Andrologie Soňa Kloudová sona.kloudova@med.muni.cz 12.3.2024 • Spermie po svém vzniku ve varleti jsou nezralé a nepohyblivé→ maturace – v nadvarleti (optimální prostředí je tvořeno sekrety epiteliálních buněk) → zisk různých molekul proteinů a cholesterolu (modifikace) + změny okolních podmínek (teplota, osmotické podmínky, koncentrace iontů, ejakulace, podmínky v ženském reprodukčním traktu → motilita https://www.researchgate.net/figure/Molecular-mechanisms-involved-in-the- sperm-chemotaxis-mediated-by-progesterone-1-P-P-R_fig10_40484423 • Chemotaxe - různé chemické stimuly v prostředí – peptidy, proteiny, mastné kyseliny - u savců je zřejmě nejdůležitějším chemoatraktantem progesteron (kumulární buňky) - odorantový receptor (OR) spřažený s G proteinem – hOR17-4 – důležitá role u lidských spermií - ne všechny spermie budou reagovat na chemoatrakci (zřejmě variabilita v heterogenitě OR)- jeden z možných mechanismů selekce (působí ve velmi nízkých koncentracích přibližně na 10% buněk) -chemoatraktanty vylučuje i oocyt (hydrofobní nepeptidická látka-vázaná na protein) Další krok dozrávání se odehrává v děloze – fyziologické, biochemické a biofyzikální modifikace umožňující oplození: • kapacitace – série strukturálních a metabolických změn, kdy spermie získají schopnost interakce se ZP a akrozomální reakce: -změny v koncentraci iontů (zejména Ca2+ ), reorganizace lipidů v membránězvýšená fluidita membrány, hyperpolarizaci membrány, intracelulárním pH, fosforylaci proteinů a koncentraci ROS - rozpustná adenylyl cykláza – aktivace hydrogenuhličitanem a vápnatými ionty - s membránou asociované faktory nutné pro vazbu k oocytu a k fertilizaci – - hyperaktivace- změny v pohybu bičíku- progresivní pohyb se mění v rázný asymetrický pohyb bičíku s vysokou amplitudou, střídající se s obdobím téměř bez hybnosti - tato změna má zřejmě spermiím pomoci v pohybu v ženském reprodukčním traktu (průchod cervikálním hlenem, průchod oviduktem, penetrace kumulu oophoru) https://rep.bioscientifica.com/view/journals/rep/157/5/REP-18-0541.xml Schematické znázornění signálních drah zapojených do regulace hyperaktivace spermií savců. Progresivní motilita je regulována nízkou úrovní aktivity dráhy AC/cAMP/PKA, zatímco hyperaktivovaná motilita je indukována, když je druhá dráha aktivována na mnohem vyšší úroveň, v kombinaci s aktivací dráhy kalmodulin kinázy (CaMK) • Po maturaci a kapacitaci se spermie naváže k ZP oocytu a podstupuje akrozomální reakci -akutní nárůst vápenatých iontů (přechodné receptorové potenciálové kanály), na procesu akrozomální reakce a interakci s oocytem se podílí mnoho akrozomálních molekul -k akrozomální reakci může docházet i předčasně (před setkáním s oocytem)-spontánní akrozomová reakce- spermie disponuje několika ochrannými mechanismy -odhalení vnitřní akrozomální membrány spermie - interakce s ZP oocytu během penetrace do oocytu -plasmatická membrána spermie fuzuje s akrosomální membránou (uvolnění enzymatického obsahu) → natrávení ZP a uvolnění proteinů pokrývajících vnitřní akrozomální membránu → interakce s membránou oocytu • Zona pellucida obsahuje 3 proteiny interagující se spermií: ZP1, ZP2 a ZP3 (myš), receptory k těmto proteinům se nachází v PM spermií • Exocytóza akrozomů je proces zásadní pro úspěšnou fertilizaci • Po kapacitaci a akrosomální reakci spermie dojde k fúzi s plasmatickou membránou oocytu Maturace v nadvarleti • Transport spermií nadvarletem – zhruba 11 dnů • Spermie se v nadvarleti pohybují různým prostředímsetkávají se s různými stimuly, získávají různé proteiny a setkávají se s ve vodě rozpustnými částicemi s nízkou molekulární hmotností→ regulace