Histologie a Embryologie Přednášející: Doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc., přednosta ústavu Doc. RNDr. Petr Vaňhara, Ph.D. Brno, 2024 Přednáška 1 Úvod • Předmět a význam histologie, její členění. • Hraniční oblasti histologie. • Historie, současnost a budoucnost histologie. Cytologie • Buňka: definice, obecná stavba, kompartmentalizace. • Buněčné jádro: ultrastruktura a funkční význam, chromosomy, jadérko. • Endoplasmatické retikulum • Golgiho aparát • Centrosom • Mitochondrie • Lyzosomy + Peroxisomy • Cytoplasmatické inkluze • Cytoskelet • Buněčné povrchy • Buněčný cyklus, dělení buněk, diferenciace buněk Histologie Mikroskopická a submikroskopická struktura těla (buňky, mezibuněčná hmota, tekutiny) Mikroskopická anatomie Složení a struktura orgánových systémů & individuálních orgánů Jaké typy tkání a jak jsou organizovány? Jaké speciální buněčné typy? Které speciální struktury? (např. tubuly) Jak to celé funguje? Cytologie Struktura buňky a její vztah k funkci. Obecná histologie Jaké jsou základní typy tkání? Jaké jsou jejich funkce? Jakými buněčnými typy jsou tvořeny? Toto vše je odrazem hierarchické struktury mnohobuněčných organismů Histologie není statickou disciplínou, která se zabývá výhradně strukturou !!! Histologie Buněčná biologie Fyziologie Patologie Biochemie Molekulární biologie Anatomie Embryologie Spojme si histologii s akcí a pohybem Mysleme „histologicky“ Studium histologie se poprvé stalo povinným v roce 1893 na John’s Hopkins Medical School ! Mnoho velkých histologů byli Němci, protože vyráběli kvalitní mikroskopy. Eponymously theirs….. Jan Evangelista Purkyně 1787 - 1869 Český fyziolog • Pionýr histologických technik Poprvé použil přístroj podobný současnému mikrotomu • Zavedl termín plasma • Popsal Purkyňova vlákna v srdci • Popsal Purkyňovy buňky v kůře mozečku Schwann + Schleiden – 1839 – buněčná teorie “Once the development was ended, the founts of growth and regeneration of the axons and dendrites dried up irrevocably. In the adult centers, the nerve paths are something fixed, ended, and immutable. Everything may die, nothing may be regenerated. It is for the science of the future to change, if possible, this harsh decree.” Santiago Ramón Y Cajal 1852 - 1934 Španělský lékař a anatom Poprvé popsal neuron jako primární strukturální a funkční jednotku nervové tkáně. Nobelova cena v roce 1906 Neočekávané objevy Existence multipotentních sebeobnovujících se progenitorů v postnatálním a dospělém nervovém systému • Subventrikulární zána laterálních komor mozku • Subgranulární zóna v gyrus dentaus hipokampu BEZPOCHYBY V: • Kůra koncového mozku ? • Amygdala ? MOŽNÁ V: (od časných 90-tých let) Náš pohled na organizaci centrálního nervového sytému se dramaticky změnil !!! Histologické metody studia buněk a tkání 1 Učinit pozorovatelným Stabilizovat struktury Fixace Učinit objekty menšími – prostupnými pro světlo Zalití + Příprava řezů Zviditelnit struktury „Barvení“ Zvětšit Použití mikroskopů Světelné (optické) mikroskopy (interakce fotonů s hmotou) Rozlišení 0.1 mm • Pouze s viditelným světlem • S fluorescenčním světlem • Konfokální laserový skenovací mikr. Elektronové mikroskopy (interakce elektronů s hmotou) Rolišení až 0.1 nm (v praxi 1 nm) • Transmisní • Skenovací Fixace (denaturace) • Organická rozpouštědla (etanol, metanol, aceton,…) • Aldehydy (form-, paraform-, glutar-aldehyd, …) • Organické kyseliny (octová, pikrová, …) • Soli těžkých kovů (rtuť, chrom, osmium, …) Zalití + Krájení (řezy) • Parafinový vosk • Celloidin (=nitrát celulózy) • Durcupan (syntetický polymer) • LR White (syntetický polymer) • jiné „Barvení“ Chemická přehledná barviva (H+E, Azan, van Gieson, …) Histochemické reakce (průkaz proteinů/enzymů, lipidů, cukrů, …) Imunochemické reakce (značené protilátky) Ťěžké kovy (pro TEM – soli uranu, olova, wolframu, …) Histologické metody studia buněk a tkání 2 Pochopení komplexních systémů musí stát na pochopení struktury a funkce jejich součástí Tkáně Buňky Buňky Buňky Tekutiny Extracelulární matrix Vše je produktem buněk ! Tekutiny • Intersticiální tekutina • Plazma (krev) • Lymfa (v lymfatických cévách) • Cerebrospinální mok • Intracelulární tekutina (cytosol) Živé organismy jsou tvořeny buňkami Dlouhá cesta k tomuto odhalení: Robert Hooke 1665 Poprvé viděl buňky korku - cell Antonie van Leeuwenhoek 1678 Poprvé uviděl mikroskopické organismy (bakterie, prvoky) Rudolph Virchow 1855 Buňka může vzniknout pouze z již existující buňky „Omnis cellula e cellula“ Matthias Schleiden Theodor Schwann Všechny organismy jsou tvořeny jednou nebo více buňkami 1839 Současná buněčná teorie – 6 principů na kterých stojí • Buňka je nejmenší strukturní a funkční jednotka schopná životních procesů • Funkce každé buňky je dána její specifickou strukturou • Buňky jsou stavební jednotky všech mnohobuněčných organismů, všechny funkce v organismu jsou plněny buňkami • Struktura a funkce všech organizmů je závislá na strukturálních a funkčních vlastnostech buněk, kterými jsou tvořeny • Všechny nové buňky vznikají z buněk již existujících • Díky kontinuitě života na zemi jsou buňky všech organizmů principiálně stejné (univerzální genetický kód a jeho exprese) Svalové vlákno Neuron Nervosvalové spojení Anafáze Telofáze Přes jednotné organizační schéma, je typickou vlastností eukaryontních buněk jejich strukturální a funkční diverzita Také buňky člověka jsou strukturálně a funkčně extrémně rozmanité Vajíčko Spermie Neuron v mozku Tuková buňka Buňka sliznice střeva Buňky krve Buňka svalu Buňka kosti Tato různorodost je předpokladem pro schopnost buněk plnit v organismu člověka specializované funkce Žádná buňka není zcela stejná jako buňky ostatní, všechny buňky ale mají společné strukturální a funkční znaky. Ne všechny buňky obsahují všechny komponenty, o kterých budeme mluvit ! Buňky mají 3 hlavní součásti: 1. Plazmatickou membránu 2. Cytoplazmu 3. Jádro (eukaryontní b.) 1 2 3 Organizace buňky je postavena na KOMPARTMENTALIZACI Specializované funkce se mohou plnit v různých sektorech buňky Membrány tvoří hranice mezi jednotlivými kompartmenty Unikátní proteinové a lipidové komponenty a unikátní funkce Unikátní kontrola pohybu molekul Unikátní složení obklopeného prostoru Kompartmenty & Membrány Mnoho malých kompartmentů je lepší Více plochy pro: • regulaci • výměnu živin • odstranění odpadních látek Větší plocha membrány na obklopený objem Plocha povrchu je proporcionální se čtvercem poloměru (r2). Objem je proporcionální se třetí mocninou poloměru (r3). Zmnožení X Redukce vybraných kompartmentů Diferenciace buněk Specializace buněk pro různé funkce Drsné ER v sekrečních buňkách Mitochondrie v buňkách srdeční svaloviny Struktura biologické membrány 1 ~2.5 nm ~2.5 nm 7-10 nm ~2.5 nm Elektron denzní Elektron opakní Elektron denzní Membránová jednotka společná všem membránám Buněčné membrány viděné elektronovým mikroskopem (pseudokolorováno) Fluidní mosaika – Dvojvrstva lipidů s