Imunoanalýza ELISA Mgr. Julie Štíchová Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně Ústav klinické imunologie a alergologie Imunoanalytické metody Rozdělení metod dle typu značky: oEIA – značkou je enzym oRIA - radioizotop oLIA - luminofor oFIA - fluorofor Rozdělení metod dle uspořádání: oHomogenní – bez promývání oHeterogenní – s promýváním oKompetitivní oNekompetitivní Vizualizace reakce antigen-protilátka pomocí značky Imunoanalytické metody Heterogenní kompetitivní: oAnalyt ze vzorku + značený analyt od výrobce – soutěž o omezené množství antigenu oMěřený signál je nepřímo úměrný množství analytu Heterogenní nekompetitivní: oZáchytná protilátka / antigen v nadbytku –analyt ze vzorku vyvázán oMěřený signál je přímo úměrný množství analytu ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay oHeterogenní imunoanalýza – nutná separace nezreagovaných složek pomocí promývání o Zahrnuje jednotlivé kroky o Vazba antigenu / protilátky na pevnou fázi (stěna destičky) o Na navázaný Ag se váže zkoumaná protilátka z přidaného séra o Na navázaný komplex se váže sekundární protilátka s konjugovaným enzymem o Pro vizualizaci se do reakce přidá substrát pro daný enzym - enzymatická přeměna substrátu na barevný produkt – měření na spektrofotometru o Používané enzymy: o Křenová peroxidáza (tetrametylbenzidin → tetrametylbenzimidin → 450 nm) o Alkalická fosfatáza (p-nitrofenylfosfát → nitrofenol → 405 nm) o Mezi výše uvedenými jednotlivými kroky je vždy tzv. promýváním, při kterém se nadbytek reaktantu odstraní přídavkem pufru do jamky, který je pak také z jamky odstraněn – separace nezreagovaných složek oVysoká citlivost – pg/ml Vlastní průběh ELISY Za každým krokem následuje tzv. promývací krok, kde se obsah jamky odsaje, do jamky se přidá nejčastěji fosfátový pufr a následně se obsah jamky odsaje. Toto promytí se opakuje zpravidla 3x za sebou, aby byl odstraněn veškerý nezreagovaný materiál. Kautování ELISA desky oImobilizace Ag nebo Ab na plastový povrch desky 1. Povrchová aktivace desky ◦ vazba NH2 nebo COOH skupin – tvorba kovalentních vazeb s protilátkou nebo antigenem ◦ Vhodné pro stanovení malých molekul – např. peptidy 2. Pasivní adsorpce ◦ Hydrofobní interakce mezi nepolárními strukturami proteinu a plastovým povrchem desky ◦ Protein určený k adsorpci je rozpuštěn v alkalickém kautovacím pufru (pH 9,5) – naleptává plastový povrch a usnadňuje adsorpci Ag nebo Ab o Blokování desky o Po navázání Ab/Ag zůstává část plastového povrchu volná. Aby bylo zabráněno nespecifickým vazbám, je nutno tato místa zablokovat inertní bílkovinou BSA – bovinní sérový albumin Systém záchytná + detekční Ab oDetekční (sekundární) protilátka proti hledanému Ag je konjugovaná s enzymem, oProč je každá protilátka od jiného živočišného druhu? Záchytná protilátka myší, polyklonální Detekční protilátka humánní, monoklonální Lidská monoklonální protilátka – s vysokou specifitou váže pouze konkrétní antigen Záchytná protilátka – s vysokou senzitivitou váže všechny varianty daného antigenu Tato kombinace významně snižuje riziko zkřížené reaktivity, která by mohla způsobit vznik nespecifických imunokomplexů (zdroj falešné pozitivity)!!! Vyšetřovaný Ag v séru Enzymatická detekce – přidání substrátu Nejčastěji používané enzymy detekčních nebo-li sekundárních protilátek: ◦ Křenová peroxidáza ◦ Alkalická fosfatáza Pro křenovou peroxidázu