Praktické cvičení č.          datum____________    jméno___________________



Téma praktika: Stanovení koncentrace léčiv (vorikonazolu, posakonazolu) v plazmě metodou kapalinové
chromatografie



Přístroje a pomůcky:

Kapalinový chromatograf  HP Agilent 1100, vakuová sušárna, centrifuga, třepačka VIBRAMAX

Pipety, laboratorní sklo




Úkoly:

1) Seznámit se s hlavními částmi chromatografu a jejich funkcemi

2) Preanalytická příprava vzorku - extrakce stanovovaných léčiv z plazmy

     3) Vyhodnocení chromatografického záznamu / kalibrace metody/

           výpočet  koncentrace stanovovaného léčiva



1)      popiš základní části kapalinového chromatografu












2)  preanalytická příprava vzorku  - extrakce hexan-ethylacetát


a)      příprava extrakčního činidla – směs hexan : ethylacetát v poměru 3:7


b)      příprava vzorku (kalibrátoru, kontroly)


Do zábrusových zkumavek napipetovat:


-       500 µl vzorku plazmy (kalibrátoru, kontroly)

-       10 µl vnitřního standardu

-       200 µl 0,2 M NaOH

-        protřepat

-       1000 µl extrakčního činidla

-       zkumavku uzavřít, intenzivně protřepat

-       5 minut třepat na třepačce

-       centrifugace 10 minut při 4000ot/min.

-       horní organickou vrstvu stáhnout do čistých skleněných zkumavek a odpařit ve vakuové
sušárně při 50°C

-       vychladlý odparek rozpustit v 200 µl mobilní fáze

(TEMED pufr : acetonitril 53%  : 47 %)

-       promíchaný eluát aplikovat do přístroje - 20 µl




3)  vyhodnocení chromatografického záznamu

     Identifikujte jednotlivé píky ve vzorku podle retenčního času daného analytu v kalibrátoru a
vypočítej jejich koncentraci. Porovnej s vyhodnocením koncentrace přístrojem.



Kalibrátor

                                                              retenční čas

                                                                                                     plocha


                                                                                                       Koncentrace (c)

                                                                                                            mg/l

vorikonazol




                                                             5,0

vnitřní standard ST




                                                              1,0

posakonazol




                                                             2,0



Kontrolní vzorek/

Plazma (pacient)

                                                            retenční čas

                                                                                                     plocha

                                                                                                       Koncentrace (c)

                                                                                                       mg/l  - výpočet

                                                                                                                      Koncentrace (c)

                                                                                                                      mg/l - přístroj

vorikonazol





vnitřní st.  ST



                                                             -

                                                                                                                             -

posakonazol








Factor (f)  =        plocha píku vnitřního ST v kalibrátoru

                            plocha píku vnitřního ST ve vzorku/kontrole



c  vzorku  =       plocha píku ve vzorku/kontrole         x  f  x c  kalibrátoru

       (mg/l)          plocha píku kalibrátoru