Enzymové a jiné markery využívané v diagnostice vybraných patologických stavů Ústav patologické fyziologie LF MU Cíle a význam laboratorního vyšetření • laboratorní vyšetření informují o probíhajících procesech v lidském organizmu a jejich změnách • fyziologických i patologických • změny laboratorních hodnot mohou předcházet projevy nemoci • někt. změny se objevují v minutách od vzniku poškození • 70 – 80 % lékařských rozhodnutí závisí na testech • nízké náklady (3 – 5 % celkových) • posledních 5 let nárůst • vyšetřování glukózy • molekulární biologie • cíle • určení diagnózy • stanovení aktivity onemocnění a prognózy • monitorování odpovědi na léčbu • screening • výzkum nemoci Rozdělení laboratorních vyšetření • z hlediska dostupnosti • základní • rychle dostupná • speciální • vysoce specializovaná • centralizované provádění • z hlediska požadavků na rychlost provedení • rutinní • statimová • do 60 minut od dodání vzorku • vitální indikace • do 30 minut od dodání vzorku • point-of-care testing • vyšetření na místě • ABR, kyslíkový metabolizmus, diagnostické proužky – krev a moč Obecné charakteristiky metody • stanovení požadovaného analytu může být prováděno řadou metod/postupů • různá výpovědní hodnota • spolehlivost metody • dána přístroj. vybavením, kalibrací, správným uchováváním materiálu, kvalitou personálu • parametry • správnost = odchylka výsledku od skutečné hodnoty (náhodné a systematické vlivy) • přesnost • těsnost shody mezi vzájemně nezávislými výsledky analýzy • robustnost (=spolehlivost při běžném používání) • míra kapacity analytického postupu zůstat netečný vůči malým změnám parametrů metod • selektivita – schopnost rozlišovat mezi stanovovanou látkou a ostatními složkami • citlivost – nejmenší zjistitelný rozdíl Validita testu • předpokladem pro validitu testu je analytická spolehlivost • hranice, od které můžeme považovat změnu koncentrace analytu za pozitivní nález • u většiny analytů překryv mezi zdravými a nemocnými • skupina zdravých s pozitivním testem (falešně pozitivní) • skupina nemocných s pozitivním testem (správně pozitivní) • parametry • specificita (Sp) – negativní test = negativní diagnóza • Sp = správně negativní/(správně negativní+falešně pozitivní) • ideálně 1, v praxi >0.95 velmi dobré, >0.7 ještě použitelné • vysoce spec. metody s nízkou falešnou poz. – konečná diagnóza u závažných chorob (falešná pozitivita = trauma) • senzitivita (Se) – pozitivní test = pozitivní diagnóza • Se = správně pozitivní/(správně pozitivní+falešně negativní) • vysoce senzitivní metody jsou dobré pro záchyt, ideálně u závažných léčitelných chorob, kde by neměl selhat screening • efektivita (Ef) = podíl správně určených ke všem vyšetřeným • Ef = správně pozitivní+správně negativní/všichni • zjednodušené vyjádření Referenční interval • raději než normální interval (co je normální?) se volí referenční interval hodnot u jasně definované referenční skupiny osob • co je referenční skupina? • zdraví, nebo spíše osoby bez takového zdrav. stavu, který přímo ovlivňuje / interferuje s měřenou veličinou • stanovení • historicky: x 2 SD • tj. 95% normálně rozložených hodnot • vlivy, které mohou ovlivňovat distribuci • věk, pohlaví, rasa, dieta, … • hodnoty mimo referenční interval • statistická/metodologická variabilita • biologická variabilita • 5% zdravé populace mimo Průběh laboratorního vyšetření • preanalytická část • mimo laboratoř (příprava vyšetřovaného, odběr, uchování a transport biologického materiálu) i v laboratoři • méně kontrolovatelná než analytická část • až 60% chyb • analytická část • dodržování správné laboratorní praxe • interní a externí kontrola kvality – eliminace chyb • postanalytická část • interpretace výsledků Preanalytické vlivy na výsledek vyšetření • osoba pacienta • faktory neovlivnitelné • pohlaví, rasa, věk, cyklické změny • gravidita, současně probíhající jiná nemoc • faktory ovlivnitelné • fyzická aktivita, stres, kouření • vliv alkoholu, potravy a tekutin • léky, operace • odběr vzorku • transport vzorku • uchování vzorku • prvotní zpracování a