Přednášky z lékařské biofyziky Masarykova univerzita v Brně - Biofyzikální centrum Úvod do molekulární biofyziky Struktura přednášky Voda Vlastnosti koloidních roztoků Struktura bílkovin Struktura nukleových kyselin Vybrané metody studia biopolymerů Voda Vodíková vazba mezi molekulami vody Koloidy a jejich rozdělení Koloidy -- též nepravé roztoky -- dispergované částice o rozměru zhruba 10 -- 1000 nm. Podle převažujících vazebných sil dělíme na: * Micelární (též asociační, udržované v celku van der Waalsovými vazbami) * Molekulární (kovalentní vazby) Další dělení koloidů Podle afinity k rozpouštědlu * Lyofilní (hydrofilní) -- tvoří stabilní disperze * Lyofobní (hydrofobní) -- tvoří nestabilní disperze Podle tvaru částic (tvar částic je ovlivňován i rozpouštědlem) * Lineární (fibrilární -- DNA, myosin, syntetické polymery.....též skleroproteiny -- většinou nerozpustné ve vodě) * Sférické (globulární -- hemoglobin, glykogen ... též sféroproteiny -- většinou rozpustné ve vodě) Další vazebné síly (vazby) uplatňující se v koloidních částicích * Vodíkové vazby * Hydrofobní interakce * van der Waalsovy síly Elektrochemické vlastnosti koloidů * Některé molekulární i micelární koloidy jsou polyelektrolyty s amfoterními vlastnostmi (amfolyty) Vznik elektrické dvojvrstvy na povrchu koloidní částice Dva mechanismy: * Iontová adsorpce (i u lyofobních koloidů) * Elektrolytická disociace (u lyofilních koloidů) Dvojvrstva na povrchu koloidní částice se liší u koncentrovaných a zředěných elektrolytů Ve zředěných elektrolytech lze rozlišit stálou, difuzní a elektroneutrální oblast. Elektrokinetický potenciál -- z-potenciál Další vlastnosti koloidů * Mechanické: pevnost, pružnost, viskozita -- důsledky chemických vazeb a slabých chemických interakcí Tyto vlastnosti závisí na formě koloidu: Sol nebo gel. Tvorba gelu = želatinizace * Optické: Tyndallův jev (opalescence) - ultramikroskopie Tyndallův jev v micelárním a molekulárním koloidu Struktura bílkovin * Strukturními jednotkami bílkovin jsou aminokyseliny (AK), spojené peptidovou vazbou: -RCH-NH-CO-RCH-, která může hydrolyzovat: -RCH-NH[2] + HOOC-RCH- * Karboxylové a aminové skupiny mohou disociovat. Např. kyselina glutamová a asparagová mají volnou karboxylovou skupinu: -COOH not 3/4(r) -COO- + H+ * AK lysin a arginin mají volnou aminoskupinu, která "disociuje" (ionizuje): -NH[2] + H+ not 3/4(r) -NH[3]^+ * V bílkovinách se běžně vyskytuje 20 AK, které členíme na AK s polárním a nepolárním postranním řetězcem. * AK s aromatickým jádrem nebo heterocyklem (fenylalanin, tyrosin, tryptofan) silně absorbují UV světlo kolem 280 nm. * Cystein obsahuje sulfhydrylovou skupinu (-SH), která dehydrogenací oxiduje a spojuje se sulfhydrylovými skupinami jiných cysteinových zbytků kovalentními disulfidickými můstky (-S-S-). Struktura bílkovin * Primární (sled kovalentně vázaných AK zbytků) * Sekundární (vzájemné prostorové uspořádání sousedních článků polypeptidového řetězce -- dáno především vodíkovými vazbami) O/ a-helix O/ b-struktura (skládaný list) O/ jiné * Terciární (prostorové uspořádání řetězce jako celku -- dáno hydrofobními a vodíkovými vazbami, zpevněno -S-S- můstky) * Kvartérní (způsob spojení jednotlivých polypeptidových řetězců ve vyšší celky -- nekovalentně O/ Homogenní -- všechny protomery stejné O/ Heterogenní -- protomery dvou i více typů b-struktura (skládaný list -- antiparalelní model) http://www-structure.llnl.gov/Xray/tutorial/protein_structure.htm Trojitá šroubovice kolagenu http://cwx.prenhall.com/horton/medialib/media_portfolio/text_images/FG04_34.JPG Struktura nukleových kyselin * Mononukleotidy tvoří: O/ Dusíkaté báze pyrimidinové (C, U, T) a purinové (A, G) O/ Cukr (ribóza, deoxyribóza) O/ Zbytek kyseliny fosforečné ^* DNA: až statisíce podjednotek. M.h. 10^7 -- 10^12 * RNA: O/ Informační (mediátorová, messenger) O/ Přenosová (transferová) O/ Ribosomální B-DNA http://cwx.prenhall.com/horton/medialib/media_portfolio/text_images/FG19_15aC.JPG Struktura chromatinu http://cwx.prenhall.com/horton/medialib/media_portfolio/text_images/FG19_23_00742.JPG, http://cwx.prenhall.com/horton/medialib/media_portfolio/text_images/FG19_25_00744.JPG * Transferová RNA -- schematický model a t-RNA z kvasnic * http://cwx.prenhall.com/bookbind/pubbooks/hillchem3/medialib/media_portfolio/text_images/CH23/FG23_14.JPG, http://www.imb-jena.de/cgi-bin/ImgLib.pl?CODE=4tra Ribosomální RNA http://www.imb-jena.de/cgi-bin/htmlit.pl?color=ffffff&id=GIF&src=1c2w.gif&name=Image%20Library%20Thumb%20Nail%201C2W Konformační změny a denaturace biopolymerů * Změny sekundární, terciární, resp. kvartérní struktury biopolymerů se označují jako změny konformační. * Mohou být reverzibilní i ireverzibilní. * Funkční stav biopolymeru = nativní stav * Nefunkční stav biopolymeru = denaturovaný stav Denaturační faktory * Chemické: O/ Změny pH O/ Změny koncentrace elektrolytů O/ Těžké kovy O/ Denaturační činidla narušující vodíkové vazby -- močovina * Fyzikální: O/ Zvýšená teplota O/ Ionizující záření O/ Ultrazvuk Studium struktury biopolymerů * Studium struktury biopolymerů a jejich komplexů např. umožňuje pochopit: O/Specifičnost enzymatických a imunologických reakcí O/Účinky některých léčiv (cytostatik) na molekulární úrovni. O/Mechanismy transportních procesů O/Buněčný pohyb O/................. Metody založené na měření interakce s elektromagnetickým zářením * Měření (Rayleighova) rozptylu světla. Interakce fotonů s dipóly molekul. Intenzita rozptýleného světla závisí na mol. hmotnosti a na úhlu rozptylu, čehož lze využít i pro odhady tvaru makromolekul. * Ramanova spektrometrie. Při rozptylu světla dochází k malé změně vlnové délky rozptýleného světla, způsobené malým pohlcením či zvýšením energie rozptylovaných fotonů při přechodech mezi vibračními a rotačními stavy molekul. Ty se mění při změnách struktury molekul - změny Ramanových spekter proto odrážejí změny struktury molekul. Ramanova spektrometrie Infračervené vibrační spektrum hexanu http://www.columbia.edu/cu/chemistry/edison/IRTutor.html Další optické metody * Absorpční spektrofotometrie v UV oblasti. -- Tryptofan a tyrosin mají absorpční maximum kolem 280 nm. Fenylalanin při 255 nm. -- Nukleotidy (dusíkaté báze) - absorpční maxima při 260 - 270 nm. -- Chromofory - jejich absorpční vlastnosti se mění v závislosti na chemickém okolí. Hypochromní efekt (HE). * Absorpce světla ovlivňována dipólovým momentem vazeb, se kterými interaguje. Jsou-li dipóly paralelní, vzájemně se ovlivňují a snižuje se poněkud jejich schopnost absorbovat energii fotonů. U bílkovin se HE projevuje u peptidových vazeb, které mají absorpční maximum v UV kolem 190 nm. Jsou-li dipólové momenty těchto vazeb náhodně uspořádané (denaturovaná