jsou používány tyto substráty: • 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidin – modré zbarvení + stop činidlo → žluté zbarvení – odečet při 450nm • 2, 2´-azinobis(3-ethylbenzthiazol-6sulfonát) • o-fenylendiamin • o-dianisidin • o-toulidin Pro alkalickou fosfatázu se používá substrát • 4-nitrofenylfosfát Luminscenční Immunoassay • Chemiluminscenční substráty – detekce záblesků luminiscence • SuperSignal • ECL Sendvičová ELISA - uspořádání oDetekce analytů s vysokou Mr (proteiny) oVysoká přesnost http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html oPoužití dvou protilátek specifických na různé epitopy jednoho antigenu. oJedna z protilátek je navázána na povrch jamky destičky a vychytává antigen ze vzorku. oDruhá protilátka značená enzymem slouží k detekci tohoto antigenu. oAntigen je tedy mezi protilátkami jako v sendviči. Sendvičová ELISA –vyšší senzitivita oSystém biotin – avidin/streptavidin – na jeden imunokomplex se váže více molekul enzymu oPo přídavku substrátu vzniká silnější zbarvení (pro analyty s nízkou koncentrací) Sendvičová ELISA využívající divalentní vazby některých autoprotilátek oDiabetes mellitus I. typu o Autoprotilátky proti dekarboxyláze kyseliny glutamové (anti-GAD) o Autoprotilátky proti zinkovému transportéru ZnT8 (anti-ZnT8) oDestička pokryta Ag oVazba auto-Ab jedním Fab fragmentem na Ag oDruhý Fab fragment váže biotinem značený antigen ze setu oPřídavek streptavidinem značeného enzymu oPřídavek substrátu → zbarvení Autoprotilátka má schopnost vázat se divalentně Kompetitivní ELISA - uspořádání oDetekce analytů s malou Mr http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html o Na rozdíl od nekompetitivní ELISY se navíc přidává enzymem značený Ag. o Přidaný enzymem značený antigen kompetuje – soutěží - s hledaným Ag v séru o vazebné místo zkoumaného Ag. o Čím více je zkoumaného Ag v séru, tím méně se naváže enzymem značeného Ag a tím nižší je pak měřená absorbce. Měření výsledků – Elisa reader Princip – vertikální spektrofotometrie - světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru zdroj záření – halog. žárovka nebo Xe výbojka paprsek prochází přes filtr do optických kabelů distribuce do 9 oddělených kanálů: - 8 měří vzorky - 9. vlákno kontrola intenzity záření optický systém vede paprsek přes štěrbiny a zrcadla do optického prostředí (jamka destičky)  9 detektorů - fotodiody Podrobnější popis – skripta instrumentální techniky. Doc. Dastych a kol. Výsledky 1. Kvalitativní ◦ Hodnotíme vizuálně přítomnost / nepřítomnost reakce → ano / ne – výsledek je pak pozitivní či negativní, použití cut-off kalibrátoru, hodnoty s absorbancí nad tuto hodnotu jsou hodnoceny jako pozitivní 2. Semi-kvantitativní ◦ IP (index pozitivity) = absorbance vzorku / absorbance cut-off kalibrátoru 3. Kvantitativní ◦ Kalibrační křivka – ředění kalibrátoru o známé koncentraci analytu ◦ Výsledek (absorbance = OD, optická denzita) se odečítá z kalibrační křivky ◦ Přepočet absorbance na koncentraci (Lambert-Beerův zákon) ◦ Výsledek má číselnou hodnotu s udanými jednotkami (např. U/ml, ug/ml) Hodnocení výsledků - kvantitativní Kalibrační řada Blank Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky pacientů Využití ELISA v imunologii oAntiinfekční imunita oStanovení protilátek proti některým infekčním agens oAutoimunitní onemocnění oStanovení autoprotilátek ELISA a