příprava vzorku k analýze • hemolýza Neovlivnitelné faktory • pohlaví • hemoglobin, haptoglobin, železo • CK, GMT, AK, kyselina močová • rasa • granulocyty • enzymy • genová frekvence • dědičné poruchy metabolizmu • věk • v dětství je referenční rozmezí častěji nižší • vyšší • ALP, fosfor • sezonní vlivy • bilirubin, TAG, cholesterol • cyklické změny • diurnální rytmus kortizolu • železo, močovina • gravidita • bílkoviny i jiné látky produkované trofoblastem nebo orgány plodu • α-fetoprotein, placentární ALP • ALP, amyláza, kortizol, cholesterol • současně probíhající jiná nemoc • biol. poločas stanovované látky • falešně negativní výsledek při nevhodné volbě testu • infarkt myokardu Ovlivnitelné faktory • hmotnost • korelace cholesterolu, TAG, kortizolu, kys. močové s obezitou • stravovací návyky • vysokoproteinová dieta • nárůst močoviny, cholesterolu, fosfátů • kouření • zvyšuje cholesterol, TAG, kortizol, snižuje vitaminy B12 a C • alkohol • chronický abúzus • zvýšení ALT, AST, kortizolu • mírné dávky • přechodné zvýšení HDL • styl života • léky a drogy • vliv na biologické procesy (indukce enzymů, cytotoxicita), interference • fyzická zátěž • závisí na délce a intenzitě • zevní prostředí • nadmořská výška, teplota, cestování přes časová pásma • mechanické vlivy • svalové trauma – zvýšení ALT, AST, CK, myoglobin Faktory ovlivňující preanalytickou fázi • odběr materiálu • označení vzorku, odběrový materiál, technika odběru • transport materiálu • skladování materiálu Příklady zkreslených výsledků Diagnostické markery • cirkulující • ionty • Na, K, Cl, … • metabolity • glukóza, cholesterol, TG, … • odpadní produkty • urea, kreatinin, bilirubin, … • nosiče či látky se specifickou funkcí (nejč. bílkoviny ) • albumin, IgG, fibrinogen, další srážecí faktory, CRP, … • enzymy • secernované • buněčné • markery abnormální proliferace a dediferenciace • mikrobiologické • tkáňové/buněčné • molekulární • proteiny • kvantitativní změna exprese • RNA • kvantitativní změna transkripce (genové exprese) • DNA • kvalitativní průkaz poruchy - např. mutace/polymorfizmy • velké – cytogenetika • malé - PCR • kultivace buněk in vitro • mikrobiologické Enzymy • biokatalyzátory • snižují aktivační energii • neovlivňují rovnovážný stav reakce • bílkovina • holoenzym = apoenzym + kofaktor • kofaktor • prosthetická skupina • koenzym • aktivní místo Lokalizace a vlastnosti enzymů • extracelulární • intracelulární • membránově vázané • cytosolické • organelové • účinnost • specifita – reakční a substrátová • pracují za mírných podmínek • snadno regulovatelné • složitá struktura • rychlé opotřebování Plazmatické enzymy • specifické • enzymy srážení krve, ceruloplazmin, lipoproteinová lipáza • nespecifické • enzymy exokrinních žláz • amyláza, kyselá fosfatáza • intracelulární enzymy • enzymy hlavních metabolických drah Faktory ovlivňující koncentraci enzymů v plazmě • aktivita enzymu v buňce • lokalizace enzymu v buňce • propustnost cytoplazmatické membrány • míra poškození buněk • celková masa postižených buněk • rychlost eliminace enzymu • enzymový „vzorec“ orgánu • závisí na • specifické aktivitě enzymu • zastoupení izoenzymů • změna v průběhu ontogeneze • uvolnění enzymů – indikátor poškození Příklad Formy výskytu enzymů • proenzymy (zymogeny) • izoenzymy • primární • sekundární • příklady • laktátdehydrogenáza, kreatinkináza, PKC Detekce izoenzymů • fyzikálně-chemicky • elektroforéza • chromatografie • imunochemicky • chemicky • stanovení reakční rychlosti za různých podmínek – pH, t, c substrátu Li Q et al. J. Biol. Chem. 1999;274:3764-3771 SRDEČNÍ MARKERY Laboratorní diagnostika nekrózy myokardu • čím je molekula menší, tím rychleji uvolňována (clearance) • proteiny vázané na membránu jsou uvolňovány > než cytosolické > vázané na kontraktilní aparát • specificita pro myokard = troponiny 100% • klasicky • myoglobin • kreatinkináza (CK) • isoenzym CK-MB • troponiny I a T (TnI a TnT) • aspartátaminotransferáza (AST) • laktátdehydrogenáza (LDH) • nověji • heart fatty acid binding protein (HFABP) • natriuretický peptid