Kmenové Buňky a Tkáňové Inženýrství.. Bilogický ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity @2024 Vladimír Rotrekl vrotrekl@med.muni.cz NYT… stem cells not a miracle in waiting (2006) NYT… stem cells not a miracle in waiting (2006) Sylabus: Základní charakteristiky kmenových buněk. Mechanismus sebeobnovy kmenových buněk dělením. Základní typy kmenových buněk podle schopnosti diferenciace – totipotentní, pluripotentní, multipotentní, oligopotentní, unipotentní kmenové buňky a jejich vlastnosti. Typy kmenových buněk podle zdroje – embryonální, fetální a dospělé (tkáňové, orgánové) kmenové buňky. Vztah normálních a nádorových kmenových buněk. Progenitorové buňky. Symetrické a asymetrické buněčné dělení. Určení diferenciačních směrů kmenových buněk. Struktura a funkce „niche“ kmenových buněk. Kmenové buňky a buněčná terapie. Etika a legislativa ve výzkumu kmenových buněk. Perspektivy ve výzkumu a použití kmenových buněk v léčbě; dediferenciace a transdiferenciace buněk – indukované pluripotentní kmenové buňky (iPS cells). Principy a metody tkáňového inženýrství. Syntetické a biologické buněčné nosiče. Aplikace a perspektivy tkáňového inženýrství v medicíně. Bilogický ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity Vladimír Rotrekl vrotrekl@med.muni.cz Kmenové Buňky a Tkáňové Inženýrství.. Proč vlastně kmenové buňky? • Vývoj organizmu a vývojové poruchy • Regenerace tkání po poškození • Stárnutí ..ale také • Buněčná terapie • Modely genetických chrob NYT… stem cells not a miracle in waiting (2006) Kmenové Buňky Od Promethea k… Historie objevů spojených s kmenovými buňkami By Peter Paul Rubens Nejstarší zmínka o Prometheovi (Hesiod approx.700 b.C.; wiki) Sny o regeneraci.. - Mnoho mýtických postav má schopnost regenerovat (údy, tělo atd..) - Divoká fantazie vs racionální poznání přírodních zákonitostí? Od Promethea k… Historie objevů spojených s kmenovými buňkami By Peter Paul Rubens Nejstarší zmínka o Prometheovi (Hesiod approx.700 b.C.; wiki) Sny o regeneraci.. - Mnoho mýtickych postav má schopnost regenerovat (údy, tělo atd..) - Divoká fantazie vs racionální poznání přírodních zákonitostí? Lidská játra – jediný orgán, který plně regeneruje Regenerace po hepatectomii – až 50% hmoty dělěním hepatocytů Repopulace po akutním selhání – dediferencované jaterní progenitory – jsou to ve skutečnosti kmenové buňky Lidská játra – jediný orgán, který plně regeneruje Regenerace po hepatectomii – až 50% hmoty dělěním hepatocytů Repopulace po akutním selhání – dediferencované jaterní progenitory – jsou to ve skutečnosti kmenové buňky Jaterní progenitorové buňky dediferenciace Repopulace Repopulace po selhání jater Adapted from https://doi.org/10.1038/s12276-020-0483-0 ➢„Omnis cellula e cellula“ -Rudolf Virchow 1855 Od Promethea k… Historie objevů spojených s kmenovými buňkami By Peter Paul Rubens Nejstarší zmínka o Prometheovi (Hesiod approx.700 b.C.; wiki) Rudolf Vichrow Robert Remak Rudolf Vichrov publikoval práci R.Remaka jako svoji.. ➢„Omnis cellula e cellula“ -Rudolf Virchow 1855 ➢Primitivní „kmenové“ buňky v krvi –Pappenheims 1917 Od Promethea k… Historie objevů spojených s kmenovými buňkami By Peter Paul Rubens Arthur Pappenheims „retikuloendothelzelle“ ➢„Omnis cellula e cellula“ -Rudolf Virchow 1855 ➢Primitivní „kmenové“ buňky v krvi –Pappenheim 1917 ➢„kolonie tvořící buňky“ z kostní dřeně –Till 1961 Od Promethea k… Historie objevů spojených s kmenovými buňkami By Peter Paul Rubens Záchrana ozářené myši spočítaným množstvím buněk kostní dřeně (Till a McCuloch 1961) James Till & Ernst McCulloch ➢„Omnis cellula e cellula“ -Rudolf Virchow 1855 ➢Primitivní „kmenové“ buňky v krvi –Pappenheim 1917 ➢„kolonie tvořící buňky“ z kostní dřeně –Till 1961 Od Promethea k… Historie objevů spojených s kmenovými buňkami By Peter Paul Rubens https://doi.org/10.1159/000335266 ➢„Omnis cellula e cellula“ -Rudolf Virchow 1855 ➢Primitivní „kmenové“ buňky v krvi –Pappenheim 1917 ➢„kolonie tvořící buňky“ z kostní dřeně –Till 1961 ➢Linie embryonálních karcinomů – Lehman and Pierce 1974 Od Promethea k… Historie objevů spojených s kmenovými buňkami By Peter Paul Rubens Teratokarcinom (řez) Imortalizovaná linie Lehman and Pierce 1974Barry Pierce ➢„Omnis cellula e cellula“ -Rudolf Virchow 1855 ➢Primitivní „kmenové“ buňky v krvi –Pappenheim 1917 ➢„kolonie tvořící buňky“ z kostní dřeně –Till 1961 ➢Linie embryonálních karcinomů – Lehman and Pierce 1974 ➢Myší embryonální SC - 1981 