Základní barvicí metody v histologii Práce se světelným mikroskopem BARVENÍ • zviditelnění struktur v řezu – buňka a její součásti vykazují afinitu k barvivům dvou skupin: • zásaditá /bazická/ barviva („jaderná“) – reagují s kyselými strukturami buněk a tkání (NK v jádře aj.) bazofilie – bazofilní struktury • kyselá barviva („cytoplazmatická“) – reakce se zásaditými strukturami acidofilie – acidofilní struktury v buňce - chromofilní = chromatofilní/ x chromofobní - polychromatofilní – afinita k oběma druhům barviv xylen I xylen II 100% 96% H2O hematoxylin kyselý etanol etanol etanol xylen IV xylen III 100% 96% H2O eosin H2O etanol etanol HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) deparafinace rehydratace praní barvení diferenciace projasnění dehdyratace praní barvení praní RUTINNÍ BARVENÍ HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) Hematoxylin – zasaditý Eosin – kyselý Postup: • Odstranění parafinu xylenem • Rehydratace „sestupnou“ řadou alkoholů (100% 96% 80%) • Barvení hematoxylinem  jádra - modro-fialová • Diferenciace kys. alkoholem a vodou (odstranění přebytku barviva) • Barvení eosinem  růžová - cytoplazma, vazivo, svaly • Praní ve vodě (odstranění přebytku barviva) • Dehydratace „vzestupnou“ řadou alkoholů (80% 96%) • Projasnění v xylenu Barvicí automat řada boxů (kyvet) s barvicími médii TYPY BARVENÍ • rutinní, přehledná – HE, AZAN (demonstrují všechny zákl. složky) • speciální – vizualizace vybraných struktur – Massonovy trichromy: žlutý - HEŠ, modrý - AZAN, zelený trichrom (kolag.vlákna) – orcein, aldehydový fuchsin (elast.vlákna) aj. • impregnační – AgNO3 (nervová nebo retikulární vlákna) MONTOVÁNÍ • uzavření preparátu – kapkou montovacího media a krycím sklíčkem  trvalý preparát – rozpustná v xylenu – kanadský balzám – rozpustná ve vodě – glycerin-želatina, arabská guma Hematoxylin Eosin (HE) Výsledek barvení: jádra buněk – modrofialová cytoplazma – růžová kolagenní vlákna – růžová svalové buňky – červené 2 – Apex linguae (HE) Hematoxylin Eosin Šafrán (HEŠ) Výsledek barvení: jádra buněk – modrofialová cytoplazma – růžová kolagenní vlákna – žlutá žlutý Massonův trichrom 11 – Oesophagus (HES) Azokarmin Aniline blue Orange G (AZAN) Výsledek barvení: jádra buněk – purpurová cytoplazma – růžová kolagenní vlákna – modrá erytrocyty – oranžové modrý Massonův trichrom 99 – Pupečník (AZAN) Impregnace s AgNO3 Prep 68 – lien Barvení – impregnace Výsledek – černá retikulární vlákna Impregnace s AgNO3 Prep 77 – cerebellum Barvení – impregnace Výsledek – černá nervová vlákna Orcein Prep. 28 – elastická chrupavka Barvení – orcein Výsledek – purpurová elastická vlákna Weigert-van Giesson Prep. 31 – kůra ledviny Barvení – Weigert-van Giesson Výsledek – třešňově červená kolagenní vlákna Bestův karmín Prep. 49 – vagina - glykogen Barvení – Bestův karmín Výsledek – tmavě růžový glykogen Heidenhain Prep. 65 – myokard Barvení – Heidenhain Výsledek – černé kardiomyocyty (příčné žíhání) Schmorl Prep. 95 – kost Barvení – Schmorl Výsledek – rezavě hnědá kostní tkáň ZOBRAZENÍ 3D ÚTVARŮ V 2D ROVINĚ ŘEZU Světelný mikroskop • okuláry • objektivy s čočkami • stolek s preparátem • clona • on/off • regulace intenzity světla • zdroj světla • makrošroub - ostřit jen s objektivem 4x • mikrošroub • posun preparátu ukazovátko! Obj. 100x / nepoužívat!+pérko k fixaci preparátu na stolku Orientace preparátu krycím sklem nahoru. 4x, 10x, 40x, imerzní obj. – 100x Světelný mikroskop • okuláry • objektivy s čočkami • stolek s preparátem • clona • on/off • regulace intenzity světla • zdroj světla • makrošroub • mikrošroub • posun preparátu ukazovátko! obj. 100x / nepoužívat ostřit jen s objektivem 4x +pérko k fixaci preparátu na stolku • Zapněte světlo. • Začněte s objektivem 4x. • Položte preparát na stolek mikroskopu – krycím sklíčkem nahoru. • Pohlédněte do mikroskopu a zaostřete. Použijte hrubé zaostření a jakmile je obraz víceméně vidět, použijte jemné ostření obrazu. • Seřiďte světlo. • Seřiďte okuláry. • Přepněte na objektiv 10x. K zaostření obrazu by měl stačit šroub pro jemné ostření. Pokud ztratíte obraz, vraťte se k objektivu 4x a začněte znovu. • Chcete-li vidět detailní obraz, přepněte na objektiv 40x. Objektiv 100x nepoužívejte! • Chcete-li studovat další preparát, přepněte zpět na obj. 4x před výměnou preparátu. • V každém okamžiku během praktika může být vyjmut pouze jeden preparát. NE víc! • Po skončení práce s mikroskopem (na konci praktika), nastavte objektiv 4x ztlumte intenzitu osvětlení, zhasněte světlo, přikryjte mikroskop obalem. • Na konci praktika bude krabice s preparáty zkontrolována za přítomnosti studenta, který s ní pracoval. Teprve pak může student opustit pracovní místo. Instrukce 1. Na začátku každého praktika zkontrolujte sadu preparátů a zjištěné závady (např. chybějící nebo rozbitý preparát) oznamte učiteli. 2. Z krabice lze vyjmout vždy pouze jeden preparát! 3. Preparát na stolku mikroskopu musí být vždy orientován krycím sklíčkem nahoru, tj. proti čočce objektivu. 4. Při manipulaci s preparáty buďte maximálně opatrní; v případě poškození preparátu informujte učitele. 5. Na konci každého praktika nechte krabici s preparáty otevřenou ke kontrole, během níž musí student zůstat na svém pracovním místě. PRAVIDLA PRO ZACHÁZENÍ S PREPARÁTY Základní barvicí metody v histologii Preparáty: • HE barvení: 2 – Apex linguae • HEŠ: 11 – Oesophagus (37. Epididymis) • AZAN: 99 – Funiculus umbilicalis (21. Hepar) • Impregnace: 77 – Cerebellum • (Orcein: 28 – Epiglottis)