B (BNP) • ischemií modifikovaný albumin (IMA) • ve zkoušení • karboanhydráza III • lehké řetězce myosinu (MLC) Dynamika srdečních markerů V prvních hodinách V horizontu dní Srdeční strukturální a funkční proteiny – časná diagnostika IM • myoglobin • intracelulární protein srdečních i kosterních svalových buněk účastnící se aerobního metabolismu • při poškození buněk se vyplavuje velmi rychle do krevního oběhu (za 0.5 až 2 h) • nejmenší ze srdečních markerů (~18kDa) - rychle se zvyšuje a velmi rychle se odbourává (normalizace do 24 hod.) • vzhledem k výskytu myoglobinu i v buňkách kosterních svalů je markerem nespecifickým • myopatie, úrazy, renální selhání • troponiny • troponinový komplex – součást strukturálních proteinů, které se podílí na kontrakci příčně pruhovaných svalů • heterotrimer složený z troponinů I, T a C • těsně spojen s kontraktilním aparátem – nízké koncentrace srdečních troponinů v oběhu • není-li srdeční sval poškozen, koncentrace TnI je prakticky nulová a to i při poškození kosterního svalstva = vysoká senzitivita • srdeční izoforma troponinu I (TnI) se strukturně liší od analogické izoformy v kosterním svalu – absolutní kardiospecificita Troponiny • výhody stanovení TnI • absolutní kardiospecifita • dlouhá doba vylučování – sledování průběhu • citlivost – detekce menších poškození • není ovlivněn chronickou renální insuficiencí • nevýhody stanovení TnI • pomalejší nástup než myoglobin (nespecifický) Srdeční enzymy • kreatinkináza (CK) • cytoplazma a mitochondrie • katalyzuje reverzibilní přenos fosfátu z ATP na kreatin • ATP + kreatin → ADP + kreatinfosfát • dimer – M (muscle) a B (brain) • 3 izoformy • CK-BB – hladký sval, mozek, prostata • CK-MB – myokard (kosterní sval) • 40% CK v myokardu • CK-MM – kosterní sval, myokard • CK-MB – diagnóza akutního infarktu myokardu a monitorování reperfuze v průběhu trombolytické léčby AMI • AST • aktivita i koncentrace • LDH Dynamika kardiomarkerů JATERNÍ MARKERY Laboratorní diagnostika v hepatologii • jaterní poškození je v praxi časté • významný vývoj v posledních letech • pokles akutních poškození (HAV, HBV) • nárůst chronických (HCV) • 170 mil. osob (3% světové populace) • cirhóza – vzestup mortality • nárůst HCC (5. nejčastější malignita celosvětově) • hepatologie • velký význam laboratorních vyšetření (především biochemické a sérologické) Biochemická vyšetření jater • rozdělení testů • statické – hodnocení okamžité metabolické situace • ALT, AST, GMT, ALP, proteiny, lipidy, bilirubin, žlučové kyseliny • dynamické – určení funkční jaterní rezervy • bromsulfoftalein, galaktóza, lidokain, antipyrin • jaterní vyšetření obecně • často nespecifické • není žádný jednoduchý test, vždy kombinace několika • v počáteční fázi onemocnění – dlouhodobě falešně negativní výsledky • racionální postup a volba vyšetření • standardizace metod v laboratořích není optimální, postupy se liší i mění • opakované vyšetření v časovém horizontu je přínosnější než jednorázové (prognóza) Dělení biochemických vyšetření jater • ukazatelé poškození hepatocytů • ALT, AST, LDH • ukazatelé obstrukce žlučových cest • ALP, GMT • ukazatelé syntetické funkce jater • albumin, CHE, LCAT, PT • testy konjugace a jaterního transportu organických aniontů • bilirubin, urobilinogen Markery poškození hepatocytů • Alaninaminotransferáza (ALT) • L-alanin+2-oxoglutarát → pyruvát+L-glutamát • reverzibilní reakce • syntéza, odbourávání i přeměna aminokyselin • cytoplazmatický enzym • nejvíce je obsažen v hepatocytech, hladina zvýšena již při poruše membránové permeability • Aspartátaminotransferáza (AST) • L-aspartát+2-oxoglutarát → oxalacetát+L-glutamát • reverzibilní reakce • syntéza, odbourávání i přeměna aminokyselin • cytoplazmatický a mitochondriální izoenzym • játra, myokard, kosterní sval, ledviny a pankreas • Uvolnění cytoplazmatického izoenzymu při narušení permeability membrány, uvolnění mitochondriálního izoenzymu při nekrózu Interpretace ALT/AST • zvýšení aktivity ALT i AST u mnoha jaterních chorob • extrémně vysoké hodnoty (10-100x) u toxických a akutních