by Evans Od Promethea k… Historie objevů spojených s kmenovými buňkami By Peter Paul Rubens Kultivace embryonální linie a tvorba chimerních myší z linií embryonálních kmenových buněk a teratokarcinomů Sir Martin J. Evans ➢„Omnis cellula e cellula“ -Rudolf Virchow 1855 ➢Primitivní „kmenové“ buňky v krvi –Pappenheim 1917 ➢„kolonie tvořící buňky“ z kostní dřeně –Till 1961 ➢Linie embryonálních karcinomů – Lehman and Pierce 1974 ➢Myší embryonální SC - 1981 by Evans ➢Dospělé SCs ~1980 → ➢Embryonální SC z lidského embrya – Thompson 1998 ➢Indukované pluripotentní buňky – Yamanaka 2006 Od Promethea k… Historie objevů spojených s kmenovými buňkami By Peter Paul Rubens Nejstarší zmínka o Prometheovi (Hesiod approx.700 b.C.; wiki) Kmenové buňky: kriteria a definice Sebeobnova Diferenciace Schopnost vytvářet vlastní kopie Schopnost měnit vlastnosti a funkčně se specializovat Klonální kapacita •Symetrické dělení •Asymetrické dělení Toti Pluri Multi potence Oligo Uni Definice: kmenová buňka je buňka schopná sebeobnovy a diferenciace Kmenové buňky: kriteria a definice Sebeobnova Diferenciace Schopnost vytvářet vlastní kopie Schopnost měnit vlastnosti a funkčně se specializovat Klonální kapacita •Symetrické dělení •Asymetrické dělení Toti Pluri Multi potence Oligo Uni Sebeobnova je schopnost vytvořit vlastní kopii Sebeobnova je provázena: - Schopností prodlužování telomer - Rezistencí ke kontaktní inhibici - Rezistence k apoptóze - Rychlým, převážně glykolytickým metabolizmem Nejen geneticky identická kopie, ale také srovnatelná epigeneticky, metabolicky.. Kmenové buňky: kriteria a definice Sebeobnova Diferenciace Schopnost vytvářet vlastní kopie Schopnost měnit vlastnosti a funkčně se specializovat Klonální kapacita •Symetrické dělení •Asymetrické dělení Toti Pluri Multi potence Oligo Uni Diferenciace – je proces, při kterém buňka pochází změnami v genové expresi a stává se tak více specializovanou Sebeobnova je schopnost vytvořit vlastní kopii Nejen geneticky identická kopie, ale také srovnatelná epigeneticky, metabolicky.. Epigenom se mění následován proteomem a metabolomem.. Kmenové buňky: kriteria a definice Sebeobnova Diferenciace Schopnost vytvářet vlastní kopie Schopnost měnit vlastnosti a funkčně se specializovat Klonální kapacita •Symetrické dělení •Asymetrické dělení Toti Pluri Multi potence Oligo Uni Kmenové buňky se sebeobnovují, množí Sebeobnova = tzv. self-renewal; nejdůležitější vlastnost kmenových buněk; schopnost vytvořit identické dceřiné buňky Symetrické dělení Asymetrické dělení Kombinace obou mechanismů = neurální KB !!! Buněčná smrt Embryonální KB Fetální a dospělé KB (s vyjímkami) .... a diferencují a regenerují tkáně orgány totipotence Totipotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do všech buněčných typů, které se nachází v embryu, plodu a vyvíjejícím se organizmu, včetně embryonálních komponent trofoblastu a placenty (příklad: zygota, časné 2-buněčné stádium embrya) Kyvelidou (2013). Qualification and Quantification of Pre-Implantation Embryo Health. .... a diferencují a regenerují tkáně orgány totipotence pluripotence Pluripotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do všech buněčných typů, které se nachází v embryu, plodu a vyvíjejícím se organizmu, ale nepodílí se na embryonálních komponent trofoblastu a placenty (příklad: embryonální kmenové buňky; embryoblast blastocysty). Embryoblast (inner cell mass) Blastocysty Embryonální kmenové buňky Totipotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do všech buněčných typů, které se nachází v embryu, plodu a vyvíjejícím se organizmu, včetně embryonálních komponent trofoblastu a placenty (příklad: zygota, časné 2-buněčné stádium embrya) .... a diferencují a regenerují tkáně orgány totipotence pluripotence multipotence Multipotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do několika specializovaných buněčných typů, ale vše v rámci konkrétní tkáně, jednoho orgánu, nebo fyziologického systému (příklad: hematopoetické kmenové buňky) Tuková tkáň Mezenchymální kmenové buňky z tukové tkáně Pluripotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do všech buněčných typů, které se nachází v embryu, plodu a vyvíjejícím se organizmu, ale nepodílí se na embryonálních komponent trofoblastu a placenty (příklad: embryonální kmenové buňky; embryoblast blastocysty). Totipotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do všech buněčných typů, které se nachází v