Adobe Systems
Biofyzikální ústav Lékařské fakulty Masarykovy university, Brno
1
Radiologická fyzika a radiobiologie
Základy radiochemie (radiobiologie I)
http://www.radiochemistry.org/courses/images/courses_img02.jpg
Tato přednáška se opírá převážně o monografii E. L. Alpen: Radiation Biophysics (1998), novější
radiobiologickou literaturu a internetové materiály.

Ionizační a excitační procesy
Většina energie rozptýleného (sekundárního) záření je nesena elektrony, které ionizují prostředí.
Tyto vysokoenergetické elektrony vznikly (v radiologických souvislostech) fotoelektrickým jevem a
Comptonovým rozptylem záření rentgenového i gama.
Pro nás podstatným prostředím je voda, která tvoří u dospělých kolem 60% váhy těla.
Tzv. první ionizační potenciál vody je 12,6 eV.
Pro srovnání, elektrony o energii 20 keV ztrácejí při interakci s vodou s největší pravděpodobností
kvantum energie 22 eV (průměrná velikost ztráty je 60 eV (viz obr.).
Ztráty energie mají v každém případě diskrétní hodnoty.

Alpen-6-1-ztráty energie
Histogram ztrát energie elektronu při jeho interakcích s látkou (elektrony o relativně nízké
energii 20 keV ve vodě)
Dost podobně tomu je s průměrným a nejpravděpodobnějším platem!!!!!

Ionizační a excitační procesy
Patrně podle vzhledu ionizačních stop získaných pomocí bublinkových komor a množství „předané =
ztracené“ energie se tyto události dělí na
Ostruhy (Spurs) – 6 až 100 eV – jen několik iontů
Kuličky, bloby (Blobs) – 100 až 500 eV – desítky iontů
Krátké stopy (Short tracks) – 500 až 5000 eV – stovky iontů
Elektron o energii 1 MeV, předává asi 65% energie v „ostruhách“, 15% v „blobech“ a 20% v „krátkých
stopách“ (což jsou vlastně ionizační stopy terciárních elektronů).
fig 8.jpg (19526 bytes)
http://www.photobiology.com/educational/len/part2.htm
Větvení stopy

Ionizační a excitační procesy
Výsledek předání energie:
ionizace – 1 nebo více elektronů vyraženo z molekuly
excitace
superexcitace (přijatá energie je vyšší než ionizační, avšak elektron zůstává vázán k původnímu
jádru)
Ve všech těchto případech je důsledkem nestabilita, která může vést ke změnám struktury molekuly
nebo mezimolekulovým interakcím.
Jednotlivé „ostruhy“, tj, nejmenší skupiny ionizačních událostí, jsou od sebe vzdáleny v průměru
400 nm při vlastní velikosti cca 1 nm, vodíkový radikál je schopen difundovat do vzdálenosti v
průměru 180 nm, dokud nezanikne.
Důsledek: interakce (např. rekombinace) volných radikálů vytvářených v různých blobech, ostruhách a
krátkých stopách prakticky není možná (pravděpodobná).

Radiochemie vody
Primární produkty radiolýzy vody, objevující se v čase od 10-16 do 10-12 s:
Excitovaná molekula vody H2O*
Radikály H∙ a OH∙ (důsledek rozbití excitované molekuly)
H20+ a e- (důsledek přímé ionizace nárazem)
Navazující procesy:
H2O+ →  H+ + OH∙
e- + H2O → H2O-
e- + H+ → H∙
e- + nH20 → e-aq (solvatovaný, vodný, hydratovaný elektron, doba života přibližně 0,2 ms)
a také
H2O- → H∙ + OH-
http://www.nature.com/nchem/journal/v2/n4/images/nchem.604-f1.jpg
Vazba solvatovaného elektronu obklopeného šesti molekulami vody má 3,3 eV, na povrchu vody jen 1,6
eV – měřeno na základě energie elektronů, vyražených z vody světelnými fotony!!

Schéma radiolýzy vody
Alpen-6-2-radiolýza vody
Pozor, pravděpodobnost excitace a ionizace není stejná – závisí na energii elektronů a dalších
faktorech!