virových hepatitid a šokových stavů • aktivita aminotransferáz v plazmě neříká nic o exkretorické či metabolické funkci hepatocytů • není vždy korelace mezi hladinou aminotransferáz a závažností jaterní léze • De Ritisův index = AST/ALT • méně než 0,7…dobrá prognóza • 1 a více…špatná prognóza (nekróza) • za normálního stavu i u většiny jaterních chorob ALT > AST • výjimky - AST/ALT >2 • alkoholické poškození • postnekrotické cirhózy • glutathion-S-transferáza • indikátor hepatocelulárního poškození • vysoká cena a horší dostupnost Laktátdehydrogenáza • LDH 1 a LDH 2 – přeměna laktátu na pyruvát ve tkáních s aer. metabolizmem • LDH 4 a LDH 5 – pyruvát na laktát ve tkáních s anaer. glykolýzou Markery obstrukce žlučových cest • alkalická fosfatáza (ALP) • membránový enzym • hydrolýzu fosfátových esterů při alkalickém pH • tetramer, do cirkulace je z membrán uvolňovaný jako dimer • široce rozšířená • játra, střevo a kost (různé izoenzymy) • posouzení kostních a hepatobiliárních onemocnění • značná část jaterní ALP v membránách buněk výstelky žlučových cest – při cholestáze narušení membrán mechanicky a účinkem žlučových kyselin • kromě cholestázy zvýšená i u dalších stavů (tumory jater, cirhóza) • -glutamyltransferáza (GMT) • membránový enzym • játra, ledvina, pankreas, střevo a prostata • katalyzuje přenos -glutamylu z glutathionu na aminokyselinu a umožňuje tak transport aminokyseliny přes buněčnou membránu. • vyskytuje se hlavně v játrech, ledvinách, tenkém střevě a v prostatě • posouzení hepatobiliárních onemocnění Markery syntetické funkce jater • albumin • tvořen v játrech, určení hladiny v séru • dlouhý poločas – neklesá u akutních poruch • vyloučení jiné příčiny poklesu (malabsorpce, snížený přívod bílkovin, onemocnění ledvin) – jde o jaterní poškození • výrazné snížení u alkoholických cirhóz • cholinesteráza • sekreční enzym produkovaný jaterními buňkami do krve • v plazmě katalyzuje hydrolytické štěpení esterů cholinu a některých dalších substrátů • syntéza cholinesterázy a s tím i její aktivita v plazmě klesá v případě poškození jaterního parenchymu nebo při nedostatku proteinů v dietě • nevratně je enzym inhibován organofosfáty Markery syntetické funkce jater • hemokoagulační faktory • tvořeny v játrech, krátký poločas – jejich změny jsou rychlé • Quickův test – vnější cesta aktivace koagulačního systému • hodnoty se mění u onemocnění jaterního parenchymu provázených poruchou proteosyntézy • nebo u obstrukčního ikteru s poruchou vstřebávání tuků a v nich rozpustných vitaminů Stanovení izoenzymů LDH ve vzorku séra Praktické cvičení Laktátdehydrogenáza (LDH) • tetramer - M (gen LDHA, ch.11) - H (gen LDHB, ch.12) • LDH1 (HHHH) 31-49% • srdce, erytrocyty • LDH2 (HHHM) 38-58% • retikuloendoteliální systém • LDH3 (HHMM) 5.5-16.5% • plíce • LDH4 (HMMM) 0-0.7% • ledviny • LDH5 (MMMM) 0-1.5% • kosterní sval, játra Elektroforetické dělení LDH • izoenzymy se liší nábojem → elfo • agaróza s barbitalovým pufrem • barvící roztok • lithium laktát • NAD+ • barvivo (NBT) • fenazinmethosulfát – přenašeč elektronů mezi NADH a barvivem • 5 % kyselina octová Detekce LDH laktát + NAD+ pyruvát + NADH + H+ NADH + H+ + tetrazoliová sůl (NBT) NAD+ + formazan Detekce elektroforetických drah Denzitometrické rozdělení Kvantitativní stanovení katalytické aktivity • absorpční spektrofotometrie • diag. souprava LDH IFCC ROCHE • rychlost vzniku NADH je přímo úměrná katalytické aktivitě LDH, měří se nárůst absorbance při 340 nm • preanalytická fáze • žádné nadstandardní požadavky • standardní odběr krve, stanovení v séru nebo plazmě (heparin) • použití • onemocnění kosterních svalů, hemolytických anemií, non-hodgkinských lymfomů a dalších hematologických chorob, u testikulárních germinálních tumorů Interpretace výsledků • příčiny zvýšení aktivity v séru • hemolýza (i arteficiální) • stoupá izoenzym H4 • infarkt myokardu • stoupá izoenzym H4 • onemocnění jaterního parenchymu • stoupá izoenzym M4 • onemocnění svalů • zvýšení není tak výrazně • další choroby • perniciózní anémie, tumory, leukémie, embolizace do plicnice