Přednášky z lékařské biofyziky Masarykova univerzita v Brně - Biofyzikální centrum Úvod do molekulární biofyziky II Struktura biopolymerů * Studium struktury biopolymerů a jejich komplexů např. umožňuje pochopit: O/Specificitu enzymatických a imunologických reakcí O/Účinky některých léčiv (cytostatik) na molekulární úrovni. O/Mechanismy transportních procesů O/Buněčný pohyb O/................. *Metody založené na měření mechanických vlastností * Velikost a tvar makromolekul lze studovat měřením: O/ osmotického tlaku O/ difuzního koeficientu O/ viskozity (tvaru molekul) * Zjištění poloměru částic: O/ Měření rychlosti sedimentace * Zjištění velikosti a částečně i tvaru: O/ TEM O/ chromatografie - molekulově-síťový efekt (gelová permeační chromatografie) O/ elektroforetická pohyblivost bílkovin (dodecylsulfát sodný se definovaně váže k bílkovině a eliminuje její vlastní elektrický náboj, přičemž nese jeden náboj záporný). B) Metody založené na měření interakce s elektromagnetickým zářením * Měření (Rayleighova) rozptylu světla. Interakce fotonů s dipóly molekul. Intenzita rozptýleného světla závisí na mol. hmotnosti a na úhlu rozptylu, čehož lze využít i pro odhady tvaru makromolekul. * Ramanova spektrometrie. Při rozptylu světla dochází k malé změně vlnové délky rozptýleného světla, způsobené malým pohlcením či zvýšením energie rozptylovaných fotonů při přechodech mezi vibračními a rotačními stavy molekul. Ty se mění při změnách struktury molekul - změny Ramanových spekter proto odrážejí změny struktury molekul. Ramanova spektrometrie B) Metody založené na měření interakce s elektromagnetickým zářením * Lze využít studium infračervených spekter molekul. Infračervené vibrační spektrum hexanu http://www.columbia.edu/cu/chemistry/edison/IRTutor.html Další optické metody * Absorpční spektrofotometrie v UV oblasti. -- Tryptofan a tyrosin mají absorpční maximum kolem 280 nm. Fenylalanin při 255 nm. -- Nukleotidy (dusíkaté báze) - absorpční maxima při 260 - 270 nm. -- Chromofory - jejich absorpční vlastnosti se mění v závislosti na chemickém okolí. Absorpční spektra aminokyselin Tryptofan je přirozeným chromoforem -- obr. ukazuje zhášení jeho fluorescence v závislosti na koncentraci 9-cis-retinalu. Jde o vliv této látky na bílkovinu potřebnou k regeneraci rodopsinu. http://www.molvis.org/molvis/v4/a33/nickerson-fig2.html Hypochromní efekt (HE). * Absorpce světla ovlivňována dipólovým momentem vazeb, se kterými interaguje. Jsou-li dipóly paralelní, vzájemně se ovlivňují a snižuje se poněkud jejich schopnost absorbovat energii fotonů. U bílkovin se HE projevuje u peptidových vazeb, které mají absorpční maximum v UV kolem 190 nm. Jsou-li dipólové momenty těchto vazeb náhodně uspořádané (denaturovaná bílkovina), absorbují světlo lépe než ve stavu s pravidelnými strukturami. * Helicita - poměrné zastoupení uspořádaných částí makromolekuly. Dvoušroubovice DNA absorbuje UV méně než neuspořádaná (denaturovaná) molekula. Hypochromní efekt u kyseliny polyglutamové. Při pH 7 vytváří statistické klubko (1), při pH 4 má šroubovicovou strukturu (2). Absorpční maximum peptidových vazeb je pak sníženo vlivem jejich prostorového uspořádání. e je molární absorpční koeficient a l je vlnová délka UV záření. Dle Kalouse a Pavlíčka, (1980). Optická rotační disperze * Měření optické aktivity i absorpce polarizovaného světla. Při konformačních změnách molekul se mění stavba molekul, což lze polarimetricky sledovat * Přesnější: Optická rotační disperze (ORD) - závislost optické otáčivosti na vlnové délce světla. Lze získat údaje o zastoupení a-šroubovic či poměrném zastoupení a-šroubovic a b-struktur. * Nakonec byla tato metoda nahrazena citlivější metodou cirkulárního dichroismu (CD) Cirkulární dichroismus Obdobné informace: metoda cirkulárního dichroismu (CD) - porovnávána absorbance levotočivě a pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla v oblasti absorpčního maxima Podobné využití mají tyto metody i při studiu struktury NK. * Informace o sekundární a terciární struktuře bílkovin či NK poskytují i: O/metody elektrochemické (studuje se interakce makromolekul s elektrodami) O/nukleární magnetická