embryu, plodu a vyvíjejícím se organizmu, včetně embryonálních komponent trofoblastu a placenty (příklad: zygota, časné 2-buněčné stádium embrya) .... a diferencují a regenerují tkáně orgány totipotence pluripotence multipotence oligopotence Oligopotentní buňky – buňky, které mohou diferencovat do vice buněčných typů (často se jedná o progenitory; příklad: neurální kmenové buňky versus myeloidní progenitorové buňky) NESTIN DNA b-TUBULIN Neurální kmenové Myeloidní progenitor Multipotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do mnoha specializovaných buněčných typů, ale vše v rámci konkrétní tkáně, jednoho orgánu, nebo fyziologického systénu (příklad: hematopoetické kmenové buňky) Pluripotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do všech buněčných typů, které se nachází v embryu, plodu a vyvíjejícím se organizmu, ale nepodílí se na embryonálních komponent trofoblastu a placenty (příklad: embryonální kmenové buňky; embryoblast blastocysty). Totipotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do všech buněčných typů, které se nachází v embryu, plodu a vyvíjejícím se organizmu, včetně embryonálních komponent trofoblastu a placenty (příklad: zygota, časné 2-buněčné stádium embrya) .... a diferencují a regenerují tkáně orgány totipotence pluripotence multipotence oligopotence unipotence Progenitorové buňky (často pleteny s kmenovými buňkami.) – časný potomek kmenové buňky, více diferencovaný, než kmenová buňka; progenitory mohou diferencovat, ale nejsou schopny sebeobnovy. Myeloid derived adipose tissue progenitor Oligopotentní buňky – buňky, které mohou diferencovat do vice buněčných typů (často se jedná o progenitory; příklad: neurální kmenové buňky versus myeloidní progenitorové buňky) Multipotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do mnoha specializovaných buněčných typů, ale vše v rámci konkrétní tkáně, jednoho orgánu, nebo fyziologického systénu (příklad: hematopoetické kmenové buňky) Pluripotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do všech buněčných typů, které se nachází v embryu, plodu a vyvíjejícím se organizmu, ale nepodílí se na embryonálních komponent trofoblastu a placenty (příklad: embryonální kmenové buňky; embryoblast blastocysty). Totipotentní kmenové buňky – mohou se specializovat do všech buněčných typů, které se nachází v embryu, plodu a vyvíjejícím se organizmu, včetně embryonálních komponent trofoblastu a placenty (příklad: zygota, časné 2-buněčné stádium embrya) .... a diferencují a regenerují tkáně orgány totipotence pluripotence multipotence oligopotence unipotence Progenitory Embryonální kmenové buňky Fetální a (dospělé/orgánové) kmenové buňky Prekurzory .... a diferencují a regenerují tkáně orgány totipotence pluripotence multipotence oligopotence unipotence https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=19189214 Ztráta schopnosti sebeobnovy Příklad: hematopoetické buňky Klonální kapacita Buňky na cestě diferenciace pomalu se množících kmenových buněk (př. Lidské HSCs – se replikují 1x za 10 měsíců) Differentiation Rychlá proliferace Primovaná kmenová buňka Nichekmenovýchbuněk Cyklující kmenová buňka Jsou časným stádiem regenerace tkáně. Autokrinní expresí proteinu Sonic Hedgehog (SHH) aktivují kmenové buňky Quiescentní kmenová buňka Pomalá proliferace Autokrinní SHH Jedná se o obecný proces, který funguje ve vlasovém váčku i při aktivaci hematopoetických kmenových buněk bakteriální infekcí Přechodné dělící se buňky (Transit amplyfiyng cells) Diferenciace kmenových buněk Primitivní ektoderm/epiblast Trofektoderm Polární trofektoderm Extraembryonální ektoderm Choriový ektoderm Trofoblast placenty Murální trofektoderm Ektoplacentální konus Obří buňky trofoblastu placenta parietální žloutkový váček Primitivní entoderm Ektoderm • nervová tkáň – neurální KB • kůže – kožní KB Mesoderm • kostní dřeň a krev – hematopoetické a mesenchymální KB • svaly a kosti – tkáňově specifické KB Entoderm •plíce, játra, pankreas – orgánově specifické KB • jícen, žaludek, střevo – intestinální KB Viscerální entoderm Parietální entoderm embryonální KB Primordiální zárodečné buňky • gamety Schopnost a cesty (linie) diferenciace kmenových buněk Liniová diferenciace embryonálních kmenových buněk ve členité krajině vysokých kopců (=NESTABILNÍ STAV BUNĚK), horských údolí (=RELATIVNĚ STABILNÍ ALE REVERZIBILNÍ STAV BUNĚK) a hluboké nížiny (=TERMINÁLNÍ DIFERENCIACE BUNĚK) Cesta je řízena transkripčními