antiinfekční imunita oStanovení přítomnosti protilátek proti vybraným infekčním agens o Protilátky proti tetanickému toxoidu o Protilátky proti difterickému anatoxinu o Protilátky proti kapsul. antigenu Haemophilus influenzae typ b o Protilátky proti specifickému pneumokokovému kapsulárnímu polysacharidu (anti-PCP) Jak reaguje imunitní systém pacienta? Sledování imunitní odpovědi na vakcinaci → zájem především o snížené hladiny → podezření na imunodeficience! Mikrobiologie Imunologie Čím se pacient nakazil? Diagnostika probíhající / prodělané infekce Očkování ELISA stanovení autoprotilátek u autoimunitních onemocnění oAnti-dsDNA - Systémový lupus erythematodus -SLE oENA – proti extrahovatelným nukleárním antigenům (SS-A, SS-B, Jo1 ….) oProti bazální membráně glomerulů – autoimunitní glomerulonefritidy oProti cyklickým citrulinovaným peptidům – RA oProti tkáňové transglutamináze – celiakie oProti tyrosin fosfatáze, dekarboxyláze kys. Glutamové – DM I oAnti-LC - proti antigenu jaterního cytosolu typu 1 (autoimunitní hepatitidy) oAnti-TTG –proti tkáňové transglutamináza (celiakie) oAnti-TG-tyreoglobulin, anti-TPO-tyreoidální peroxidáza (tyreoitidy) oRF – proti Fc molekule IgG (revmatoidní artritida, Sjogren sy.) oASCA – proti Sacharomyces cerevisiae (Crohnova choroba) – pozor, není to auto-Ab! Hodnocení výsledků oV klinické laboratoři existuje určitá hierarchie hodnocení výsledků oPodílí se na něm laborant i VŠ pracovník oVždy se hodnotí zároveň papírový výsledek s ELISA deskou 1. fáze kontroly – zdravotní laborant o Vizuální kontrola desky –zbarvení o Vizuálně hodnotí, zda se naměřená absorbance (barva jamek) shoduje s výsledky na papíře (pozitivní pacienti – shodují se souřadnice jamek na desce se souřadnicemi v tištěných výsledcích?) ◦ ANO – kontrola pokračuje do další fáze ◦ NE – hledáme příčinu (záměna desky) Hodnocení výsledků Kalibrační řada Blank Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky pacientů Hodnocení výsledků 2. fáze kontroly – VŠ pracovník oHodnocení s tištěnými výsledky – kontrola kalibrace: o Kontrola průběhu kalibrační křivky o Kontrola jednotlivých bodů – není některý výrazně mimo? o Pozitivní kontrola – leží v rozmezí, které udává výrobce? o Pozitivní vzorek pacienta – souhlasí poloha na desce s papírovým výsledkem? Ideální reálná kalibrační křivka – zploštění u nízkých koncentrací a vysokých koncentrací – koncentrace zkoumaného analytu v séru by měla ležet ve vyznačené přímkovém úseku Hodnocení výsledků oPokud nevyšly kontroly, musí se hledat příčina: o Jaká je šarže kontrol (mohlo nedávno dojít ke změně), kontrola postupu oPokud pozitivní kontrola vyšla příliš vysoká/nízká: o Všímáme si rozsahu kalibrace – měla by být co nejširší – od velmi nízkých hodnot absorbance až po vysokou o Zjišťujeme, jak vypadala předchozí měřená kalibrace u minulého zpracování testu o Kontrola pozitivních pacientů se záznamy v LISu (pokud již pacient byl dříve vyšetřen a aktuálně změřený výsledek se shoduje s jeho historií, je pravděpodobně špatně pouze kontrola): o Možná chyba ředění laborantky o Kontrola lahvičky – set, šarže Hodnocení výsledků oVýsledky měření kontrol se dlouhodobě zaznamenávají v čase – interní kontrola kvality o Levey-Jenningsův diagram → Westgardova pravidla o Varovné a regulační meze Stoupající nebo klesající trend může například značit expiraci setu, „zahušťování“ pozitivní