Andrologie Soňa Kloudová sona.kloudova@med.muni.cz 23.4.2024 Historie • 1776- Lazaro Spallanzani - pokus o uchování spermatu ve sněhu © • 1949 - Ernst John Christopher Polge - kryoprotektivní vlastnosti glycerolu • 1951 - první potomek z kryokonzervovaného ejakulátu -skot • 1953 - první dítě z kryokonzervovaného ejakulátu (suchý led) • 70. léta 20. století-vznik lidské kryobanky • Rozvoj inseminací u zvířat • Důležitý pokrok v oblasti technik asistované reprodukce u lidí Využití kryokonzervovaných spermií • U zvířat- inseminace - „genetické zlepšení" • Metoda k řízení a uchování plodnosti -medicínské důvody-chirurgická léčba, chemoterapie, rádioterapie, hormonálni terapie -před pubertou - odběr tkáně z varlete, kryokonzervace spermatogoniálních kmenových buněk nebo testikulární tkáně - transgender osoby - social freezing -např. nebezpečné povolání, Vasektomie • Léčba neplodnosti - nemožnost odběru v den OPU, komplikovaný odběr, těžké Oligozoospermie, vzorky (extrakce spermií z varlete-TESE nebo aspirace spermií z nadvarlete -MESA), dárcovství spermií -využití pro IUI, IVF, ICSI Patient Condition Sperm Collection Method What Makes Them Eligible for Sperm Banking? Adult cancer Frequent ejaculation Frequent ejaculation (when they are Cancer and related therapies damage the gonads and impair spermatogenesis Adolescent cancer sexually mature), penile vibratory stimulation, and electroejaculation Same as above Cancer in prepuDescent males Testicular tissue freezing Cancer treatment negatively affects spermatogenesis; testicular tissue extraction is a promising experimental procedure Preoperative surgical procedure to trea: or Frequent ejaculation Bilateral varicocele ligation, prior to vasectomy induce infertility Non-malignant disease Frequent ejaculation Systemic stress may impair spermatogenesis; gonadotoxic therapies affect semen quality Exposure to harmful chemicals may decrease fertility or cause chromosomal Occupational risk Frequent ejaculation damage in the germ cells; facing hazardous situations that may result in an accident that causes infertility Posthumous sperm Electroejaculation surgical removal of testes Performed at the time of brain death based upon the patient's will or family cryopreservation and epididymides request Sex change/ gender Frequent ejaculation removal of testicular Hormone therapy damages spermatogenesis, and gender reassignment reassignment tissue surgery sterilizes the male Cryopreservation of Sperm: A Review Gururaj" M. Borate 1 , Ajay MEShram 1 Biologie kryokonzervace spermií • malá buňky s velkým povrchem -> vliv na viskozitu a teplotu skelného přechodu cytosolu - menší náchylnost k poškození • v nepřítomnosti kryoprotektiv - šok chladem + tvorba krystalů -> destrukce buněčných organel • Principem úspěchu je minimalizace tvorby krystalů • nutnost přídavku kryoprotektiv a látek stabilizujících membrány • kryotoleranci a chladovou toleranci ovlivňuje lipidové složení membrán -mezidruhové rozdíly (rozdíly v profilu mastných kyselin a v poměru omega3 /omega 6 mastných kyselin), rozdílná velikost i tvar spermií • Na přežití spermií po kryokonzervaci má vliv také funkční kvalita spermií před zamrazením -asthenozoospermiecké vzorky jsou náchylnější k poškození mrazem, dochází ke snížení fertilizační schopnosti Ultrastrukturální změny během kryokonzervace Rozpad akrozomu, částečné odnětí vnější akrozomální membrány- důsledek tvorby krystalů extracelulárních roztoků osmotické změny vedoucí k poškození lipidových membrán (změny napětí v membránových kanálech, úniky iontů)-> morfologické změny Poškození proteinů cytoskeletu (např. aktin, vimentin) - zvrásnení cytoplasmy, bobtnání subakrosomální oblasti, ztráta obsahu akrosomu, vesikulovitý vzhled, zvýšený podíl volných hlaviček a defektů bičíku Poškození mitochondrií a jejich funkcí Oxidační stres rychlejší mrazení redukuje ultrastrukturální změny a chrání integritu spermií v porovnání s pomalým mrazením Nejlepší ochranné vlastnosti pro spermie má glycerol glycerol v kombinaci s vaječným žloutkem nejlépe chrání apikální část akrozom a mitochondrie během kryokonzervace dochází k ovlivnění exprese genů a proteinů, stability mRNA a k určitým změnám na epigenetické úrovni (metylace DNA) Změny v expresi klíčových genů vztahujících se k plodnosti - u kance dochází po kryokonzervaci ke změně v expresi 41 genů změny v expresi AKAP3, SOD 1 nebo HSP90 (hraje roli v motilitě) změny v proteinech vztahujících se k motilitě, vitalitě a integritě akrozómu (mitochondriální akonitát hydratáza, tektin 1, alfa-enoláza, vimentin), změny v hladině fosforylace tyrosinu, změna v proteinech ovlivňujících metabolismus spermií po kryokonzervaci dochází ke snížení motility, funkčnosti plasmatické membrány, integrity akrozómu, viability Mechanismy nejsou zcela objasněny - změna osmolarity, intracelulární tvorba krystalů zvýšená produkce ROS a snížená antioxidační kapacita enzymů-> oxidace DNA -> zlomy do kryokonzervačních médií se často přidávají antioxidanty korelace mezi snížením motility a defekty mitochondrií po rozmražení Molecular alterations DNA fragmentation WM Degradation of mRNA 7^".......