faktory a vede k celé řadě různých typů kmenových buněk.. Změna osudu je změna epigenetického stavu vyvolaná trankripčními faktory • další osud buňky předurčuje dráha, kterou se pohubuje • Dráha na kterou se vydá (osud) je určena signály z mikroprostředí, tzv. niche Co řídí a určuje osud KB: Thomas Graf & Tariq Enver Nature 462, 587-594 (2009) doi:10.1038/nature08533 ! PLATÍ IN VIVO i IN VITRO ! Osud kmenové buňky je určen mikroporostředím (niche) cílového orgánu, nebo časoprostorové lokalizace v embryu Sebeobnova FGF signaling Transkripční faktory: NANOG Oct4 Sox2 Indukováno: Activinem A FGF2 Diferenciace Signály morfogenů- např. BMP4 signalizace WNT signalizace Primovaná/Diferencovaná buňka Co dělá kmenovou buňku kmenovou buňkou Niche (mikroprostředí) Epigenetický stav Specifické transcripční factory (exprese) Buěčná signalizace Pluripotentní kmenová buňka Co řídí a určuje osud KB: PI3K signalování kaspázy přežití cyklin D proliferace MAPK signálování Exogení/Autokrinní/Parakrynní FGF2/Activin smrt Osud kmenové buňky je určen mikroporostředím (niche) cílového orgánu, nebo časoprostorové lokalizace v embryu Sebeobnova FGF signaling Transkripční faktory: NANOG Oct4 Sox2 Indukováno: Activinem A FGF2 Diferenciace Signály morfogenů- např. BMP4 signalizace WNT signalizace Primovaná/Diferencovaná buňka Pluripotentní kmenová buňka Co řídí a určuje osud KB: Sebeobnova Activin A FGF Signální dráhy řídící tvorbu embrya (primitivního proužku) Retinová kyselina Ustavení AP osy Ribes, Development 2009 Zhang, PLOS 2015 RA indukuje tvorbu ektodermu z PSC Stavridis, Development, 2010 BMP4 WNT Co řídí a určuje osud KB: Osud kmenové buňky řídí faktory mikroprostředí cílového orgánu, případně jeho embryonálního vývoje Pluripotentní kmenová buňka Osud kmenové buňky řídí faktory mikroprostředí cílového orgánu, případně jeho embryonálního vývoje Sebeobnova Activin A FGF Pluripotentní kmenová buňka Signální dráhy řídící tvorbu embrya (primitivního proužku) BMP4 WNT Diferenciace Embryonální vývoj Zygota Morula Blastula Blastocysta Primitivní proužek Co řídí a určuje osud KB: Možné osudy KB a jejich řízení: 5 možných osudů kmenové buňky: 1) Qiescence (absence mitogeních signálů) 2) Symetrické dělení (expanze – časný embryonální vývoj) 3) Asymetrické dělení (integrinyorientace dělícího vřeténka) 4) Diferenciace 5) Apoptoza Symetrické dělení Asymetrické dělení Apoptoza Diferenciace Quiescentní kmenová buňka Cyklující kmenová buňka Osud KB je řízen: 1) Růstovými faktory 2) Interakcí s dalšími buňkami 3) Humorálními signály 4) Chemickými signály 5) Fyzikálními silami 6) Atd.. Niche (mikroprostředí) Vishwakarma & Karp, Biology and Engineering of Stem Cell 2017 Mikroprostředí - Niche Niche je mikroprostředí v rámci anatomického umístění ve kterém se kmenové buňky nachází, které s kmenovými buňkami interaguje a určuje jejich osud.. Do niche patří: - Fyzický kontakt buněčné membrány - Buněčná signalizace autokrinní i parakrinní - Signály neuronů - Metabolické produkty aktivity tkáně - atd.. Mikroprostředí – Niche Niche je mikroprostředí v rámci anatomického umístění ve kterém se kmenové buňky nachází, které s kmenovými buňkami interaguje a určuje jejich osud.. Do niche patří: - Fyzický kontakt buněčné membrány - Buněčná signalizace autokrinní i parakrinní - Signály neuronů - Metabolické produkty aktivity tkáně - atd.. kyslík autokrinní faktory parakrinní signál mezibuněčné interakce interakce s extracelulární hmotou doi: 10.1098/rsfs.2011.0035 Vishwakarma & Karp, Biology and Engineering of Stem Cell 2017v Examples of niches and their effect on stem cell fate determination Nitrokostice(Ednosteum): HSC MSC VEGF parakrinní signál VEGF aktivuje: FGF signál Notch signál TGFb signál WNT signál oocyty chondrocyty adipocyty Krátce žijící stromální buňky Konkrétní diferenciace je určena anatomickou polohou (mezi)Buněčná interakce aktivuje hedgehog signalování Maturace do myeloidních a lymfoidních progenitorů Vishwakarma & Karp, Biology and Engineering of Stem Cell 2017v Příklady niche a jeho působení na osud kmenových buněk Proliferační aktivita satelitních buněk je regulována intenzivní mezibuněčnou komunikací, prostřednictvím klíčových signálních drah Anatomie mikroporostředí se dynamicky mění v průběhu regenerace svalu. 