoagulační odpověď na aktivovaný PC (APC)  Příčinou vrozené APC-R je ve většině případů Leidenská mutace faktoru V (FVL)  Příčinou získané APC-R  zvýšení F VIII  LA  těhotenství, hormonální substituce (včetně HAK)  antikoagulační léčba  významné defekty PC a PS  nesprávné zpracování vyšetřované plazmy Možnosti vyšetření APC - rezistence  Vyšetření fenotypu koagulačními metodami průkaz vrozené i získané APC-R  Vyšetření genotypu molekulárně genetické stanovení FVL Koagulační vyšetření APC - R  Vyšetření prodloužení koagulačních časů po přídavku APC 1. Vyšetření dvou koagulačních časů  s přídavkem a bez přídavku APC  vyjádření výsledku – poměr R = t s APC / t bez APC (norma např. > 2,0) 2. Vyšetření jednoho koagulačního času  s přídavkem APC  vyjádření výsledku – koagulační čas (norma: časy > cut off (např.120 s) ProC Global globální funkční test stanovení antikoagulační kapacity systému PC nejen APC-R Použití ke screeningu vrozených i získaných poruch Princip test na bázi APTT s použitím aktivátoru proteinu C hadího jedu (Agkistrodon contortree), který aktivuje endogenní PC přítomný v testovaném vzorku sleduje se prodloužení APTT indukované aktivovaným endogenním PC ProC Global - výsledky Vyšetření dvou koagulačních časů APTT v přítomnosti aktivátoru proteinu C (PCAT) APTT bez aktivátoru proteinu C (PCAT0) Výsledek - normalizovaný poměr (NR)  vztažení poměru časů R ke standardě Normální hodnoty NR > 0,8 Předpokládá se, že snížení poměru je v závislosti na riziku trombózy ProC Global - výpočet PCAT NR = ---------- x KF PCATO PCAT stand.plazmy KF = SV/ -------------- PCATO stand.plazmy KF - kalibrační faktor SV - citlivost standardní plazmy ProC Global Test je citlivý na defekty v systému proteinu C (95 %) Leidenská mutace faktoru V (100 %) defekt proteinu C (85 %) defekt proteinu S (56 %) Zachycuje vrozenou i získanou APC-R I samotná pozitivita PCG (bez známé příčiny) zvyšuje riziko VT (4x) Vhodný test pro screening trombofílie nikoli jako diagnostický test Defekty koagulačních faktorů Zvýšená hladina Faktor VIII Faktor XI, IX, II, VII, fibrinogen Dysproteinémie Fibrinogen,… Defekty fibrinolýzy PAI Plazminogen Faktor XII Dysfibrinogenémie TAFI Mokekulární markery (D-Di, PAP) Defekty trombocytů Syndrom lepivých destiček Hyperagregabilita trombo po Epi + ADP - typ I po Epi - typ II po ADP - typ III Aktivace trombocytů samovolná agregace molekulární markery PF4, bTG - ELISA Diagnostika HIT Trombocytopenie aplikace heparinu je provázena nevysvětlitelným poklesem počtu trombocytů < 150x109/l nebo o více než 50 % v časovém úseku odpovídajícím imunizaci heparinem Vyloučení trombocytopenie z jiných příčin DIC, LA, TTP, HUS, AITP potransfúzní purpura dřeňový útlum  Průkaz přítomnosti protilátek Laboratorní testy HIT Testy imunologické vyšetření protilátek proti Heparin/PF4 kvalitativní testy - průkaz přítomnosti/nepřítomnost ELISA - průkaz protilátek různých tříd IgG, IgM a IgA Testy funkční vyšetření schopnosti HIT protilátek aktivovat normální trombocyty jen v přítomnosti heparinu (ne v nepřítomnosti a při vysoké koncentraci) destičkový agregační test test uvolnění serotoninu (referenční metoda) exprese destičkových membránových glykoproteinů (flowcytometrie)  uvolnění destičkových mikropartikulí (flowcytometrie, ELISA)  uvolnění ATP (chemiluminiscence)  prokoagulační aktivita MP pomocí trombingeneračního testu Destičkový agregační test Vyšetření agregace trombocytů normálu (PRP) v přítomnosti heparinu a inaktivovaného séra/plazmy (PPP) pacienta porovnání agregační odezvy v přítomnosti heparinu – v terapeutické koncentraci ( 1 U / ml) – a vysoké koncentraci ( 100 U / ml) » vyloučení falešné pozitivity » štěpení imunokomplexů při vysoké koncentraci heparinu v nepřítomnosti heparinu (fyziologický roztok)