objemu buňky • V proximálním nadvarleti jsou vystaveny působení enzymů a proteinům, podílejícím se na modifikaci membrány (splynutí spermie s oocytem) • střední region nadvarlete- další modifikace membrányaktivace dalších enzymů a proteinů asociovaných s transportem sterolů, které mohou modifikovat membránu a umožnit příjem GPI vázaných proteinů • Více distálně se zvyšuje koncentrace glukosidázy a proteázy, proteinů zapojených do vazby k ZP a fúzi s oocytem, hlavního maturačního antigenu CD52, antimikrobiální aktivity a dekapacitačních faktorů → přežití před ejakulací https://www.frontiersin.org/files/Articles/341053/fendo-09-00059-HTML/image_m/fendo-09- 00059-g001.jpg • Adherence proteinů k různým doménám (membrána nad akrozomem nebo eqvatoriálním segmentem) závisí na povaze proteinů, složení membrány a prostředí, ve kterém se spermie nachází: v případě kapacitující spermie je místem reakce membrána akrosomu, v případě akrozom reagované spermie je místem reakce ekvatoriální segment; umístění pak může určovat roli při vazbě na ZP nebo membránu oocytu. • Membrány i proteiny jsou modifikovány během průchodu nadvarletem rozdílnou enzymatickou aktivitou (glykosyl transferázy, glykosidázy, proteázy…) různých regionů nadvarlete; dochází k sekreci různých makromolekul, které se váží k maturující spermii, k sekreci nízkomolekulárních iontů a organických osmolytů, které jsou přijímány a regulují objem buňky, udržují spermii v klidovém stavu (nízký obsah Na+ iontů a vysoký obsah K + → toto iontové prostředí zároveň pomáhá držet elektorstaticky navázané proteiny na povrchu spermie a podporuje aktivitu mitochondrií Motilita • Schopnost motility získávají spermie v nadvarleti, nicméně pohyblivé jsou až po smísení se semennou plasmou; později v ženském pohlavním traktu je aktivován hyperaktivní pohyb • Hodnotí se: podíl pohyblivých spermií (progresivní, rychlé, progresivní pomalé, neprogresivní, bez pohybu) a pomocí počítačové analýzy navíc frekvence kmitání bičíku, plocha kterou zahrnuje kmit bičíku, maximální amplituda vlny • CASA (computer-aided semen analyzer) – pohyb hlavičky (křivočará a přímočará rychlost, linearita ) • trajektorie, amplituda bočního posunutí hlavy Hodnocení motility v laboratoři: Na nativním preparátu, při fázovém kontrastu, vždy 2 vzorky a 200 spermií • Podíl spermií rychle progresivních (kategorie a): rychlost vyšší než 25 µm/s • Podíl spermií pomalu progresivních (kategorie b) rychlost 5-25 µm/s • Podíl spermií hýbajících se na místě (kategorie c) • Podíl spermií bez pohybu (kategorie d) Důležitost tréningu! Norma: Podíl progresivních spermií ≥30% Celkový podíl motilních spermií: ≥ 42% https://youtu.be/G42ep3OA5ws • Axonema – struktura odpovědná za pohyb → vlny šířící se dozadu podél osy, aby vytvořily dopředný hnací tah • 9 periferních dvojic mikrotubulů a dva centrální mikrotubuly, dyneinová ramena vyčnívají z mikrotubulu A směrem k mikrotubulu B přilehlého dabletu → aktivní posuv mikrotubulů • Sousedící mikrotubuly jsou k sobě připojeny nexiny a k centrálním mikrotubulům vybíhají obklopující radiální spojky • Dynein – konverze chemické energie hydrolýzou ATP do mechanické energie pohybu • vnější dyneinová ramena jsou rozmístěna 24 nm od sebe podél mikrotubulu A a jsou k němu přichyceny a drženy v ATP nesensitivním stavu pomocí tří peptidů (dyneinový dokovací komplex) - ovlivňují maximální rychlost klouzání vnějších dvojic mikrotubulů • vnitřní dyneinová ramena jsou rozmístěna po 96 nm - ovlivňují tvar vlny, regulují symetrie úderů, poskytují dodatečnou sílu potřebnou k udržení rychlosti • Dyneinové rameno: těžký řetězec - centrální motorová část s vazebnými místy