1 Lipidy Lipoproteiny Apolipoproteiny 2 Desetileté přežití 3 Desetileté přežití 4 Lipidy Lipos = tuk •Význam lipidů v organismu 1) Zdroj zásobní energie alternativní ke glukóze (triacylglyceroly) 2) Součást buněčných membrán (cholesterol, fosfolipidy) 3) Biokatalyzátory, hormony 4) izolační vrstva, ochrana orgánů •Stanovení koncentrace lipidů v krvi nyní bez významu (referenční rozmezí 4,0 - 8,0 g/l) 5 Transport lipidů I. Krev a lymfatický systém •Vazba na specifické proteiny (mastné kyseliny na albumin) •Tvorba makromolekulárních komplexů lipidy + apolipoproteiny = lipoproteiny II. Zásobní lipidy a v buněčných membránách 6 Odběr krve •pacient lačný 12-14h •2-3 dny má být vynechán alkohol, •krev odebrána bez dlouhé venostázy, •pacient má dodržovat alespoň 2 týdny stávající životní styl Diagnostické rozhodnutí o přítomnosti zvýšeného rizika je možné pouze na podkladě průměru dvou následných měření z dvou odběrů u jednoho pacienta, provedených v intervalu 1-8 týdnů, nejlépe v téže sérii měření. 7 > Rozdělení lipoproteinů Lp(a) 8 Chylomikrony (CM) • vznikají v absorpčních buňkách střevní sliznice • nesou TG, CH a lipofilní vitaminy přijaté potravou • obsahují apo-B48, stopy apoA (jiné neumí střevní buňka syntetizovat) • syntéza apo-B 48 limituje tvorbu CM • pronikají do lymfy • prostřednictví lymfatických cév jsou transportovány do krve 9 Jaký je osud chylomikronů v krvi ? • do krve vstupují 1-2 h po jídle • z HDL jsou na CM přenášeny Apo E a Apo CII • v krevních kapilárách na CM působí lipoproteinová lipáza 10 VLDL • vznikají v hepatocytech • nesou cholesterol převážně přijatý potravou a triacylglyceroly syntetizované v játrech • obsahují ApoB100, malá množství ApoA a ApoC-I a ApoE 11 • V krevních kapilárách působí na VLDL lipoproteinová lipasa • Triacylglyceroly jsou štěpeny na mastné kyseliny a glycerol • Z HDL jsou na VLDL přenášeny Apo E a Apo CII • VLDL se mění na IDL • IDL jsou vychytány játry nebo přeměněny na LDL Jaké jsou další změny VLDL? 12 • vznikají z VLDL a IDL LDL 13 • oxidované LDL dlouhý poločas LDL částic způsobuje, že: LDL mohou pronikat cévní stěnou  ukládají se v intimě  dochází k jejich oxidaci  oxidované LDL jsou silně aterogenní •„small dense LDL particles“ (malé denzní LDL částice) LDL-III, 1,04-1,06 g/l, <25 nm - silně aterogenní, snadněji pronikají arteriální intimou - špatné rozpoznávání a vychytávání LDL receptory, - - snadno se oxidují 14 • IDL i LDL částice mohou být obohacovány estery cholesterolu z HDL • IDL částice jsou vychytávány játry pomocí Apo-E receptoru • LDL jsou vychytávány periferními tkáněmi a játry receptorově zprostředkovanou endocytozou (Apo-B 100) Jaký je osud IDL a LDL? 15 HDL • vznikají v hepatocytech (částečně i v enterocytech) • HDL přijímají cholesterol z periferních tkání a zprostředkují jeho transport do jater • pro jejich funkci je důležitý enzym LCAT lecitincholesterolacyltransferáza – esterifikace cholesterolu • existuje několik typů HDL (HDL1 – HDL3), které se liší velikostí a obsahem lipidů 16 • LCAT přenáší mastnou kyselinu na OH skupinu cholesterolu • Cholesterol se esterifikuje, esterifikovaný cholesterol je méně polární a zanořuje se do nitra HDL Funkce LCAT - 17 Lp(a) • Lipoprotein o nízké hustotě • Kromě Apo B100 má navíc Apo(a) • Apo(a) je podobný plasminogenu • Polymorfismus (hustotní a délkový) • Koncentrace Lp(a) v krvi dána geneticky 19 MEZI LIPOPROTEINY PROBÍHÁ VÝMĚNA LIPIDŮ I PROTEINŮ 20 Jaký je stav standardizace metod? Jaké jsou doporučené metody? 