kontroly, vadu spektrofotometru…. Hodnocení výsledků oPokud nevyjde kalibrace a kontroly – nutno vyšetření opakovat oPokud je vše v pořádku – VŠ výsledek ELISY podepíše (přebírá za ně odpovědnost) 3. Fáze kontroly o Přepis výsledků ELISA do pracovního listu o Přepisování výsledků z pracovního listu do systému (POZOR na překlepy) 4. Fáze kontroly - VŠ o Ve chvíli, kdy má pacient všechna požadovaná vyšetření hotová, provádí se validace výsledků o VŠ v počítači kontroluje, zda výsledky dávají logický smysl o Seznam výsledků, které je nutno okamžitě hlásit lékaři abnormální hodnoty– VŠ mu vysvětluje, co to znamená – možnost ovlivnění léčby pacienta o Uvolnění výsledků – tzn. propuštění výsledků počítačovým systémem pro tisk Hodnocení výsledků 5. Fáze kontroly – VŠ oZvalidované a uvolněné výsledky pacienta se tisknou v papírové podobě oExpedice výsledků – VŠ, který výsledky uvolnil opět kontroluje tyto výsledky pacienta v papírové podobě → o Není ve výsledcích něco podezřelého? o Nezapomnělo se na žádné vyšetření? oPo expedici výsledků do nich může přes počítačový systém nahlédnou ošetřující lékař dané nemocnice - před tímto krokem mohou výsledky“ vidět pouze pracovníci laboratoře oTištěné výsledky opouštějí pracoviště a putují k ošetřujícímu lékaři Hodnocení výsledků oVŠ svým podpisem odpovídá za výsledky! oO každé fázi zpracování vzorků a kontrol musí existovat záznam – kdo, kdy oRazítka, podpisy oV PC – laboratorní pracovník zapisuje pod svým jménem oVŠ také ovlivňuje laboratorní pracovníky – měl by si všímat nálady na pracovišti, motivovat lidi, aby se nebáli přiznat chybu oJde o zdraví lidí, zatajování chyb nepřichází v úvahu Příklad ELISAACLA - kvantitativně ◦ Výsledky ELISY z readru ◦ Metoda ACLA - protilátky proti kardiolipinu při vyšetření antifosfolipidového syndromu ◦ Výtisk obsahuje: ◦ hodnoty absorbance ◦ musí být uvedeno datum provedení testu ◦ musí být uvedeno, kdo test hodnotil – jméno VŠ ◦ musí být uveden název testu ◦ musí být uvedeno, kdo daný test zpracovával = jméno laborantky ◦ Kalibrační křivka ◦ Dále hodnoty absorbance pro jednotlivé vzorky a přepočet na koncentraci dle kalibrační křivky (není vyobrazeno) Kalibrace Pozitivní k. Negativní k. Výsledky pacientských vzorků Příklad ELISAACLA – kvantitativně, pokračování Výsledek z readeru dále obsahuje: •Naměřené hodnoty absorbancí jednotlivých vzorků, kalibrací a kontrol •Přiřazené hodnoty koncentrací •Označení jednotlivých jamek •Záznam mezí koncentrací ve kterých by se měla pohybovat pozitivní kontrola Sloupec 1 Hodnoty absorbance Sloupec 2 Hodnoty koncentrací Výsledky kontrol Hodnoty kalibrace Označení jednotlivých jamek Příklad ELISAACLA – kvantitativně, pokračování Na záznam z ELISA readeru navazuje výsledková listina, kde musí být uvedeno: Název testu Datum provedení Kdo zpracoval – jméno laborantky Souřadnice kalibrátorů, kontrol a vzorků pacientů Např. Sérum pacienta č.9 bylo v jamce A9 a zjištění koncentrace ACLA protilátek byla 6 APL/ml Příklad ELISAACLA– kvantitativně, pokračování Na záznam z ELISA readeru navazuje výsledková listina, kde musí být uvedeno: Kde byl výsledek zpracován Kdo hodnotil Údaje o použité ELISA kitu Vyhodnocení koncentrací pro jednotlivé pacienty Příklad č. 2 LKM autoprotilátky proti mikrozomům jater a ledvin Semikvantitativní hodnocení – index pozitivity Výsledky ELISY z readeru ◦ Metoda LKM - autoprotilátky