10.1038/embor.2013.182 Poranění svalu Napodobení niche a jeho působení na osud kmenových buněk in vitro - gradient signalizace vytvořený vzájemným působením WNT a BMP reguluje rovnováhu mezi diferenciací a proliferací při neurulaci embrya DOI:10.1016/j.ydbio.2006.12.045 Tvorba spemannova organizéru DOI:https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)81971-6 Syntetické a biologické buněčné matrice Tvorba spemannova organizéru DOI:https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)81971-6Stuhlmiller et al., Cell Mol Life Sci (2012) 69 (22): 3715-37. - chceme-li indukovat specifický osud kmenových buněk in vitro, musíme napodobit mikroprostředí in vivo - gradient signalizace vytvořený vzájemným působením WNT a BMP reguluje rovnováhu mezi diferenciací a proliferací při neurulaci embrya Napodobení niche a jeho působení na osud kmenových buněk in vitro Syntetické a biologické buněčné matrice Stuhlmiller et al., Cell Mol Life Sci (2012) 69 (22): 3715-37. - chceme-li indukovat specifický osud kmenových buněk in vitro, musíme napodobit mikroprostředí in vivo - gradient signalizace vytvořený vzájemným působením WNT a BMP reguluje rovnováhu mezi diferenciací a proliferací při neurulaci embrya L.Hujnak, bakalářská práce MU Napodobení niche a jeho působení na osud kmenových buněk in vitro Syntetické a biologické buněčné matrice „niche“ faktory R-spondin, WNT ligandy, Retinova kyselina, inhibitory GSK3b a TGF-b EGF, FGF, HGF, inhibitory HDAC Noggin, Activin A, Gastrin, inhibitory p38 Diferenciační faktory BMP, TGF-b, Inhibitory NOTCH, EGF R-spondin, WNT, Noggin Extracelulární matrice (ECM) faktory Kolagen, Laminin, Entaktin, Fibronektin klíčové faktory mikroprostředí – lekce z embryologie Napodobení niche a jeho působení na osud kmenových buněk in vitro Syntetické a biologické buněčné matrice Klíčové faktory mikroprostředí - tkáňové inženýrství Buněčná adheze: Migrace Proliferace Genová exprese Přežití Zástava buněčného cyklu Apoptóza Senescence Absence adheze Vitillo, Stem Cell Reports, 2016 Sciencephoto.com Extracelulární matrice umožnila 3D kultivaci a diferenciaci Faktory umožňující diferenciaci a tvorbu organoidů Mutace v signálních drahách od integrinů umožňují EMT přechod u rakovin Buněčná adheze: Migrace Proliferace Genová exprese Přežití Zástava buněčného cyklu Apoptóza Senescence Absence adheze Sciencephoto.com Extracelulární matrice umožnila 3D kultivaci a diferenciaci Faktory umožňující diferenciaci a tvorbu organoidů RDG motiv (ligand pro integriny) Laminin Kolagen Fibronektin A další ECM proteiny.. Extracelulární matrice: Přežití Proliferace integriny Syntetická matrice ho musí obsahovat Faktory mikroprostředí kopírují mikroprostředí cílového orgánu, případně jeho embryonálního vývoje „Niche“ – klíčové faktory mikroprostředí Sebeobnova Activin A FGF BMP4 WNT Kmenová buňka Mattingly, WIREs Dev Biol 2015 Diferenciace Autokrinní spolu s parakrinním signálováním a adhezí indukovaným signálem určuje osud buňky.. ..(být či nebýt, sebeobnovovat se či diferencovat atd..) Autokrinní signál Parakrinní signál kolagen laminin Adheze Kmenové buňky v medicíně • Mezenchymální experimentální léčba a turistika za kmenovými buňkami • Hematopoeitické především hematoonkologické a imunitní onemocnění • Pluripotentní embryonální a indukované a „extended“… Mezenchymální kmenové buňky - MSCs mají vysoký diferenciační potenciál - Vysokou proliferační kapacitu - Vysokou sekreci cytokinů a ligandů zprostředkovávajících parakrinní podporu tkáňově specifických buněk (progenitorů) DOI:10.3390/cells8080886 Van Pham, Stem Cell Processing pp 37-69 Mezenchymální kmenové buňky Zdroje MSC pro lékařské aplikace Van Pham, Stem Cell Processing pp 37-69 Mezenchymální kmenové buňky Zdroje MSC pro lékařské aplikace ALE!!!! MSC se mezi sebou liší: - Reakcí na růstové faktory a cytokiny - Svým sekrečním profilem (rozdílná parakrinní stimulace) - Svým diferenciačním potenciálem Možné způsoby působení transplantovaných mezenchymálních kmenových buněk Přímá diferecniace a náhrada cílových buněk nebo buněčná fúze s cílovou buňkou - regenerace kostí a chrupavky - regenerace svaloviny (kosterní či srdeční) Přímá podpora angiogeneze a vaskularizace - Přímá diferenciace MSC do buněk hladkých svalů cév a endotelových buněk Parakrinní efekt: Podporující vaskularizaci prostřednictvím angiogeneze podporující tkáňově specifickou homeostázu Mezenchymální kmenové buňky Mezenchymální kmenové buňky Zdroje MSC pro lékařské aplikace MSC se mezi sebou liší: - Reakcí na růstové faktory a cytokiny - Svým sekrečním profilem (rozdílná parakrinní stimulace) - Svým diferenciačním