mobilními globulárními proteiny Polární fosfolipidové zbytky Cholesterol Nepolární fosfolipidové zbytky Hydrofilní segment Hydrofobní segment Struktura biologické membrány 2 Membránové lipidy Představují 90-99% molekul v membráně (v počtech). • Fosfolipidy - 75% • Cholesterol - 20% • Glykolipidy - 5% - pouze cytoplazmatická membrána - GLYCOCALYX Membránové proteiny Představují 1-10% všech molekul, ale 50% hmotnosti díky jejich velikosti. Přenos signálůTransport Identita buněk Adheze buněk Enzymatická aktivita PeriferníIntegrální + Struktura biologické membrány 3 Organely Ohraničené membránou • Endoplasmatické retikulum • Golgiho aparát • Lyzosomy • Endosomy • Peroxisomy • Mitochondrie Specializované vnitřní struktury se specializovanými funkcemi Bez membrány • Ribosomy • Centrosomy • Centrioly • Bazální tělíska Vztah mezi strukturou buňky a její specifickou funkcí Např.: potřeba hodně energie → hojnost mitochondrií Jádro 1 obalem ohraničená struktura Jádro jaterní buňky Nejčastěji: • Sférické (5-10 mm) (lobulární, prohnuté, diskovité,…) • Uloženo centrálně • Jedno v buňce (osteoklast více, erytrocyt žádné) Jádro Perinukleární cisterna Lamina Membránová jednotka 20-50 nm 80-100 nm Vnější j. membrána Vnitřní jaderná membránaMembránová jednotka Jádro 2 Jaderný obal - pokračování Laminy: • Intermediární filamenta - proteiny (A, B, C) • Tvoří síť na vnitřní straně vnitřní jad. membrány, pronikají i do nukleoplazmy • Udržují pevnost a architekturu jádra • Ukotvují chromatin • Regulují replikaci DNA a tranksripci rRNA • Účastní se regulace apoptózy Laminopatie • Lidské choroby (nejméně 13 známých) • Mutace v genech pro laminy (popsáno asi 200 mutací) • Deregulace exprese genů • Předčasné stárnutí Hutchinson-Gilford progerie Vzácná - 1-4 na 8 milionů porodů Missense mutace v laminu typu A Perinukleární cisterna Lamina Membránová jednotka 20-50 nm 80-100 nm Vnější jaderná membrána Vnitřní jaderná membránaMembránová jednotka Jádro 4 Chromatin Heterochromatin Feulgen positivní – tmavé ve světelném mikr. Tmavé/denzní granula v TEM Transkripčně inaktivní Euchromatin Světlejší ve světelném mikroskopu Relaxované chromosomy Transkripčně aktivní Interfázové jádro 2 nm Dvojšroubovice DNA 30 nm Vlákno chromatinu – seskládané nukleosomy Jádro 3 Komplex jaderného póru Průměr ~ 100 – 125 nm Tři kruhy (každý 8 podjednotek) Vnitřní vláknitý košík Distální kruh Jaderný kruh Cytoplazm. kruh Transport jadernými póry (Nukleocytoplazmatický přesun) • Proteiny, RNA, podjednotky ribosomů • Oboustranný • Vyžaduje jaderné lokalizační/exportní signály • Podporován importiny/exportiny • Regulován Ran GTPázami Jádro 5 Jadérko jadérkojaderná membrána nucleoplazma cytoplazma Není ohraničeno membránou Hlavní funkce Syntéza RNA Skládání ribosomů Pars fibrosa Primární transkripty rRNA Pars granulosa Skládání ribosomů NOR – nukleolární organizátor (na DNA) V lidských buňkách na 5-ti chomosomech (chr. 13, 14, 15, 21, 22) Endoplasmatické retikulum 1 „uvnitř buňky“ „síť“ Většina membrán uvnitř buňky. Vzájemně propojené kanálky a váčky Cisterny Hladké ER Drsné ER Ribosomy Jaderná membrána Velká podjednotka ribosomu Malá podjednotka ribosomu Endoplasmatické retikulum 1 Bez ribosomů → Nemá proteosyntetickou funkci ! Syntetizuje fosfolipidy a cholesterol • Játra – metabolismus lipidů a cholesterolu, degradace glykogenu, detoxifikace (spolu s ledvinami) • Varlata – syntéza steroidních hormonů (testosteron) • Buňky střeva – absorbce, syntéza, a transport