proti mikrozomům jater a ledvin při vyšetření autoimunitních hepatitid ◦ Výtisk obsahuje: ◦ Název metody ◦ Jméno laborantky, která metodu zpracovala ◦ Jméno VŠ pracovníka, který hodnotil výsledky ◦ Naměřená surová data (absorbance) kontrol, kalibrátorů a vzorků pacientů ◦ Vypočtené indexy pozitivity na základě poměru absorbací vzorků a kalibrátoru Cut-off kalibrátory Pozitivní k. Negativní k. Výsledky pacientských vzorků Příklad č. 2 LKM autoprotilátky proti mikrozomům jater a ledvin Semikvantitativní hodnocení – index pozitivity Na záznam z ELISA readeru navazuje výsledková listina, kde musí být uvedeno: oKde byl výsledek zpracován oKdo hodnotil oÚdaje o použité ELISA kitu oSouřadnice kontrol a kalibrátorů oVyhodnocení koncentrací pro jednotlivé pacienty Systém vyšetření autoprotilátek oELISA kity velice drahé – cca 10 tisíc oNapř. stanovení ENA – obsáhlá skupina autoprotilátek proti extrahovatelným nukleárním antigenům oVyšetření probíhá ve dvou fázích: 1. screening ENA: je pacient pozitivní na ENA? → ANO / NE 2. Pokud ANO – teprve se nasazuje na ELISU, která určí podtyp ENA (SS-A, SS-B, Jo1, Scl- 70, SM, …) Další metody vyšetření autoprotilátek 1. Imunofluorescence – samostatná přednáška 2. Přístrojová ELISA – analyzátor Alegria 3. Chemiluminiscence – analyzátor Isys 4. Imunoblot Analyzátor Alegria Princip – ELISA na stripech – stanovení autoprotilátek Každý jednotlivý testovací proužek obsahuje kompletní sadu reagencií pro stanovení jediného vzorku. Jamka 1 a 2: prázdné, určené k ředění vzorku Jamka 3 a 4: pokryté antigenem (inkubace) Jamka 5: pozitivní kontrola (obsahuje hledanou autoprotilátku) Jamka 6: křenovou peroxidázou označená anti-lidská IgM/G/A Jamka 7: ředící pufr Jamka 8: TMB substrát (tetra-methyl-benzidin) Stačí pouze odtrhnout alobal z prvních 4 jamek a do první z nich napipetovat pacientovo sérum (10ul) → analyzátor provede ELISU sám Analyzátor Isys oPrincip – chemiluminiscence (využívá chemickou reakci k produkci světla ) oPevná fáze – magnetické kuličky (větší povrch než jamka destičky, větší senzitivita než ELISA) oMěření světelné emise která vzniká chemickou reakcí oExtrémní citlivost oSignál úměrný koncentraci auto-Ab ve vzorku oV naší laboratoři: o Stanovení ENA (screening + jednotlivé antigeny) o TTG – IgA a IgG (celiakie) o dsDNA – IgG (SLE) o ACLA – kardiolipin – IgM a IgG (antifosfolipidový syndrom) Magnetická kulička s navázaným antigenem – separace magnetem při promývání Antigen Pacientova autoprotilátka Sekundární protilátka proti lidskému IgG/A/M značená akridinium esterem akridinium ester 3. Při návratu elektronů do základní hladiny - světelná emise → záznam luminometrem 1. Přídavek: Trigger 1: alkalický pufr Trigger 2: H2O2 (vede k excitaci akridium esteru) 2. Vlivem oxidace dochází k excitaci akridinium esteru ENA oExtrahovatelné nukleární (jaderné) antigeny oMají vyšší Mr – lze je extrahovat 1) Screening – vytipují se ti pacienti, kteří jsou pozitivní na ENA (obecně) 2) Nasazení pozitivních vzorků na podtypy ENA: o Scl-70 (antigen je DNA topoizomeráza I ) – systémová sklerodermie o Smith (Sm) – pozitivní anti-Sm u části pacientů se SLE (systémový lupus erythematodes) o SSA/SSB – Sjögrenův syndrom o U1-snRNP (ribonukleoprotein učastnící se alternativního sestřihu mRNA) – smíšené onemocnění pojiva o Jo-1 (antigenem je tRNA syntetáza) – polymyositida, dermatomyositida