pro 4 ATP a mikrotubuly střední řetězec – na bázi dyneinového ramene, ATP nesensitivní vazba ramen k mikrotubulům lehký řetězec – proteiny různých funkcí ( vazba vápenatých iontů, struktury podobné thioredoxinu, struktury s repeticemi bohatými na leucin apod.) - variabilita ve struktuře a funkci těchto jednotek https://www.frontiersin.org/files/Articles/1034951/fgene-13- 1034951-HTML/image_m/fgene-13-1034951-g002.jpg https://cell.com/fulltext/S0092-8674%2814%2901306-3 • Dyneinový regulační komplex – 7 polypeptidů, pevně navázán na svazek mikrotubulů, lešení pro enzymy modulující aktivitu dyneinu, senzor napětí či deformace axonemy se zpětnou vazbou rameni dyneinu • Radiální paprsky - struktury tvaru T, přiléhají k vnitřním dyneinovým ramenům a jsou ukotveny na mikrotubulech A, směřují k centrálnímu páru mikrotubulů • Centrální mikrotubuly a radiální paprsky nejsou nezbytné pro pohyb; mechanický a chemický převodník signálu-řízení velikosti a tvaru pohybu bičíku, modifikace pohybu v závislosti na konkrétním signálu; regulují velocitu klouzání; ovlivňují pohyb ve dvou nebo třech dimenzích a plochu kmitání bičíku α a β tubuliny – zásadní význam pro pohyb, globulární proteiny (50-55 kDa, heterodimery (jeden α a jeden β řetězec) • Podélné spojení tubulinů vytváří protofilamenta (a laterální spojení 13. a 11. protofilamenta tvoří mikrotubuly A a B) • Vnější dabletové mikrotubuly jsou vázány nexiny (pravděpodobně v souvislosti s dyneinovým regulačním komplexem) • Fibrózní pochva – obklopuje axonema, denzní vlákna (proteinová vlákna bohatá na cystein, serin a prolin, vysoký stupeň přemostění zinek dependentními disulfidy); každý dablet je asociován s vnějším denzním vláknem; zajištění elasticity a zřejmě i určitá role v regulaci motility -tvořena třemi longitudinálními sloupci přichycenými k mikrotubulovým dabletům, které probíhají podél hlavní části bičíku → toto uspořádání a dvojitá sulfidová vazba mezi proteiny umožňují ovlivňovat pohyb (rovinu i tvar plochy ve které se bičík pohybuje) -opora a lešení pro enzymy které regulují a modifikují aktivitu dyneinů, senzor tlaku, mechanická zpětná vazba pro dyneinová ramena Proteiny nacházející se ve fibrózní pochvě: • Rhophilin – protein lokalizovaný na vnějším povrchu denzních vláken, váže se na něj ropporin, protein specifický pro spermie, přichycený k vnitřní straně fibrózní pochvy • Enzymy asociované s glykolýzou: glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza-S, hexokináza HK-1-S, glutathion S transferáza • Mitochondrie –naléhají těsně a spirálovitě na fibrózní pochvu -odolnost proti hypotonickým podmínkám a schopnost využívat laktát https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1016/S0014- 5793%2899%2900087-3 • Schopnost motilityje získána během průchodu nadvarletem, ale projeví se až po smísení se semennou plasmou • zdroje ATP: cukry semenné plasmy –glukóza a fruktóza – udrží spermie v pohybu po hodiny • Pro motilitu je důležitá zejména glykolýza (i když oxidativní fosforylace v mitochondriích je pro produkci ATP účinnější) –glyceraldehyd- 3 fosfát dehydrogenáza- S - specifický pro spermie, 90% produkce ATP • Hydriogenuhličitanový aniont (bikarbonát)– v semenné plasmě, aktivuje mnoho funkcí spermie, mimo jiné i iniciaci motility-zvyšuje intracelulární pH, stimuluje respirační aktivitu, zesiluje otevření napětím řízené kanály pro Ca2+a aktivují atypickou adenylyl cyklázu→ zvýšení koncentrace Ca2+ a cAMP→ stimulace pohybu • Inhibitory fosfodiesterázy (↑cAMP) v léčivech stimulují motilitu spermií • Využití v IVF-teophylin • cAMP stimulují PKA (protein kináza A) • Pro pohyb je následně zásadní složení PKA a AKAP (A kinase anchoring protein) • Regulační podjednotky PKA byly nalezeny na fibrózní pochvě i na vnějších denzních vláknech ne však v mikrotubulech- hraje roli v klouzání fibrózní pochvy po přiléhajících vnějších denzních vláknech • Při kapacitaci spermií dochází k rychlému nárůstu buněčného cAMP a k efluxu cholesterolu z plazmatické embrány → zvýšení koncentrace hydrogenuhličitanových a vápenatých iontů →aktivace adenylylcyklázy → produkce dalších cAMP z ATP → hyperaktivní motilita a iniciace akrozomální reakce • Viz video normální vs hyperaktivovaný pohyb • What hyperactive sperm looks like - Curious (science.org.au) Stimulace pohybu v ženském pohlavím traktu Mnoho chemických i fyzikálních stimulů → • Chemotaxe – pohyb stimulovaný chemoatraktantem; progesteron, estrogen, ANP (atrial natriuretic peptid), chemický gradient • Haptotaxe -buňky se pohybují ve směru gradientu molekul • Termotaxe- pohyb v reakci na teplotní rozdíl (mezi isthmem a místem oplození je až 2◦C) • Rheotaxe –odmytí bakterií, dalších buněk a buněčných úlomků z ejakulátu, selekce na základě motility-pohyb proti proudu Mitochondrie spermií • významná role pro schopnost oplození oocytu, zdroj ATP pro primární homeostázu a částečně pro pohyb • Oxidační fosforylace • proces generování ATP a funkční dynamika nejsou plně objasněny • Ca2+ -hlavní regulátor oxidační fosforylace; primární metabolický mediátor pro produkci NAD, regulace enzymatické aktivity pyruvátdehydrogenázy, isocytrátdehydrogenázy a αketoglutarátdehydrogenázy, produkce ATP (posforylace ADP), podílí se na apoptóze (spuštění proapoptických signálů) • Významné generátory ROS (spermie jsou extrémně náchylné k oxidačnímu stresu-malý objem cytoplasmy, nízká antioxidační aktivita, vysoký obsah polynenasycených mastných kyselin v membránách) https://info.selectbreeders.com/blog/the-sperm-mitochondrion-organelle-of-many-functions Fyziologická a patologická funkce mitochondrií spermií ROS - důležitá role ve fyziologii spermií - spouštěče procesů oplodnění (hyperaktivace, akrozomální reakce a vazba spermie na oocyt) mitochondriální dysfunkce→ nerovnováha mezi produkcí ROS a antioxidační kapacitou → oxidační stres → poškození struktur spermií, peroxidace lipidů plazmatické membrány a poškození DNA → ztráta biologických funkcí spermií - reparace struktur spermií není možná- chybí cytoplazmatické reparační enzymy Mechanismus vziku ROS v mitochondriích • Mitochondriální prostředí je bohaté na kyslík a elektrony → redukce kyslíku na vodu(konečný produkt oxidační fosforylace) • Některé elektrony unikají procesu oxidační fosforylace a váží se na molekulární kyslík →superoxidový anion → reakční kaskáda generující další ROS (peroxid vodíku, hydroxylový radikál) • Asi 2% metabolitovaného kyslíku se mění na superoxidový anion • ROS jsou zahrnuty do spuštění mnoha funkčních procesů- kapacitace, akrozomální reakce, interakce se ZP • Antioxidační mechanismus- SOD (superoxid dismutáza) - dismutace dvou molekul superoxidového aniontu na kyslík a peroxid vodíku • Problematika oxidačního stresu je široce diskutována, dalšími zdroji ROS jsou kulaté buňky- leukocyty i vývojové prekursory spermií • Byla popsána souvislost mezi neplodností a poškozenými mitochondriemi, nicméně spermie s vysokým mitochondriální membránovým potenciálem byly detekovány i ve spermatu plodných mužů • Byla také popsána korelace mezi nižším BR (blastulation rate-podíl tvorby blastocyst) a zvýšeným oxidačním stresem v ejakulátu • K poškození mitochondrií dochází i během kryokonzervace spermií, což může mít za následek poškození DNA spermií, snížení motility apod- využití antioxidnatů jako přídavků do média?