bílkovina), absorbují světlo lépe než ve stavu s pravidelnými strukturami. * Helicita - poměrné zastoupení uspořádaných částí makromolekuly. Dvoušroubovice DNA absorbuje UV méně než neuspořádaná (denaturovaná) molekula. Hypochromní efekt u kyseliny polyglutamové. Při pH 7 vytváří statistické klubko (1), při pH 4 má šroubovicovou strukturu (2). Absorpční maximum peptidových vazeb je pak sníženo vlivem jejich prostorového uspořádání. e je molární absorpční koeficient a l je vlnová délka UV záření. Dle Kalouse a Pavlíčka, (1980). Cirkulární dichroismus Obdobné informace: metoda cirkulárního dichroismu (CD) - porovnávána absorbance levotočivě a pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla v oblasti absorpčního maxima Podobné využití mají tyto metody i při studiu struktury NK. Rentgenstrukturní analýza * Krystalová mřížka působí na rtg záření jako optická mřížka. Dochází k ohybovým jevům a vzniku interferenčních obrazců. Tyto obrazce lze matematicky analyzovat a získat tak informaci o rozložení elektronů v molekulách tvořících krystal. Krystalogram B-DNA získaný v r. 1952 Rosalindou E. Franklinovou, na základě kterého předložili Watson a Crick model dvoušroubovicové struktury DNA Nové mikroskopické techniky -- příklady: AFM a STM Nové mikroskopické techniky Nové mikroskopické techniky * skanovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tunnelling electron microscopy, STM). Metody separace koloidů a hrubých disperzí * Sedimentace * K jejímu urychlení se používají centrifugy (ultracentrifugy, až několika set tisíc ot./min, až miliony g). * Sedimentační rychlost závisí na rozdílu hustot částic a prostředí, na jejich velikosti a tvaru. Hlavně se uplatňují tři síly: * 1) Vztlaková * 2) Odstředivá * 3) Odporu proti pohybu * Sedimentační koeficient s závisí na molekulové hmotnosti M dle Svedbergova vzorce: Sedimentační analýza * K rozdělení polydisperzního koloidu dochází vlivem různě rychlého odstředivého pohybu jednotlivých složek (frakcí). Dvě možnosti: * 1) Analyzovaným koloidem se převrství čisté rozpouštědlo. Po určité době odstřeďování se zjišťuje poloha jednotlivých složek koloidu v rozpouštědle - zónová sedimentace. * 2) Sedimentace v hustotním gradientu - v kyvetě se intenzívním odstřeďováním připraví hustotní gradient vhodné látky (např. CsCl). Pohyb sedimentující složky se zastaví tam, kde vztlaková síla bude stejná jako síla odstředivá. Analytická ultra-centrifuga schéma podle: http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/geerlof/draft_frames/flowchart/Characterization/AUC/auc.html#Why Analytical Ultracentrifugation Elektroforéza * Elektroforéza -- pohyb iontů v elektrickém poli. Při rovnoměrném přímočarém pohybu kulových částic o poloměru r je elektrostatická síla působící na částici v rovnováze se silou odporu prostředí. Síla odporu je dána Stokesovým vzorcem: F = 6.p.r.h.v * Kde v je rychlost částice a h dynamická viskozita prostředí. Elektrické pole působí na částici silou: F = z.e.E * kde z je počet elementárních nábojů částice, e je elementární náboj (1,602.10^-19 C) a E je intenzita elektrického pole v daném místě. Pro rychlost pohybu částice pak platí: Elektroforetická pohyblivost * Lépe reprodukovatelnou veličinou je elektroforetická pohyblivost u, definovaná jako podíl rychlosti pohybu částice a intenzity elektrického pole. Platí: Shokugasusumu!