SLE Alterovaná apoptóza – tvoří se autoprotilátky proti antigenům jádra → imunokomplexy → poškození tkání (na obrázku motýlí exantém v obličeji)Systémová sklerodermie Vlivem autoimunitní zánětlivé reakce (Th2 + Th17) se nadměrně tvoří kolagen – sklerotizace pokožky i vnitřních orgánů Sjögrenův syndrom Vlivem autoimunitní zánětlivé reakce dochází k poškození slinných a slzných žláz → suchost očí, suchost v ústech Polymyositida – poškození svalů CD8 T-lymfocyty - bolesti Dermatomyositida – poškození svalových kapilár komplementem → mikroinfartkty svaloviny (klinika- exém nad klouby rukou a fialová vyrážka kolem očí) Smíšené onemocnění pojiva Překryvný syndrom – SLE+RA+systémová sklerodermie+polymyositida Na obrázku Raynaudův fenomén – záchvatovitá bledost prstů – porucha cirkulace Imunoblot oPříprava blotů (probíhá u výrobce): o Proteiny (např. jaderné) elektroforeticky rozděleny v gelu – přenos (otisk) na nitrocelulózovou membránu urychlení elektrickým proudem (elektrobloting) o Membrána je následně rozstříhána na jednotlivé diagnostické proužky o každý protein má na proužku definovanou polohu o Výrobce dodá i šablonu, kde jsou polohy jednotlivých proteinů zobrazeny o Výrobce tyto proužky společně se šablonou prodává laboratořím - kity Imunoblot oPrincip stanovení: o Nejprve se musí zablokovat strip inertní bílkovinou (hovězí albumin) – zabrání se nespecifické vazbě protilátek ze séra na strip! o Pokud je autoprotilátka proti určitému proteinu přítomna v séru pacienta, naváže se na tento protein imobilizovaný na stripu, dochází k imunoprecipitaci o Detekce vazby autoprotilátky pomocí detekčních sekundárních protilátek značených enzymem o Po přídavku substrátu jej enzym přemění na barevný produkt o Výsledkem je vznik barevného proužku na stripu = pozitivita Imunoblot oJednotlivé barevné proužky se porovnávají s kontrolní šablonou oOdečet vizuálně nebo denzitometricky (% pozitivity) oImunoblotem se vyšetřují pacienti, u kterých nebyly detekovány imunofluorescenčně či ELISOU autoprotilátky při přetrvávajících klinických příznacích oDiagnostika – např. roztroušená skleróza Hodnocení imunoblotu – skener + analyzační software Musíme zadat referenční číslo použitého kitu (šarže) – důležité pro vyhodnocení pozice antigenů na stripech může být mezi šaržemi mírně posunutá Problémy při stanovení autoprotilátek oPři použití různých metodik můžou být někteří pacienti negativní i když onemocněním trpí, např. o Pacient je na určitou autoprotilátku negativní na imunofluorescenci, na ELISE, ale pozitivní na imunoblotu o Nebo o Pacient je pozitivní jen na imunoflurescenci ale negativní na ELISE i imunoblotu PROČ? o Různé metody mají různě ovlivněn cílový antigen (vliv zpracování), na který se autoprotilátka má vázat, např: o Imunofluorescence – použití krysích tkání – antigen se nemusí plně shodovat s lidským – protilátka se nemusí vždy navázat o ELISA – vlivem zpracování antigenů na desku může být ovlivněna struktura antigenu o Imunoblot – vlivem elektroforézy a elektroblotu může dojít k pozměnění konformace molekuly antigenu která vyústí v neschopnost vazby autoprotilátky o Nutnost brát ohled na kliniku pacienta, pokud má typickou symptomatologii ale na určité metodice vyjde negativní, je třeba otestovat autoprotilátky jinou metodikou Hodnocení: 0-29% negativní 30-49% slabě pozitivní 50-99% pozitivní 100% silně pozitivní