resonance (umožňuje určit chemické okolí studovaných atomů), O/elektronová spinová resonance aj. Rentgenstrukturní analýza * Krystalová mřížka působí na rtg záření jako optická mřížka. Dochází k ohybovým jevům a vzniku interferenčních obrazců. Tyto obrazce lze matematicky analyzovat a získat tak informaci o rozložení elektronů v molekulách tvořících krystal. Krystalogram B-DNA získaný v r. 1952 Rosalindou E. Franklinovou, na základě kterého předložili Watson a Crick model dvoušroubovicové struktury DNA Nové mikroskopické techniky * optická skanovací mikroskopie v blízkém poli (near-field optical scanning microscopy, NFOS - Near-field Scanning Optical Microscopy, NSOM, SNOM) Nové mikroskopické techniky Nové mikroskopické techniky DNA zobrazená pomocí AFM - http://spm.phy.bris.ac.uk/research/DNA/images/dna2.jpg Nové mikroskopické techniky * skanovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tunnelling electron microscopy, STM). Nové mikroskopické techniky skanovací tunelová elektronová mikroskopie - STM. Problém * Nelze obecně předpokládat, že struktura bílkoviny v krystalickém stavu, v roztoku a in situ je identická. Bílkoviny jsou někdy aktivní jen jako integrální součásti jiných struktur. Struktura NK bude ovlivňována interakcí s bílkovinami. Lokální změnu struktury DNA vyvolávají i látky, které se mohou vmezeřit (interkalovat) mezi paralelně uspořádané báze v dvoušroubovici. Metody separace koloidů a hrubých disperzí Pomíjíme chromatografii a chemické metody. Dva cíle: * Separace disperzního prostředí a disperzního podílu. * Rozdělení (frakcionace) polydisperzních systémů na složky. * Příklad: analýza krevní plazmy, mozkomíšního moku aj. a) Ultrafiltrace. * Membrána propouští jen rozpouštědlo a malé molekuly. Na koloid je nutno působit zvýšeným tlakem, který překonává jeho onkotický tlak a urychluje přestup rozpouštědla na druhou stranu membrány - velmi šetrná metoda. * Chceme-li z koloidu odstranit pouze nízkomolekulární příměsi, ne však rozpouštědlo, lze použít dialýzu. * Dialyzační princip se uplatňuje i v umělé ledvině. Metody separace koloidů a hrubých disperzí * b) Sedimentace * K jejímu urychlení se používají centrifugy (ultracentrifugy, až několika set tisíc ot./min, až miliony g). * Sedimentační rychlost závisí na rozdílu hustot částic a prostředí, na jejich velikosti a tvaru. Hlavně se uplatňují tři síly: * 1) Vztlaková dle Archimedova zákona: F = (r - r').V.a = (r - r').V.r.w^2 kde r a r' jsou hustoty částic a rozpouštědla, V objem částice, a odstředivé zrychlení, r poloměr otáčení, w úhlová rychlost. * 2) Odstředivá: F = m[ef].r.w^2 kde m[ef] je tzv. efektivní hmotnost: m[ef] = V(r - r') * 3) Odporu proti pohybu tělesa v kapalině (Stokesův vzorec) F = 6.p.r.h.v kde r je poloměr částice, h dynamická viskozita, v rychlost pohybu částice vůči kapalině. * Po separaci proměnných a integraci získáváme rovnici: ln r = s.w^2.t + konst. s je obsaženo ve směrnici závislosti přirozeného logaritmu r na čase. Tento graf lze získat proměřováním polohy částice r během sedimentace. * Sedimentační koeficient menších molekul bílkovin - 10^-13 s. * Jednotka sedimentačního koeficientu: svedberg S ( = 1.10^-13 s). * Zviditelnění sedimentujících látek: měřením absorpce UV záření nebo indexu lomu. * Sedimentační koeficient s závisí na molekulové hmotnosti M dle Svedbergova vzorce: Sedimentační analýza * K rozdělení polydisperzního koloidu dochází vlivem různě rychlého odstředivého pohybu jednotlivých složek (frakcí). Dvě možnosti: * 1) Analyzovaným koloidem se převrství čisté rozpouštědlo. Po určité době odstřeďování se zjišťuje poloha jednotlivých složek koloidu v rozpouštědle - zónová sedimentace. * 2) Sedimentace v hustotním gradientu - v kyvetě se intenzívním odstřeďováním připraví hustotní gradient vhodné látky (např. CsCl). Pohyb sedimentující složky se zastaví tam, kde vztlaková síla bude stejná jako síla odstředivá. * Důkaz tzv. semikonzervativního modelu replikace DNA. Analytická ultra-centrifuga schéma podle: http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/geerlof/draft_frames/flowchart/Characterization/AUC/auc.html#Why Analytical Ultracentrifugation Życzę smacznego!