Vyšetření mozkomíšního moku MUDr. Zdeňka Čermáková MOU Brno Anatomie a fyziologie ¡Čirá bezbarvá tekutina ¡Vyplňuje komorový systém mozku, subarachnoideální prostor mozku a míchy ¡ ¡Tři membrány l Měkká plena mozková l Arachnoidea l Tvrdá plena mozková ¡ Tvorba likvoru ¡ ¡Aktivní sekrece –chorioideální plexy ¡Ultrafiltrace plazmy ¡Přestup intersticiální tekutiny z mozkové tkáně ¡ ¡Objem likvoru 150-180 ml ¡Denní produkce 500-600 ml ¡Resorpce do žilního a lymfatického systému ¡ Funkce ¡Mechanická ochrana mozku a míchy ¡Ochrana proti patogenům ¡ ¡Přísun živin, hormonů ¡Homeostáza Bariéry ¡Stálá výměna látek – plocha asi 9m2 l krev – likvor l mozek – likvor l krev – mozek ¡ ¡ ¡Mechanismy – mechanické, enzymatické (specifické přenašeče..) l Odběr ¡Lumbální punkce ¡okcipitální, ventrikulární ¡ ¡Rychlé doručení do laboratoře ¡ (do 1 hod. od odběru) ¡Krvavý likvor (nutno stočit do 10 min.) ¡ Soubor:Thisisspinaltap.jpg lumbalni_punkce_technika ilu_35 ilu_34 Komplikace lumbální punkce ¡Suchá punkce – nesprávná poloha jehly, artrotické změny ¡ ¡Traumatická lumbální punkce - poranění epidurální žilní pleteně, komplikace při vyšetření, může komplikovat stanovení diagnózy subarachnoideálního krvácení Soubor:Spinal needles.jpg Indikace odběru likvoru ¡Infekční onemocnění lzánět mozkových blan (meningitis) a zánět mozku (encephalitis) ¡Autoimunitní onemocnění lSclerosis multiplex (poškození myelinových obalů), Guillain-Baré syndrom, sarkoidóza ¡Subarachoideální krvácení l které není prokazatelné jinými zobracovacími metodami. ¡Onkologická onemocnění centrálního nervového systému nebo průkaz metastáz. Kontraindikace lumbální punkce ¡Hemokoagulační poruchy ¡ ¡U nemocných se zánětlivými afekcemi kůže nebo dekubity v oblasti bederní páteře ¡ ¡Zvýšený nitrolebeční tlak Zevní komorová drenáž ¡ ¡Indikace ¡Snížení nitrolebního tlaku (akutní hydrocefalus, dekompenzovaný chronický hydrocafalus, trauma CBS) ¡ ¡Odvod zánětlivého likvoru (riziko akutní obstrukce vývodných cest, riziko rozvoje pozánětlivého obstrukčního hydrocefalu) ¡ ¡Odvod krvavého likvoru po krvácení nebo operaci (riziko obstrukce vývodných cest, riziko pozdějšího rozvoje obstrukčního hydrocefalu) ¡ ¡Odklonění přirozeného toku likvoru (hojení rány v oblasti zadní jámy lební) ¡ Hydrocephalus, odběr z V-P shuntu ventrikuloperitonealni_drenaz Odběr z Ommaya rezervoáru http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/63/Ommaya_01.png/800px-Ommaya_01.png Základní vyšetření ¡Počet elementů a erytrocytů –kvantitativní cytologie ¡Kvalitativní cytologie- trvalý cytologický preparát ¡Celková bílkovina ¡Glukóza ¡Laktát Celková bílkovina ¡Fyziologická hodnota 0,15 - 0,40 g/l (stoupá s věkem) lalbumin, prealbumin, transferin,imunoglobuliny lhaptoglobin, C-reaktivní protein, C3 a C4 složky komplementu, antitrombin III, α1-antitrypsin lorosomukoid. ¡ ¡Zvýš. CB lzáněty (porucha hematoencephal. bariéry) lporucha cirkulace likvoru lintratekální syntéza Ig ¡ ¡ Stanovení celkové bílkoviny Turbidimetrické stanovení bílkovin Princip: Měření zákalu po denaturaci bílkovin kyselinou sulfosalicylovou, trichloroctovou, benzethoniumchloridem aj. Turbidimetrická metoda s benzethoniem: Chlorid benzethonia denaturuje bílkoviny v moči, vzniká velmi jemná suspenze, kterou je možno kvantifikovat při 405 nm (turbidimetrie). Glukóza ¡ ¡Základní energetický zdroj nervové tkáně ¡Hladina závisí na glykémii ( 60% sérové hladiny) ¡ ¡Snížení: lbakteriální meningitida lnádory lkrvácení Stanovení