potenciálem Jednoduchá izolace MSC z tuku Bez signifikantního efektu na rekonvalescenci po infarktu doi: 10.1016/j.reth.2019.07.005 DOI:10.1016/j.htct.2018.05.001 Aplikace MSC z tukové tkáně do srdce po infarktu Mezenchymální kmenové buňky Zdroje MSC pro lékařské aplikace Důležitá je volba typu buněk pro zamýšlenou aplikaci MSC se mezi sebou liší: - Reakcí na růstové faktory a cytokiny - Svým sekrečním profilem (rozdílná parakrinní stimulace) - Svým diferenciačním potenciálem Pozitivní efekt kmenových buněk kostní dřeně na lezi po infarktu mozku DOI:10.3727/096368912X657909 ! Není MSC jako MSC ! https://doi.org/10.1155/2019/9628536 Odvrácená strana použití MSC v medicíně Mezenchymální kmenové buňky Riziko: - Tumorogeneze - Imunitni odpověď (autologní < allogenní) - Selhání léčby kvůlii) snížené diferenciační kapacitě ii) diferenciaci do jiných typů buněk iii) krátkému přežití graftu iv) opožděné použití https://doi.org/10.1111/jcmm.14035 https://doi.org/10.1111/jcmm.14035 Možnosti zlepšení technologie - Preinkubace v optimálních (selekčních) podmínkách - Užití matric a materálů udržujících mikroprostředí - Genetické modifikace Mezenchymální kmenové buňky Riziko: - Tumorogeneze - Imunitni odpověď (autologní < allogenní) - Selhání léčby kvůlii) snížené diferenciační kapacitě ii) diferenciaci do jiných typů buněk iii) krátkému přežití graftu iv) opožděné použití Odvrácená strana použití MSC v medicíně Multicystická masa nalezená v místě transplantace MSC (po zranění míchy) z olfaktorických buněk nosní sliznice Casereport: Autograft olfaktorických MSC 3 roky po zranění míchy. Po 8 letech nutná resekce masy buněk z páteřního kanálu https://doi.org/10.3171/2014.5.SPINE13992 Tumorogeneze Odvrácená strana použití MSC v medicíně Mezenchymální kmenové buňky Odvrácená strana použití MSC v medicíně Kmenové buňky v medicíně • Mezenchymální experimentální léčba a turistika za kmenovými buňkami • Hematopoeitické především hematoonkologické a imunitní onemocnění • Pluripotentní embryonální a indukované Pluripotentní kmenové buňky One Ring to Rule Them All… …nebo to mělo být: One cell to rise them all…? Co myslíme EMBRYEM, když mluvíme O kmenových buňkách • preimplantační stádium • blastocysta 4 dny stará • tvoří ji několik desitek buněk • embryoblast a trofoblast ~9000 embryí implantováno (většinou po třech) ročně v ČR zbytek >50% zůstane zamražen a … "[T]he bottom line is that there are 400,000 frozen embryos in the United States, and a large percentage of those are going to be thrown out. Regardless of what you think the moral status of those embryos is, it makes sense to me that it's a better moral decision to use them to help people than just to throw them out. It's a very complex issue, but to me it boils down to that one thing." James Thompson The destruction of human embryos to harvest stem cells is "not only devoid of the light of God but is also devoid of humanity" and "does not truly serve humanity." Benedict XIV Zákon 227/2006 Sb Zákon o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách a souvisejících činnostech a o změně některých souvisejících zákonů - Státem provozovaný registr linií lidských embryonálních kmenových buněk - Výzkum lze provádět výhradně s povolením MŠMT - Výzkum/činnost nesmí vést k vytvoření jedince (klonování) Zákon 273/2011 Sb - Skladování embryí neomezenou dobu (EU většinou 5 let) - Likvidace embryí po 10 letech, pokud si pár nepřeje jinak Zákon 227/2006 Sb Zákon o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách a souvisejících činnostech a o změně některých souvisejících zákonů „Zamražená generace“ – cca ½ milionu zmražených embryí v US ČR: skladovaní embryí (ČR) …. ~ 10 000 Kč (jednorázově v roce 2007 – 3400 asistovaných reprodukcí §9 odstavec 1: a) je možné udělit, je-li zřejmé, že jde o nadbytečné lidské embryo, a zároveň dříve, než dojde k jeho použití k získání lidských embryonálních kmenových buněk. Albert Lasker basic medical research award 2009 Indukované pluripotentní KB (Yamanaka 2006) Thy1 (a další geny typické pro fibroblasty)) 0 4 8 12 retrovirová aktivita markery pluripotentních KB geny pluripotence aktivita telomerázy umlčení chromozomu X Somatické buňky Např. kožní fibroblasty iPS buňky Čas ve dnech Stabilní reprogramace na “kmenovost” Alternativní zdroj pluripotence - Indukované pluripotentní KB (iPS cells) - KB vytvořené ze somatických tj. diferencovaných buněk pomocí genetické metody Kinetika reprogramace