■..........in n i ii 11 n i^00...* Alterations in miRNA cargo TTTTTTTT Alterations in DNA methylation ^^^^ Changes in DNA/protamine complex o ^ o Structural alterations Formation of ice crystals Exocytosis Acrosome damage Decreased metabolic activity Changes in motility and kinematic parameters Apoptotic-like changes https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432021002190 Table 1. Freezability markers identified in cattle, pig, sheep and horse sperm. Marker Sperm proteins proAKAP4 Heat shock protein 90AA1(HSP90AA1) Heat shock protein 8 (HSPA8) Aquaporin 7 (AQP7) Aquaporin 3 (AQP3) Voltage-depend ent anion channel 2 (VDAC2) Glutathione S-transferase Mu 3 (CSTIVB) SP proteins Fibroncctin-1 (FN1) 26 S proteasome and CCT complex Acid seminal fluid proteins (aSFP) Effects Could help predict factors underlying cryogenic damage, such as oxidative stress Species Reference Horse Pijj Sheep Maintain metabolic and structural integrity Cattle of cells under stress conditions Involved in the permeability of the plasma membrane to water and permeable cryoprotectants Allows the transport of ions Involved in cellular protection against oxidative stress Could help predict factors underlying cryogenic damage, such as oxidative stress Pis Cattle Pis Pis P'S Pis [Blommaert et al., 2019) [Perej-Patino et al., 2019a) [Riesco etal., 2020) [Zhang et .il., 2015) [Casasetal., 2010] Cattle [Holt et al., 2015) [Prieto-Martinez et al,, 2017b) [Prieto-Martinez et al,, 2017a) [Vilagran et al., 2014] [Llavanera et al,, 2019) [Vilagran et al., 2015] Sheep [Rickand et a],, 2015) Cattle [E inspanier et al., 1994) https://www.sciencedirect.com/science /article/pii/S0378432021002190 Proces kryokonzervace • Kryoprotektanty permeabilní: Glycerol, DMSO -průnik do buňky, zábrana tvorby krystalů • Kryoprotektanty nepermeabilní: albuminy, dextrany, vaječný žloutek (lipoproteiny) -ochrana membrány na povrchu buňky • Prepubescentní odběr tkáně z varlete- DMSO a sacharóza • Lidské spermie jsou relativně tolerantní k teplotnímu šoku (rychlé ochlazení/oteplení) -pravděpodobně díky vysoké fluiditě membrán (nízký podíl nenasycených vs. nasycených mastných kyseliny), nízkému obsahu vody (50%) • Přesto pokles motility spermií o 30- 50 % • Cooling rate- klíčový parametr, rychlost ochlazení (i zahřívání-warming rate) musí být kontrolována • Klasická kryokonzervace - delší mrazící procedura, vyšší objemy dávky • Vitrifikace - rychlejší procedura -vysoký rychlost chlazení, malé objemy spermií, přímý kontakt s tekutým dusíkem (riziko kroskontaminace) • Na počátku byla kryokonzervační média připravována přímo v laboratoři • Dnes komerčně dostupná s vhodnou certifikací • Metoda mrazení podle doporučení výrobce (ejakulát nebo promytá suspenze spermií se s mísí v určitém poměru s mrazícím médiem, umístí se do nosiče a zamrazí) • Často se využívá umístění dávek do par tekutého dusíku, mnohdy v kombinaci s preekvilibrací v chladničce • Nutnost kvalitního značení dávek!!!! • Nutnost dobré kontroly-dvojitá kontrola nebo matcher systém • Dokumentace: souhlas se zamrazením a souhlas s případnou likvidací! • Složení kryokonzervačních média: glycerol, TRIS, cukry (fruktóza, sacharóza, threalóza), vaječný žloutek, antibiotika (gentamicin), antioxidanty (vit Ca E, glutathion, SOD, kataláza...) • Mrazící protokoly: rychlé mrazení v parách dusíku (-167°C) -nejčastější vitrifikace (přímo do tekutého dusíku: -196°C)-zřídka manuální pomalé mrazení programované pomalé mrazení-skoro se již nepoužívá • Příklady způsobu rozmrazení: rychlé při 37°C 5 minut v pokojové teplotě a následné ponoření do 37°C rychlé rozmrazení při 40°C rozmrazení při pokojové teplotě g ies 1 Pre-cn/opreservation selection of motile spermatwoa r ^ Post th.iwinp, spofm selection Addition ol antioxidants to cryoprotectants Addition ol growth factors or plateJet-rich plasma Sperm lyophili/ation Use of alternative devices for low sperm number Int.J. Mol.Sci. 2023, 24, 4656 SPERM VITRIFICATION DEVICE PRODUCT INFORMATION Categories: Andrology. Andrology Cryo. The ability to cryopreserve a small number of human spermatozoa