Radiochemie vody
Primární produkty radiolýzy vody tedy jsou:
H∙, OH∙, e-aq, H+, OH-
Ionty H+ a OH- však nemají z hlediska působení na živou hmotu valný význam, protože jsou ve vodě a
vodných roztocích všudypřítomné.
Část volných radikálů i iontů rychle rekombinuje (spojuje se do původních celků).
Následuje chemická fáze, popsatelná souhrnnou rovnicí:
H2O (ozářená) → H∙, e-aq, OH∙, H30+, H2, OH-, HO2∙, O2, O2-, HO2-, H2O2
Superoxidový anion
 "hydroperoxyl" nebo "perhydroxy radikál"
Superoxid vodíku

Hodnota G
Hodnota G – měřítko chemického výtěžku.
G je počet molekul vytvořených nebo rozpadlých v důsledku předání 100 eV energie sekundárního
elektronu.
Vybrané hodnoty G při neutrálním pH:
H∙ 0,6
e-aq 2,6
OH∙ 2,6
H2 0,45
H2O2 0,75

Oxidace iontů železnatých (Fe2+) na železité (Fe3+). Využití pro dosimetrické účely je omezené (což
platí i pro jiné chemické dozimetry), protože hodnota G silně závisí na LET. Je to však o cenný
model interakce volných radikálů s jejich lapači. Jde o následující systém reakcí:
H2O* → OH∙ + H∙ 1
H∙ + O2 → HO2∙ 2
HO2∙ + Fe2+ → HO2- + Fe3+ 3
HO2- + H+ → H2O2 4
OH∙ + Fe2+ → OH- + Fe3+ 5
H2O2 + Fe2+ → OH- + Fe3+ + OH∙ 6
H∙ + H2O → OH∙ + H2 7
Frickeův dozimetr jako model radiochemické reakce

Frickeův dozimetr jako model radiochemické reakce
Reakce (7) nastává jen za absence kyslíku.
Prostudování těchto reakcí vede k závěru, že za přítomnosti kyslíku a v kyselém prostředí každý
vodíkový radikál způsobí oxidaci tří železnatých iontů na ionty železité.
V reakci (2) vzniká superoxidový radikál HO2∙, který následně oxiduje první železnatý iont.
Ze superoxidového aniontu a vodíkového iontu vzniká peroxid vodíku, který pak oxiduje druhý iont
Fe2+.
V této reakci (6) vzniklý hydroxylový radikál pak oxiduje třetí iont Fe2+ (5).
Je dále zjevné, že jiným způsobem (radiolyticky) vzniklý H2O2 sám poskytuje 2 ionty Fe3+ (reakce 5
a 6). Radiolyticky vzniklý radikál OH∙ (reakce 1) stvoří v reakci (5) další iont Fe3+.

Frickeův dozimetr jako model radiochemické reakce
Pro celkový výtěžek Fe3+ pak můžeme napsat:
G(Fe3+) = 2G(H2O2) + 3G(H∙) + G(OH∙)
Za nepřístupu kyslíku analogicky
G(Fe3+) = 2G(H2O2) + G(H∙) + G(OH∙)

Frickeův dozimetr jako model radiochemické reakce
Pro g-záření Co-60 o nízkém LET jsou platné hodnoty:
G(H2O2) = 0,75
G(H) = 3,65
G(OH) = 3,15
Takže s ohledem na
G(Fe3+) = 2G(H2O2) + 3G(H∙) + G(OH∙),
je G(Fe3+) rovno 15,6
a za nepřítomnosti kyslíku analogicky 8,30.
Pozn: Tyto hodnoty jsou ovšem nižší než jejich teoretický odhad, protože část energie záření
nevyvolá změny lapače radikálů (železnatých iontů nebo jiných redukujících molekul).
Za předpokladu spotřeby 17 eV na vytvoření jednoho páru H∙ a OH∙ by hodnota G měla vyjít pro
Fe3+ 23,53.

Přímý a nepřímý účinek
Přímý účinek: místo molekul vody jsou zasahovány přímo biologicky významné molekuly, zejména DNA.
Počet nepoškozených molekul N po působení dávky D je dán původním počtem nepoškozených molekul N0:
Kde k je tzv. inaktivační konstanta s jednotkou Gy-1, jejíž převrácená hodnota udává dávku (D =
1/k), která sníží počet nepoškozených molekul faktorem 1/e, tj. na 37% původní hodnoty (uvažme N =
N0.e-1, tj. N = N0/e). Tato dávka se označuje též D0 nebo D37.
Úvahy platí, pokud jediný zásah inaktivuje biomolekulu.

Přímý a nepřímý účinek
Zejména v souvislosti s tzv. zásahovou teorií má velký význam pojem terče. Tímto terčem myslíme
zpravidla nějakou molekulu. Existuje vztah mezi molekulovou hmotností a velikostí terče (v.t.).
Molekulovou hmotnost lze dokonce považovat přímo za velikost terče (při inaktivaci jediným
zásahem).
D37 považujeme za inaktivační dávku. Je-li experimentálně zjištěná hodnota průměrného množství
energie předané při jedné interakční události 75 eV, platí:
Pro lepší pochopení rovnic: „energie potřebná pro inaktivaci terče dělená inaktivační energií na
gram poskytuje počet gramů připadajících na jeden terč“. Numerický výraz ve druhém či třetím
jmenovateli je přepočítací faktor z Gy, tj. J.kg-1, na eV.g-1. k je vysvětleno na předchozím
snímku.