lipidů • Kosterní a srdeční svalovina – ukládání a uvolňování vápníku (sarkoplasmatické retikulum) Drsné ERHladké ER 200 nm • Syntéza všech sekretovaných proteinů • Syntéza integrálních proteinů membrán • Modifikace proteinů Cytosol Ribosomy Cisterny endoplasmatického retikula Ribosomy Endoplasmatické retikulum Volné ribosomy Vázané ribosomy Ribosomy Schéma ribosomu Velká podjednotka Malá podjednotka ribosomy mRNA 100 nm POLYRIBOSOM (klastr ribosomů překládající určitý úsek mRNA) mRNA 5` AUG 3` START kodon 3`UAC 5` Met-tRNA Začátek translace mRNA 5` UAG 3` Konec translace mRNA 5` UAA 3` mRNA 5` UGA 3` STOP kodony váží „uvolňující faktor“E P A 5` 3` směr čtení mRNA = směr pohybu ribosomů po mRNA kodony Aminoacyl tRNA Volné tRNA Rostoucí polypeptidový řetězec Ribosomy - Translace Golgiho aparát Cis Trans Centrosom Průměr – 0.2 mm Délka - 0.5 mm 1 2 3 4 56 7 8 9 Mitochondria 1 • all cells except erythrocytes • double membrane • diameter cca 0,5 mm • length up to 50 (100) mm • oxidative metabolism (glucose – ATP + CO2 + H20) • cytochrome c – activation of apoptotic pathway • origin in oocyte • mtDNA (circular) • brown fat thermogenesis • both membranes with low fluidity • both membranes equipped with many protein molecules • growth and divission of mitochondria Intermembrane space Mitochondria 2 Mitochondria 3 with crists with tubuli (in steroid producing cells) mitochondria microtubuli Mitochondria 4 mitochondrial eosinophilia Lysosomes 1 endosome-lysosome system • in all cells except for erythrocytes • vesicles about 0,05 – 0,5 mm • membrane-bound • highly acidic internal space (cca pH 5) • hydrolytic enzymes inside (min. 50 types) • tagging by mannose-6-fosphate Lysosomes 2 primary x secondary • primary lysosomes • secondary lysosomes (fagolysosomes) • residual bodies (lipofuscin) secondary lysosomes Lysosomes 3 Peroxisomes • structuraly similar to lysosoms • functionally similar to mitochondria • „nucleus “ = nucleoid • degradation of fatty acids (H202, H2O, 02) • detoxification (complement SER) • origin: growth from ER or division peroxisomes lysosomes nucleoid Cytoplasmic inclusions 1 (no or only little metabolic activity on themselves) • secretory granules • storage compounds: sugars (glycogen), lipids • crystals (proteins) • pigments: endogenous (autogenic and hematogenic) + exogenous Cytoplasmic inclusions 2 Secretory granules Secretory granules Golgi apparatus Rough ER Cytoplasmic inclusions 3 Lipid inclusions Cytoplasmic inclusions 4 Glycogen β-granules (stratified epithelium) α-granules (liver) Cytoplasmic inclusions 5 Glycogen Glycogen in liver cells (light microscope; PAS reaction) Cytoplasmic inclusions 6 Crystals Protein inclusions in Leydig cells Cytoplasmic inclusions 7 Pigments (colour inclusions): Exogenous x Endogenous • Autogenous Specific functions – melanin • Hematogenous Hemoglobin decomposition – hemosiderin, biliverdin, bilirubin Pigment in aged cells lipofuscin – accumulation of residual bodies in long-lived cells (neurones, kardiomyocytes) Cytoskeleton 1 Microtubules Intermediate filaments Microfilaments (actin) 25 nm 10 nm 7 nm microtubules microfilaments - actin Cytoskeleton 2 Microfilaments (actin) G-actin (globular) F-actin (fibrilar) • actin isoformes (a, b, g) • fast polymerisation and depolymerisation • polarisation (+ a – ends) • stabilisation by associated proteins (tropomyosin – myofibrils) • crosslinking by associated proteins (fimbrin, filamin, …) • anchoring to cell