is essential in cases of severe male infertility, especially for patients requiring surgical sperm retrieval. Možno vložit přímo na ICSI misku / Video: ttps://youtu.be/nDyvr2Z6jKs öoöj 1 Kryobanka • Otevřený systém - dříve častý • Uzavřený systém - těsný svár, nyní preferenčně • Autologní / alogení (dárcovská) • Uložení v tekutém dusíku nebo v parách dusíku (zabránění kroskontaminace) • Procesy zpracování, uložení a uchování buněk musí být bezpečné s ohledem na prevenci přenosu infekčních chorob a na udržení kvality -čidla na monitoring teploty • SARS-CoV-2 -v ejakulátu byl virus prokázán pouze zřídka, ale asociace onemocněním a sníženou kvalitou ejakulátu • Při kryokonzervaci ejakulátu/spermií je důležité dodržovat bezpečnost! • Zásady práce s tekutým dusíkem • Ochranný oděv, rukavice, štít/brýle, s dávkami manipulujeme pinzetou • Systémy detekce kyslíku - > Methods Mol Biol. 2021:2180:721-730. doi: 10.1007/978-1-0716-0783-1_39, Preservation of Mammalian Sperm by Freeze-Drying Levent Keskintepe 1 2,AliEroglu 3 4 Affiliations + expand PMID: 32797445 DOI: 10.1007/978-1-0716-0783-1_39 Abstract Long-term preservation of mammalian sperm at suprazero temperatures is desired to save storage and space costs, as well as to facilitate transport of preserved samples. This can be accomplished by the freeze-drying of sperm samples. Although freeze-drying results in immotile and membrane-compromised sperm, intracytoplasmic sperm injection [ICSI) can be used to introduce such an immotile sperm into an oocyte and thus start the fertilization process. So far, it has been shown that improved freeze-drying protocols preserve chromosomal integrity and oocyte-activating factor (s) in rodent and mammalian species at 4 °C for several years and at ambient temperature for up to 1 year depending on species, which permits shipping freeze-dried samples at ambient temperature. This chapter concisely reviews freeze-drying of mammalian sperm first and then presents a simple freeze-drying protocol. Keywords: Cryopreservation; Cryoprotectant; EDTA; EGTA; Freeze-drying; Freezing; ICSI; Intracytoplasmic sperm injection; Long-term storage; Rosmarinic acid; Sperm; Spermatozoa; Trehalose. PubMed Disclaimer Similar articles Freeze-drvina of mammalian sperm. > Biopreserv Biobank. 2022 Feb;20(1):31-37, doi: 10.1089/bio.2020.0167. Epub 2021 May 27. Trehalose Attenuates Detrimental Effects of Freeze-Drying on Human Sperm Parameters Elaheh Shahmoradi 1, Nafiseh Baheiraei 2, Iman Halvaei 1 Affiliations + expand PMID: 34042510 DOI: 10.1089/bio.2020.0157 Abstract Freeze-drying is one of the sperm preservation methods leading to the long-term preservation of sperm genetic material. Our main goal of this study was to evaluate the effect of the trehalose freeze-drying method on sperm motility, viability, morphology, acrosome, and DNA integrity compared with a standard protocol without trehalose. Twenty-five norrnozoospermic samples were included in this prospective study. Direct swim-up was used for sperm preparation. An experiment was performed on freeze-dried samples containing trehalose (0.2 M), and the results were compared to that without trehalose. The sperm parameters, including count, motility, morphology, viability, acrosome reaction, DNA denaturation, and DNA fragmentation, were evaluated before and after freeze-drying in both groups. The spermatozoa were totally immotile after freeze-drying in both groups. Sperm viability, acrosome integrity, and nondenatured sperm DNA were significantly higher in the trehalose group in comparison with that of without trehalose group, Nonfragmented sperm DNA showed an increasing trend in the trehalose group compared to the group without trehalose. While freeze-drying significantly reduced normal morphology, the addition of trehalose did not affect this parameter. The results of this study showed that trehalose can attenuate the detrimental effects of freeze-drying on human sperm parameters, Keywords: DNA integrity; cryodeskcation; freeze-drying; lyophilization; sperm; trehalose. Dárcovství spermií • Mladý zdravý muž • V ČR do 40 let, anonymní • Normální výsledek vyšetření spermiogramu • Vyšetření Hepatitída B a C, HIV, Syphylis, Chlamydie • 180 dnů karanténa -> uvolnění do darovacího procesu • Genetické vyšetření - kary o typ, CFTR, SMA, GJB 2 • Výběr podle krevní skupiny a charakteristických rysů 9 tř. Kosmonautů 1338/la, Olomouc EUROPEAN SPERM-BANK https://eshop.myspermbank.cz/ Filtrovat podle: 1 00 \ Typ vlasů ▼ Barva vlasů ▼ ■ Vzdělání -L J P 1 Krev -L J P ' RH faktor - Astrologické znamení ▼ Použití - Výška - Aken Alex Algiz Ares