Přímý a nepřímý účinek (příklad úvahy, pochopit ale nebiflovat)
Molekulová hmotnost terče je dána součinem Avogadrovy konstanty a velikostí terče v.t. vyjádřenou
jako hmotnost v gramech. Po výpočtu s využitím výrazu z předchozího snímku dostáváme:
D37 je dosazena za převrácenou hodnotou k a je ji nutno vyjadřovat v eV.g-1. Mezi mol. hmotností
určenou z radiochemického experimentu a mol. hmotností určenou nezávisle na ozáření je značná
shoda, což naznačuje platnost jednozásahové inaktivační hypotézy. Teorie platí v plném rozsahu pro
molekuly v suchém stavu, ve vodném prostředí se více uplatňuje nepřímý účinek.
Musí se experimen-tálně zjistit!

Přímý a nepřímý účinek
Nepřímý účinek: poškození terčové biomolekuly je zprostředkováno radikálovými produkty radiolýzy
vody. Proces je řízen difuzí.
Pokusy se specifickými lapači radikálů ukázaly, že rozhodující význam má pro poškození biomolekul
radikál OH∙.

Rekombinace, restituce, oprava
3 způsoby obnovy stavu molekul před ozářením:
Rekombinace může nastat prakticky jen velmi krátce po interakční události – s ohledem na rychlost
difuze je tento čas kratší než 10-11 s. Rekombinace je prostým znovuspojením iontového nebo
radikálového páru.
Restituce je chemická (neenzymová) obnova původní molekuly. Dochází k ní v časech kratších než je
jedna ms. Příkladem takového procesu je reakce radikálu DNA s molekulou obsahující sulfhydrylovou
skupinu -SH:
DNA∙ + RSH → RS∙ + DNA (s obnoveným H)
Opravy jsou enzymatické a vyžadují podstatně delší čas.

Makromolekulární terč v buňce
Dnes je jasné, že hlavním terčem je DNA, ať se jedná o účinek přímý nebo nepřímý.
Ostatní makromolekuly (bílkoviny i RNA) mohou být poměrně snadno nahrazeny resyntézou.
Důkazy:
A)korelace existence dvouvláknových zlomů DNA se ztrátou biologické aktivity.
B)Buňky neschopné oprav DNA nebo s chemicky zablokovanými opravami DNA jsou mnohem citlivější na
působení ionizujícího záření.

Chemické reakce vyvolané produkty radiolýzy vody
Není jisté, které z následujících radikálových reakcí jsou nejdůležitější pro nepřímé poškození
DNA, ale uplatňují se zřejmě všechny v závislosti na podmínkách procesu.
1. Vytržení vodíkového atomu
R-H + H∙ → R∙ + H2
R-H + OH∙ → R∙ + H2O
2. Disociativní reakce
R-NH3+ + e-aq → R∙ + NH3
R-NH2 + H∙ → R∙ + NH3

Chemické reakce vyvolané produkty radiolýzy vody
3. Adiční reakce
R-CH=CH-R + OH∙ → R-CHOH-CH∙-R
4. Restituce
R∙ + R-SH → R-H + R-S∙
5. Fixace poškození (radikálu biomolekuly) vazbou kyslíku – vzniká peroxid
R∙ + O2 → R-O-O∙
Peroxidový radikál je dosti stabilní, nepodléhá restituci, ale není to finální produkt.

Reakce s DNA
Jedná se o interakce s OH∙, H∙ a e-aq, přičemž nejdůležitější jsou interakce s hydroxylem:
Funkční skupiny na bázích a cukrech mohou být změněny – vzniká chybný nukleotid.
Poškození bází může být tak silné, že dochází k jejich ztrátám, vznikají místa bez purinů nebo
pirimidinů v DNA.
Přesun radikálu z báze na cukr-fosfátovou páteř může vést ke ztrátě báze.
Vznikají i jednovláknové a dvouvláknové zlomy. Blízké (max. 10 bází vzdálené) současné zlomy na
obou řetězcích se označují jako dvouvláknové – vedou k přerušení dvoušroubovice.
V experimentech s viry se zjistilo, že hydroxylový radikál nejčastěji napadá vodík deoxyribózy v
poloze 4 (obr.), odnímá jej cukrovému zbytku za vzniku vody.
Látky se sulfhydrylovými skupinami (thioly) vznik radikálů na DNA tlumí (mechanismem restituce),
přítomnost kyslíku je naopak stabilizuje.

o3_5
Místo, které nejčastěji napadá hydroxylový radikál.