membrane (vinculin, tallin, …) • cortical actin – membrane skeleton • myosin motors (analogous to dynein + kinesin on microtubuli) Cytoskeleton 3 Microtubules • hollow tubes • a-tubulin + b-tubulin – dimers • fast polymerisation and depolymerisation • polarisation (+ a – ends) • MAP (proteins associated with microtubuli) • MTOC – microtubules organizing centre (centrosome; g-tubulin) • mechanical support • intracellular transport • mitotic spindle • cilia and flagella • mitotic poisons (colchicin, taxol, …) a-tubulin b-tubulin Cytoskeleton 4 Microtubules - motors Kinesins • move towards „plus“ end of microtubuli • transport from centrosome Dyneins • move towards „minus“ end microtubuli • transport towards centrosome • axonal transport – long distance Cytoskeleton 5 Intermediate filaments • „chemically“ highly heterogenou group • common composition (tetramers) “thread like“ • more stable than actin and tubulin structures • cell type specific: Cytokeratins (epithelia) Vimentin (cells of mesenchymal origin) Desmin (muscle cells) Neurofilaments (neurons) Glial fibrial acidic protein (neuroglia) Lamins (nuclear envelope) Cytokeratin intermediate filaments in stratum basale of epidermis Cell surfaces 1 free surface lateral surface basal surface Free • microvilli (irregular, regular – striated border, brush border) • cilia Lateral Cell-to-cell junction: • sealing: tight junction=zonula occludens • adhesion: zonula adherens, desmosom • communication: nexus (Gap junction) Basal • focal adhesions • hemidesmosomes • basal labyrinth Cell surfaces 2 Free surface of cultured human embryonic stem cells Microvilli Cell surfaces 3 Mikroklky Regularly organised microvilli = striated border + brush border Actin filaments in microvilli • 20 in microvilli of epithelial cells • several hundreds in stereocilia of hair cells Thickness about 0,1 mm Length about 1-6 mm Cell surfaces 4 Mikroklky žíhaná kutikula (tops of enterocytes) kartáčový lem (proximal tibuli of kidney) Gluten – Celiac disease Cell surfaces 5 Řasinky + Bičíky Thickness about 0,25 mm Length about 7-10 mm Axonema 20 microtubuli (9x2 + 2) Dynein arms (movement) Basal body Centriole 9 x 3 Cell surfaces 6 Řasinky + Bičíky in light microscope in electron microscope Cell surfaces 7 Řasinky + Bičíky oviduct Microvilli of secretory cells Cilia of ciliated cells Cell surfaces 8 Řasinky + Bičíky Adhesions and Junctions 1 lateral surface Basal surface Adheze Těsnění Komunikace • Macula adherens (desmosome) • Zonula adherens • Hemidesmosome • Focal adhesion • Zonula occludens (tight junction) • Gap junction (nexus) spojovací komplex Adhesions and Junctions 2 Adhesion • Macula adherens (desmosom) • Zonula adherens • Hemidesmosome • Focal adhesion Lung ECM - alveolar region Unified composition • Transmembrane proteins (cadherins+ integrins) • Adaptor (plak) proteins • Cytoskelelal fibers cell-cellcell-ECM Adhesions and Junctions 3 Adhesion • Macula adherens (desmosome) Diameter about 0,3 mm Distance between membranes about 20-40 nm Adhesions and Junctions 4 Adhesion • Hemidesmosome • Focal adhesion Epidermolysis bullosa Adhesions and Junctions 5 • Focal adhesion basal lamina Adhesions and Junctions 6 Basal labyrinth Adhesions and Junctions 7 Sealing • Zonula occludens (tight junction) Damage by: Clostridium perfringens Helicobacter pylori (ZO-1) Adhesions and Junctions 8 Sealing • Zonula occludens (tight junction) Adhesions and Junctions 9 Communication • Gap junction (nexus) Diameter about 0,3 mm Distance between cell membranes about 3 nm Internal diameter of the channel about 2 nm Adhesions and Junctions 10 Communication • Gap junction (nexus) Activities of cells • Movement – intracellular, amoeboid, cilia, flagella • Metabolism – income, processing, outcome • Responsivenes • Growth • Differentiation • Division (amplification) Cell division & Cell specialization Cell division & Cell specialization CELLDIFFERENTIATION CELLDIVISION Division x Differentiation of cells 1 Zygote Multicellular embryo Dynamic multicellular organism + other regulations: • translation • posttranslational modification STABLE GENOME Genomic equivalence (= equal amount of DNA and the same nucletide sequence in all cells of a organism – cloning) VARIABLE TRANSCRiPTOME Transcription Regulators X CELLDIFFERENTIATION Division x Differentiation of cells 2 Stem cells • slowly dividing (usually) • multipotent Progenitor cells • „transit amplifying cells“ • fast proliferation • multipotent Terminally diferentiated cells • nondividing Tissue renewal and regeneration Oligodendrocyte Astrocyte Neuron Division x Differentiation of cells 3 Stem cells generate and regenerate our body 1. Undifferentiated growth 2. Differentiation Capability to differentite into specialized cell types Pluripotency Capability to produce identical copies of itself Self-renewal Different properties Fetal Organ Tissue Embryonic stem cells Adult stem cells Induced pluripotent stem cells Cancer stem cells Mother nature and scientists supply us with many Basic concept 1 MITOSIS and CYTOKINESIS produce genetically identical cells Cell division 1 STABLE (non-changing) GENOME Due to semiconservative duplication of DNA Condensed duplicated chromosome chromatid centromere telomere telomere Cell division 2 ho homologous chr. pairs duplication duplication nonsister chromatids sister chromatides sister chromatides chromosome with one chromatid mathers chromosome Metabolism of chromosomes – Homologous chromosomes Cell division 3 fathers chromosome chromosome with one chromatid Pairs of homologous chromosomes (2N) organized into so called „KARYOTYPE“ Cell division 4 Basic concept 2 MITOSIS and CYTOKINESIS are parts of cell cycle CELL CYCLE • semi-modular character • equipped with checkpoints • among cells it is coordinated by signalling molecules G1 START M S DNA replication checkpoint G2 metaphase Checkpoint (SAC) G0 Cell division 5 DNA damage checkpoint Interphase begins in daughter cell G1 S G2 Chromozómy kondenzují, začíná se tvořit dělící vřeténko Chromozomy se seřazují v metafázní (ekvatoriální) rovině Chromatidy se přesunují k protilehlým pólům vřeténka Formují se nová jádra a chomozomy začínají dekondenzovat Cytoplasm divides, two cells arise Cell division 6 Mitotic spindle Cell division 7 Centrosomal metabolism Semiconservative duplicationCell division 8 Centrosome structureCell division 9 Diameter – 0.2 mm Length - 0.5 mm 1 2 3 4 56 7 8 9 Modified from the catalogue ofSanta Cruz Biomedicals, USA Regulation – Cyklin-Dependent Kinases (CDK) + Cyklins Cell division 10 Periodicity of cyclin expression Cell division 11 prophase metaphase Cell division 12 anaphase - telophase telophase Cell division 13 Děkuji za pozornost ! ahampl@med.muni.cz Budova A1 – 1. patro Přednášky histologie Klíčové prvky mikroskopické stavby tkání a orgánů a jejich vztah k funkci Nejnovější objevy v oblasti struktury a obnovy tkání a jejich vztah ke vzniku a léčbě chorob