glukózy Metoda s hexokinázou Stanovení glukózy pomocí enzymů hexokinázy a glukóza-6-fosfát dehydrogenázy V tomto postupu je využito fosforylačních reakcí známých z biochemie cukrů, kdy je pomocí hexokinázy fosforylována glukóza na glukóza-6-fosfát, který je následně za katalýzy G6PD (glukóza-6-P dehydrogenáza) dehydrogenován na 6-P-glukonolakton. Koenzym reakce, NADP, je přitom hydrogenován. Sleduje se nárůst absorbance při 340 nm (optický test). Referenční metoda, používaná často i jako metoda rutinní nárůst absorbance při 340 nm (optický test). Laktát ¡Fyziologická hodnota 1,2-2,1 mmol/l ¡Nezávisí na plazmatické koncentraci, prakticky neprochází přes hematoencephalickou bariéru ¡ ¡Zvýšení: lZáněty – rozlišení virové a bakteriální meningitidy (produkován hlavně bakteriemi při anaerobní glykolýze) lPoruchy zásobení mozku kyslíkem – ischemie, krvácení lZvýšení intenzity metabolismu – nádory [USEMAP] Stanovení laktátu C:\Users\3050\AppData\Local\Microsoft\Windows\Temporary Internet Files\Content.Outlook\QVGDHUQN\lactate-dehydrogenase1.jpg enzymaticky - laktátdehydrogenáza Albumin ¡Tvorba v játrech ¡Albumin v likvoru pouze z obvodové krve ¡ ¡Referenční hodnoty: CSF-Albumin: 120–300 mg/l ¡ ¡Albuminový kvocient – Qalb = alb.CSF/ alb.S (je závislý na věku): ldo 15 let: ≤ 5×10−3 ldo 40 let: ≤ 6,5×10−3 ldo 60 let: ≤ 8×10−3 ¡ ¡Albuminový kvocient se využívá k matematickému vyjádření funkce hematolikvorové bariéry: ¡k hodnocení míry postižení hematolikvorové bariéry; ¡pro výpočet intratékální syntézy imunoglobulinů. ¡ ¡Metoda stanovení-imunoturbidimetrie,imunonefelometrie ¡ Porucha hematolikvorové bariéry ¡Mírně porušená 7.3-10x 10-3 ¡ Roztroušená skleróza, chronické neuroinfekce, serózní meningitidy,nezánětlivé polyneuropatie ¡ ¡Střední porucha 10-20x 10-3 ¡ Serózní meningitidy,CMP,diabetická neuropatie ¡ ¡Těžká porucha nad 20 x 10-3 ¡ Meningitida bakteriální,herpetická, tuberkulózní,karcinomatóza,polyradikuloneritida-Guillaina-Barrého ¡I při velmi vysokých hodnotách Qalb. je zachována určitá funkčnost bariéry Imunoglobuliny ¡Zdroj – sérum ¡Lokální syntéza(intratékální) l lCSF-IgG: 12,0–40,0 mg/l lCSF-IgM: 0,2–1,2 mg/l lCSF-IgA: 0,2–2,1 mg/l ¡ ¡ Intratékální syntéza ¡ perivaskulární infiltráty lymfocytů B, které lokálně proliferují dozrávají v plazmocyty a produkují protilátky ¡ ¡Princip měření – imunochemicky, turbidimetrie, nefelometrie ¡ ¡ ¡ Humorální imunitní reakce v CNS ¡Koncentrace albuminu v moku pozitivně koreluje s koncentrací IgG ¡ 1.IgG index 2. 2. 2.Kvantitativní výpočet intratékální syntézy Ig -výpočet dle Reibera 3. 3.Kvalitativní průkaz intratékální syntézy -izoelektrická fokuzace – průkaz oligoklonálních proužků IgG _{index} = \frac{IgG_{CSF}/IgG_{s\acute{e}rum}}{Alb_{CSF}/Alb_{s\acute{e}rum}} IgG_{index} = \frac{Q_{IgG}}{Q_{alb}} Výpočet dle Reibera Reiberův_diagram.png (780×720) Oblast 1 – normální nález; Oblast 2 – izolovanou poruchu hematolikvorové bariéry bez lokální syntézy Ig Oblast 3 – poruchu hematolikvorové bariéry společně s intratékální syntézou I Oblast 4 – izolovaná intratékální syntéza Ig bez poruchy hematolikvorové bariéry; Oblast 5 – oblast analytických chyb. Kvalitativní průkaz intratékální syntézy IgG Oligoklonální pásy ¡Elektroforéza v gradientu pH – rozdělení podle izoelektrického bodu jednotlivých bílkovin ¡Současně se analyzuje i sérum ¡ C:\Users\3050\Desktop\IMG_2409.JPG Izoelektrická fokuzace ¡Charakteristickou vlastností proteinů je jejich izoelektrický bod ¡pH, při