21 Analyt Referenční metoda Certifikovaný referenční materiál Cholesterol ID-GC/MS ID-LC/MS SRM 909b NIST; SRM 911b; NIST/SRM 1952a; SRM 1951b NIST Triacylglyceroly ID-GC/MS SRM 909b NIST; NIST/SRM 1951a Cholesterol HDL UC a kvantifikace CDC SRM 911a NIST; NIST/SRM 1951a Cholesterol LDL UC a kvantifikace CDC SRM 911a NIST; NIST/SRM 1951a Apo AI Neexistuje SP1-01 WHO Apo B Neexistuje SP3-07 WHO Lp(a) Neexistuje SRM 2B IFCC 22 Stanovení lipoproteinů 1) ULTRACENTRIFUGACE 23 > 2) ELEKTROFORÉZA 24 3) SELEKTIVNÍ PRECIPITACE 25 Apolipoproteiny • PROTEINOVÁ SLOŽKA LIPOPROTEINŮ • FUNKCE: AKTIVÁTORY A INHIBITORY ENZYMŮ interakce s RECEPTORY tvorba buněčných STRUKTUR účast na přenosu nebo výměně lipidových částic 26 ApoAI apolipoprotein v HDL ApoB-100 apolipoprotein v LDL a VLDL ApoB-48 apolipoprotein v chylomikronech Apo(a) apolipoprotein v Lp(a) 27 Význam stanovení ApoB-100 * Informace o počtu LDL částic Ø1 částice LDL obsahuje 1 částici Apo-B100 a různé množství cholesterolu a triacylglycerolů ØPři stejné hodnotě LDL cholesterolu vyšší hodnota Apo-B100 svědčí o větším počtu LDL částic (převaha malých hustších částic) ØPosouzení rizika kardiovaskulárních následků aterosklerózy 28 Stanovení ApoAI a ApoB 1) IMUNOTURBIDIMETRIE 2) IMUNONEFELOMETRIE • Referenční metody nejsou definovány • CRM: SP1-01 a SP3-07 29 Cholesterol bílá krystalická látka 30 Cholesterol celkový = Cholesterol +Cholesterol esterifikovaný 31 Stanovení cholesterolu 1. Referenční metoda (ID-GC/MS) 1) izotopová diluce značeným vnitřním standardem 2) separace neznačeného a značeného analytu plynovou chromatografií 3) detekce hmotnostní spektrometrií po eluci z kolony kalibrátor NIST-SRM 911b vnitřní standard (3,4-13C2) cholesterol derivatizace TMS(trimethylsilylether) m/z analyt 458 m/z vnitřní standard 460 CV(průměr) 0,8% bias -0,5% (-1,4 až + 0,5%) Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 32 Cholesterol 2. Enzymové stanovení •Hydrolýza esterů cholesterolu (CHE, cholesterolesterasa) •Oxidace cholesterolu (CHOD, cholesteroloxidasa) •Barevná reakce (oxidační kopulace) (POD, peroxidasa + chromogen, Trinderova reakce) 33 estery cholesterolu + H2O  cholesterol + mastné kyseliny (CHE) cholesterol + O2  Δ4-cholesten-3-on + H2 O2 (CHOD) H2 O2 + chromogen  H2 O2 + barvivo (POD) H2 O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu  chinoniminové barvivo + 4 H2O 34 Stanovení HDL cholesterolu 1.Referenční metoda Preparativní ULTRACENTRIFUGACE v hustotním gradientu 1) odstranění VLDL ze séra ultracentrifugací 2) odstranění IDL,LDL, a Lp(a) precipitací činidlem MnCl2+heparin a centrifugací 3) stanovení cholesterolu v supernatantu referenční metodou Abell-Kendall Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 35 HDL cholesterol 2. HOMOGENNÍ (přímé) metody a)Imunoseparace (Wako) (protilátky proti lidským ß-lipoproteinům b)Maskování (Daiichi) (polyanionové polymery) c)Modifikované enzymy a maskování (Kyowa) (enzymy modifikované PEGem + sulfáty cyklodextrinu) 36 Stanovení LDL cholesterolu 1.Referenční metoda