Přerušení řetězce DNA
Jednovláknový zlom – single-strand break (SSB): Poměrně snadná bezchybná reparace, v radiačním
poškození buněk hraje jen malou roli.
Dvouvláknový zlom – double-strand break (DSB): Reparace obtížná, protože pro ni chybí přesný
templát (předloha), časté chyby projevující se mutacemi. Různé mechanismy vzniku:
a) Jeden zásah DNA vede k přímému vzniku DSB v komplementárních místech řetězce.
b) Jeden zásah DNA může vést k tzv. kooperativnímu vzniku DSB v blízkých místech obou řetězců.
c) Dva nezávislé zásahy komplementárních řetězců v místech vzdálených od sebe max. 10 bází. Při
větší vzdálenosti udrží dvoušroubovici vcelku vodíkové i jiné vazby.
JEDNOVLÁKNOVÉ I DVOUVLÁKNOVÉ ZLOMY MOHOU VZNIKNOUT TAKÉ JAKO DŮSLEDEK NEPŘÍMÉHO ÚČINKU - PŮSOBENÍ
VOLNÝCH RADIKÁLŮ.

Alpen-6-4-SSB-DSB
Obr. Dvouvláknové zlomy. Popis na předchozím snímku.


Vliv konfigurace DNA na její radiační poškození
V živých buňkách se DNA nachází ve vysoce kondenzovaném stavu (supercoil, superhelix,
nadšroubovice, supervinutí – viz např. biofyzika, přednáška o struktuře živé hmoty) a v pevné vazbě
s histony – hovoříme o chromatinu. Tato vazba je ovlivňována ionizujícím zářením již při dávkách
řádově jednotek Gy.
Relaxace „supervinutí“ (tj. rozvinutí onoho supervinutí) v důsledku dvouvláknových zlomů zřejmě
znemožňuje reparační procesy.

Reparace DNA
Odhaduje se, že počet DSB v jedné buňce je 15-60 na 1 Gy, zatímco počet SSB je více než 1000 na 1
Gy. Poškození DNA však působením SSB vzniká jen minimálně.
Poškození DNA v důsledku působení ionizujícího záření:
a)DSB a SSB v dvoušroubovici
b)Chemické změny bazí
c)Chemické změny cukrových zbytků
d)Vznik spojek (cross-links) mezi bílkovinnou matrix a DNA nebo v DNA samotné.
Tato poškození jsou opravována několika různými způsoby, jejichž detailní popis je předmětem zájmu
molekulární biologie.

Reparace DNA – Excizní oprava
Excizní oprava – typická pro jednovláknové zlomy v nereplikujících se molekulách DNA.
Templát (předloha) komplementárního vlákna musí být k dispozici!
Nejdříve dochází k odbourání dalších bází z okolí zlomu, a pak se od 3‘-hydroxylového konce vlákna
doplňuje chybějící sekvence (působením enzymu DNA-polymerázy I).
Podobně se opravují poškozené báze nebo cukrové zbytky.

Rekombinační oprava DSB
Opravy DSB patří mezi tzv. error-prone (k chybám náchylné) opravy. Klíčovou roli v těchto opravách
hraje bílkovina recA (mutace genu pro recA podstatně zvyšuje citlivost k radiačnímu poškození).
Prokázáno u bakterií a něco podobného se projevuje i u savčích buněk.
Pro částečnou rekonstrukci místa s DSB je využito homologního duplexu = chromosomu (u diploidní
buňky).
Rekombinační oprava začíná odbouráním jednoho vlákna duplexu exonukleázou na obou fragmentech.
Bílkovina recA se váže k obnaženým „jednovláknům“ a iniciuje výměnu vláken s homologním duplexem,
čímž vznikají dvě blízká rekombinační místa. Další postup viz obr.

Rekombinační oprava DSB
recombination repair
A – dvouvláknový zlom, B – částečné odbourání jednoho z vláken v okolí zlomu a asociace s homologní
dvoušroubovicí (duplexem), C – pod vlivem recA nastává rekombinace poškozených a nepoškozených
úseků, D – syntéza komplementárních řetězců (vláken) DNA polymerázou, E – opravené dvoušroubovice

Věrnost oprav (repair fidelity)
Excizní opravy SSB jsou všeobecně považovány za téměř bezchybné. Pravděpodobnost chyb je
vyjadřována poměrem 1 : 107 až 1 : 1011.
Pravděpodobnost bezchybného spojení DSB je odhadována na jen asi 75% a dochází k němu zejména během
prvních dvou hodin po poškození.

Autor: Vojtěch Mornstein
Poslední revize: březen 2024