kterém se jejich molekuly bílkovin nepohybují v elektrickém poli ¡Princip spočívá v dělení směsi proteinů na nosiči se stabilním gradientem pH rovnoměrně stoupajícím od anody ke katodě. ¡Proteiny jsou fokuzovány do úzké zóny (odpovídající rozmezí až 0,01 pH kolem svého izoelektrického bodu. Izoelektrická fokuzace C:\Users\3050\Desktop\IMG_2411.JPG C:\Users\3050\Desktop\IMG_2415.JPG \\fnbrno.cz\tree\Home\3050\My Pictures\2017-04-28\085.JPG \\fnbrno.cz\tree\Home\3050\My Pictures\2017-04-28\087.JPG Perspektivy vývoje vyšetření likvoru ¡Diagnostika degenerativních onemocnění a prionových infekcí. Dg. Creutzfeldtovy-Jakobovy choroby svědčí zvýšená koncentrace 14-3-3 proteinu v likvoru ¡Likvorová diagnostika Alzheimerovy choroby se opírá o stanovení β-amyloidu,τ-proteinu a fosfo- τ-proteinu. Protein β-amyloid je součástí amyloidových plak, které se akumulují v mozku. Protein τ se vyskytuje v cytoskeletu CNS. U Alzheimerovy choroby se nachází snížené hodnoty β-amyloidu a zvýšené hodnoty τ-proteinu.Dále se hodnotí jejich vzájemný poměr, index τ/ β-amyloid, který bývá zvýšený. ¡ ¡Strukturální protein S-100 patří do rodiny proteinů vážících vápník. Zvýšená hodnota S100 může svědčit pro poruchu hematolikvorové bariéry a často je známkou neuronového postižení. ¡β2 mikroglobulin patří k proteinům, které jsou přítomny ve všech tělních tekutinách.Vzestup jeho koncentrace v likvoru nacházíme u stavů obecně spojených s aktivací a zmnožením lymfocytárních a makrofagických elementů. Spektrofotometrie likvoru ØProvádí se při podezření na intermeningeální krvácení. ØJe přínosné v časných stadiích, kdy ještě nejsou změny v cytologickém obrazu. Ø ØSpektrofotometrie je 10x citlivější než lidské oko, pozitivní nález můžeme získat i u napohled bezbarvého likvoru. Ø ØProvádí se registrací absorbance v oblasti viditelného světla (380-700 nm), detekuje se přítomnost oxyhemoglobinu a bilirubinu. Ø Spektrofotometrie likvoru Ø Spektrofotometrie_oxy_a_bili Průkaz likvorey ØLikvorea – závažný stav s komunikací likvorových cest Detekce likvoru je možná stanovením parametru specifického pro likvor. Ø ØStanovení beta trace proteinu – enzym, který je syntetizován v buňkách chorioideálního plexu. V likvoru se nachází v koncentracích 20-30x vyšších než v séru. ØDalším parametrem je β2 transferin. Ze sérového transferinu se v likvorových prostorách odštěpí zbytky kyseliny sialové (mozkovou neuraminidázou), vzniká asialotransferin, který lze detekovat pomocí elektroforézy s imunofixací v β2 zóně. Ø Stanovení beta 2 transferinu Ø Obrázek1 Obrázek2 Průkaz likvorey ¡Pacientka 26 let ¡Během několika měsíců zduření v oblasti horní hrudní páteře ,následné zduření v oblasti krku ¡Subj: poruchy cítivosti v oblasti LHK, slabost LHK ¡ ¡MR,CT, PET-MRI: tumor v oblasti C4-Th3,prorůstání do mediastina,infiltrace horního pólu levé plíce, pleury, 1.žebra vlevo ¡Bipsie –maligní tumor z pochev periferních nervů (maligní schwannom) ¡ ¡Plánovaný operační výkon – resekce tumoru v oblasti krku ¡ ¡ ¡Operace - resekce tumoru – oblast krční, hrudní, resekce části plic, části žeber ¡ ¡2.den po operaci – zvýšení sekrece z operační rány – podezření na přítomnost likvoru ¡ ¡Odeslán vzorek na vyšetření Průkaz ß2-transferinu Sérum CSF Sérum pacienta Tekutina asialoforma disialo tetrasialo trisialo pentasialo Průkaz ß2-transferinu ¡3.den po operaci ¡ ¡provedena revize rány ¡v oblasti C8 a T1 nalezeny drobné trhliny tvrdé pleny, sešity a překryty tzv. tkáňovým lepidlem ¡