Preparativní ULTRACENTRIFUGACE v hustotním gradientu 1) odstranění VLDL a chylomikronů ze séra ultracentrifugací (v supernatntu zůstane směs LDL+HDL o hustotě nad 1,006 kg/l) 2) stanovení cholesterolu v supernatantu (LDL+HDL) Abell-Kendallovou metodou 3) odstranění LDL precipitací činidlem MnCl2-heparin v druhé části supernatantu 4) stanovení cholesterolu po centrifugaci v supernatantu (HDL) Abell-Kendallovou metodou 5) výpočet LDL cholesterolu podle vztahu: LDLChol=(LDL+HDL)Chol - HDLChol Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 37 LDL cholesterol 2. HOMOGENNÍ(přímé) metody a) metody s maskováním non-LDL částic •maskování VLDL a chylomikronů cyklodextrinsulfátem •oddělení HDL od LDL detergentem •stanovení cholesterolu v LDL •detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení 38 b) metody s odstraněním non-LDL částic •Rozložení non-LDL částic za přítomnosti detergentu a polyaniontu, za přítomnosti CHE a CHOD proběhne stanovení cholesterolu na peroxid vodíku, který je rozložen katalasou bez tvorby zbarvení •po přidání 2.reagencie obsahující detergent dojde k solubilizaci LDL a enzymovému stanovení cholesterolu z LDL částic (detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení) 39 3. Výpočet koncentrace LDL cholesterolu(Friedewald) LDLChol(mmol/l) = Celkový Cholesterol - HDLChol - 0,45.TG •nutné stanovit HDLcholesterol, celkový cholesterol a TG •neplatí při hyperTG •požadavek 12-14h lačnění 40 Triacylglyceroly Triacylglyceroly = estery glycerolu Problémy při stanovení: volný glycerol diacylglyceroly monoacylglyceroly Odběr krve musí být nalačno (12 až 14h) 41 Stanovení triacylglycerolů 1. Referenční metoda (ID-GC/MS) 1) izotopová diluce značeným vnitřním standardem 2) separace neznačeného a značeného analytu plynovou chromatografií 3) detekce hmotnostní spektrometrií po eluci z kolony kalibrátor NIST-SRM 1595 tripalmitin vnitřní standard (13C3) tripalmitin derivatizace N-ethyl-N-trimethylsilylfluoroacetamid) m/z analyt 215 hlavní měření 185,231(konfirmační měření) m/z vnitřní standard 218-187,234(konfirmační měření) CV(průměr) 0,57% nativní sérum-0,72% lyof. sérum bias(diference od SRM 909) 0,10-0,25% lyofilizované sérum 0,14-0,45% nativní sérum Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 42 Triacylglyceroly 2. Enzymové stanovení •Hydrolýza (vznik glycerolu) •Fosforylace (vznik glycerol-3-fosfátu) a)Oxidace glycerol-3-fosfátu barevná reakce b)Stanovení ADP stanovení pyruvátu (optický test) 43 triacylglyceroly + 3H2O  glycerol + 3 mastné kyseliny LIPASA glycerol + ATP  glycerol-3-fosfát + ADP GLYCEROLKINASA (GK) glycerol-3-fosfát + O2  dihydroxyacetonfosfát +H2O2 GLYCEROLFOSFÁTOXIDASA (GPO) 2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu  chinoniminové barvivo + 4 H2O PEROXIDASA (POD) 44 glycerol + ATP  glycerol-3-fosfát + ADP GLYCEROLKINASA (GK) ADP + fosfoenolpyruvát  ATP + pyruvát PYRUVÁTKINASA (PK) pyruvát + NADH +H+  laktát + NAD + LAKTÁTDEHYDROGENASA (LD) 45 Doporučené hodnotící meze Analyt Muži Ženy Cholesterol (mmol/l) 2,90 5,00 2,90 5,00 LDL cholesterol (mmol/l) 1,20 3,00 1,20 3,00 HDL cholesterol (mmol/l) 1,00 2,10 1,20 2,70 Apo A1 (g/l)* 1,00 1,70 1,10 1,90 Apo B (g/l)* 0,50 1,00 0,50 1,00 Klinická biochemie a metabolismus, 1 (2010) 45-46