fibroblastů do pluripotentních KB - relativně krátká cesta zpět Oct4 Sox2 c-Myc Klf4 iPS jsou schopny vytvořit chimérní organizmus Oct-4 GFP fibroblasty Oct-4 GFP iPS Nanog GFP iPS Injekce chiméry (bílá a hnědá srst) Nanog GFP iPS chiméra Oct-4 GFP iPS chiméra Brambrink et al. Cell Stem Cell, February 2008 Indukované pluripotentní kmenové buňky mají obrovský potenciál pro medicínu - tzv. „patient-specific cells“ pro „personalizovanou medicínu“ Jakákoliv aplikace PKB je podmíněna kvantitativní diferenciací do kýžené tkáně Vztah mezi pluripotencí a tumorogenicitou (a) Telomeráza (b) Absence kontaktní inhibice (c) Silný antiapoptotický aparát (d) Vysoká proliferační schopnost (e) Kratší cesta EMT Kooreman, J R Soc Interface. 2010 Současný standard pro klinické zkoušky: Maximálně 1 pluripotentní buňka na 106 diferencovaných buněk v off-the-shelf produktu! Buňky musí být diferencovány in vitro! Pokroky v diferenciaci lidských pluripotentních KB - biologické modely a aplikace Neurony, astrocyty, oligodendrocyty Kardiomyocyty Insulin-produkující pankreatické buňky Krevní buňky Imunokompetentní buňky Endoteliální buňky Buňky trofoblastu Respiratorní buňky Osteoblasty Hepatocyty Melanocyty Buňky prostaty Zárodečné buňky Př. DIFFERENCIACE PSC DO FUNKČNÍCH KARDIOMYOCYTŮ… Pešl, Heart and Vessels, 2014 BMP4 pomáhá polarizaci embrya při gastrulaci (primitivní mesendoderm) Hensenův uzel v přítomnosti FGF2 spouští kardiogenezi Activin A spouští tvorbu mezodermu VEGF is je třeba pro pozdní morfogenezi srdce (tvorba komor) IWR inhibuje Wnt signál – zabrání neurodiferenciaci atp. Kardiomyocyty začínají spontánně bít 1mm Příklad: léčba diabetu – transplantace insulin sekretujících buněk Valasco-Cruz, 2019 Cell • beta-buňky pankreatu vytvořené z iPSC and ESC odpovídají na hladinu glukózy • Po transplantaci nastolí gluk=ozovou toleranci u myšího modelu diabetes • Probíhjí klinické zkoušky na lidech Příklad: traumatické poškození krční míchy, myelopatie a léčba kmenovými buňkami Patofyziologie a strategie léčby KB Anatomie poškození Stav po transplantaci Výsledek: obnovení bílé a šedé hmoty v místě poškození obnovení funkčnosti motorických neuronů obnovení pohybových funkcí Model: laboratorní potkan Adaptováno ze Stem Cells, 2010 Makrofág Astrocyt Oligodendrocyt Axony s myelinem Progenitory oligodendrocytů Progenitory motoneuronů …Srdeční záplaty… Pacient s akutním srdečním selháním 5% ejekční frakce 30% ejekční frakce … pacient odchází z JIP Úspěchy: Indukované pluripotentní KB Teruo Okano: ISSCR Yokohama 2012; current status: unknown …Regnerace RPE… Úspěchy: Embryonální kmenové buňky Schwartz a kol. Lancet 2012; 379:713-20 Lidské embryonální kmenové buňky Diferenciace do pigmentového epitelu Příklad tkáňového inženýrství: Kmenové buňky dentální pulpy •DOI:10.1007/s12015-016-9661-9 Alipour, BMC Biotechnology 2021, https://doi.org/10.1186/s12896-020-00666-3 - jednoduchá izolace mezenchymálních kmenových buněk ze zubní pulpy - dentální MSC jsou multipotentní (mají velký diferenciační potenciál) - Možná mikroenkapsulace MSC do nanočástic a aplikace stabilizovaných buněk k zubnímu krčku - Enkapsulované buňky budují deposity Ca2+ - jednoduchá izolace mezenchymálních kmenových buněk ze zubní pulpy - dentální MSC jsou multipotentní (mají velký diferenciační potenciál) Regenerace čelisti - in vitro propagace MSC izolovaných z dentální pulpy - 3D tisk matrice z kolagenu - Repopulace 3D matrice - Implantace do čelisti - Histologické vyšetření po 3 letech La Noce, J Dentistry 2014 Příklad tkáňového inženýrství: Kmenové buňky dentální pulpy Trounson, 2016 Výběr recentních aplikací kmenových buněk zubní pulpy 2021 (Clinicaltrials.gov): 31 studií s použitím kmenových buněk z dentální pulpy (9 ve druhé fázi klinického testování) periodontal disease, alveolární štěpení, ale také revaskularizace, diabetes, COVID-19, Huntington, stroke, Lupus Erythematosus, osteoartritida) Organoidy Co nazýváme organiodem • 3D struktura odvozená z kmenových buněk • Vykazuje schopnost „samoroganizace“ na základě stejných principů, jako modelovaný orgán • Obsahuje více buněčných typů (stejných jako modelovaný orgán) • Struktura získá a uchovává (alespoň některé) specializované funkce modelovaného orgánu Crownbio.. (Směs buněk obsahující) Kmenové buňky Organoidy Co nazýváme organiodem • 3D struktura odvozená z kmenových buněk • Vykazuje schopnost „samooroganizace“ na základě stejných principů, jako modelovaný orgán • Obsahuje více buněčných typů (stejných jako modelovaný orgán) • Struktura získá a uchovává (alespoň některé) specializované funkce modelovaného orgánu Adaptováno z Crownbio.. (Směs buněk obsahující) Kmenové buňky Sféroidy Organoidy samoorganizace Co nazýváme organiodem • 3D struktura odvozená z kmenových buněk • Vykazuje schopnost „samooroganizace“ na základě stejných principů, jako modelovaný orgán • Obsahuje více buněčných typů (stejných jako modelovaný orgán) • Struktura získá a uchovává (alespoň některé) specializované funkce modelovaného orgánu Adaptováno z Crownbio.. (Směs buněk obsahující) Kmenové buňky Sféroidy Organoidy Střevní krypta disociace samoorganizace Co nazýváme organiodem • 3D struktura odvozená z kmenových buněk • Vykazuje schopnost „samooroganizace“ na základě stejných principů, jako modelovaný orgán • Obsahuje více buněčných typů (stejných jako modelovaný orgán) • Struktura získá a uchovává (alespoň některé) specializované funkce modelovaného orgánu Adaptováno z Crownbio.. (Směs buněk obsahující) Kmenové buňky Sféroidy Organoidy Střevní krypta disociace samoorganizace růst jako v orgánu Faktory mikroprostředí kopírují mikroprostředí cílového orgánu, případně jeho embryonálního vývoje Tkáňové kultury – tvorba organoidů.. Signální dráhy řídící tvorbu embrya – použití pro diferenciaci organoidů in vitro Tkáňové kultury – tvorba organoidů.. Co nazýváme organiodem • 3D struktura odvozená z kmenových buněk • Vykazuje schopnost „samoroganizace“ na základě stejných principů, jako modelovaný orgán • Obsahuje více buněčných typů (stejných jako modelovaný orgán) • Struktura získá a uchovává (alespoň některé) specializované funkce modelovaného orgánu Crownbio.. (Směs buněk obsahující) Kmenové buňky Organoidy Velikost organoidů je omezena difuzí kyslíku ~ desetiny až jednotky milimetrů Zdroj: Unisense Tkáňové kultury – tvorba organoidů.. Využití organoidů Modelování chorob Testování léčiv Transplantační medicína Genová léčba Yu et al. Micromachines, 2019 Kombinace technologie tvorby organoidů a mikrofluidiky – orgán na chipu Od organoidu k orgánu: nutné překonat problém perfuze Biologické a syntetické buněčné nosiče Biokompatibilní nosiče jsou důležité pro funkce buněk v uměle vytvořených orgánech Umělé (chemické) nosiče a kmenové buňky + Neomezené zdroje - Pouze “jednoduché” aplikace - Absence bioaktivních molekul a induktivních signálů Biologické bezbuněčné nosiče a zdravé funkční buňky - Limitace podobné jako s orgány + Klinicky použitelné Lidské orgány ve zvířatech + Perspektivní - Legislativní a etické bariéry - Nejasná biologie 3D kultivace tkáňových kultur: kultivační nosiče (scafoldy) 3-D tisk: Decelularizovaná tkáň/orgán: Perfuze orgánu 1) Orgánová lázeň 2) Temperovací okruh 3) Teplotní čidlo 4) Peristaltická pumpa 5) Kontroler tlaku Zia a kol., Critical Reviews in Biotechnology, 2015 Repopulace decelularizovaného srdce Ott et al., Circulation Research, 2008 500 mil. srdečních buněk Lidské indukované pluripotentní buňky Při elektrické stimulaci viditelné kontrakce (..až 139mm Hg) Decelularizace srdce Published by AAAS T. H. Petersen et al., Science 329, 538-541 (2010) Fig. 1 Schema for lung tissue engineering Repopulace bezbuněčné plicní matrix plicními buňkami a implantace funkčních plic do experimentálního zvířete Pokrok (2014) – plíce participovaly 140 minut na výměně kyslíku (myš) Indukované pluripotentní kmenové buňky diferenciace in vitro Orgány chiméry Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) Komplementace blastocysty: Embryonální kmenové buňky Blastocysta injekce do blastocysty Kobayashi T, et al. 2010 Cell 142(5):787–799 IVF Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) Komplementace blastocysty: Embryonální kmenové buňky Blastocysta injekce do blastocysty Kobayashi T, et al. 2010 Cell 142(5):787–799 IVFPdx1-/- MYŠ Netvoří se slinivka Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) Komplementace blastocysty: Embryonální kmenové buňky Blastocysta injekce do blastocysty Kobayashi T, et al. 2010 Cell 142(5):787–799 IVFPdx1-/- MYŠ Netvoří se slinivka POTKAN WT MYŠ Myš s krysí slinivkou US UK Mezidruhové chiméry pro výzkum a transplantační medicínu Juan Carlos Izpisua Belmonte Methods Mol Biol. 2019;2005:101-124. Human – Pig Chimera Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) Bilogický ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity Vladimír Rotrekl vrotrekl@med.muni.cz Děkuji za pozornost…