Mikrocytogenetika Prenatální diagnostika VCA Vyšetření párů s poruchou reprodukce Renata Gaillyová LF MU 2007 Mikrocytogenetika Molekulární cytogenetika • FISH (fluorescenční in situ hybridizace), M-FISH, SKY (spektrální karyotypování), CGH (komparativní genomová hynridizace), • submikroskopické změny (mikrodelece nebo mikroduplikace, marker chromosomy, složité přestavby, vyhledávání typických změn v onkologii…) • rychlá diagnostika v časové tísni, v graviditě • vyšetření v metafázi i interfázi Komparativní genomová hybridizace Syndrom Di George • Velo - Kardio- Faciální syndrom • CATCH 22 • Vrozené srdeční vady typické konotrunkální vady, faciální dysmorfie, hypoplasie - aplasie thymu event. příštitných tělísek, imunodefekty, hypoparathyreoidismus Williams - Beuren syndrom • del 7q11.23 • Faciální dysmorfie - Elfin face – silné rty, odstávající větší uši, srdeční vady - stenosy aorty, plicnice, hypokalcemie, malá postava, PMR, hernie, hrubý hlas, kostní anomalie, přátelská povaha, dobrý sluch... Prader-Willi syndrom • Hypotonie, hypotrofie, poruchy příjmu potravy v kojeneckém věku • PMR, malá postava, obesita, hyperfagie, akromikrie, hypogonadismus později • mikrodele delece 15q11-12 paternální Prader-Willi syndrom • Snížená aktivita plodu § Neprospívání kojenců § Hypotonie novorozenců § Obesita § Hyperfagie, neukojitelný hlad § Hypogenitalismus, hypogonadismus § PMR § Malá postava § Akromikrie § Hypopigmentace § Problémy s chováním Angelman syndrom • těžká PMR, epilepsie, záchvaty smíchu, těžce opožděn vývoj řeči • atypické chování • stigmatizace • mikrodelece 15q11-12 mat Telomery • fyzické konce chromozomů • úplné konce tvořeny proteiny a tandemovými repeticemi DNA(TTAGGG) 3-20 Kb (společné pro všechny chromozomy) • TAR – doprovodné repetitivní sekvence subteloerické oblasti 100-300 Kb • jedinečné sekvence – sondy pro FISH Klinický význam přestaveb telomer • aberace v této oblasti - příčina spontánních abortů, VVV a mentálních retardací • 6-8 % pacientů s dysmorfií a MR - mikrodelece subtelomerických oblastí chromozomů !!! Prenatální diagnostika VCA • Screeningové vyšetření (celoplošné) • biochemický screening I. trimestru, • biochemický screening II. trimestru • integrovaný a kombinovaný screening • screening UZ • Vyšetření cílené (invazivní) • CVS • AMC • Kordocentéza • Specializovaný UZ Biochemický screening • Biochemický screening I. trimestru • v 10.-12. týdnu těhotenství (t.g.) • Biochemický screening II. trimestru • 16-18. týdnu těhotesntví • Vyhledávání těhotenství se zvýšeným rizikem Downova syndromu, Edwardsova syndromu, rozštěpu neurální trubice nebo Smith-Lemli-Opitzova syndromu u plodu • Vyšetření dobrovolné – doporučené všem těhotným, hodnotí specialista Biochemický screening I. trimestr • 10.-13.t.g. dle UZ • PAPP-A, free beta HCG • UZ – nuchální projasnění (NT v mm), přítomnost-osifikace nosní kůstky (NB+/-) • Riziko M. Down (+21) • Výpočet individuálního rizika pro těhotenství – počítačový program • Hranice - riziko 1/250 – positivní screening • Hodnotí specialista Biochemický screening II. trimestr • 16.-18.t.g. dle UZ • M. Down (+21) • Syndrom Edwards (+18) • Rozštěpy neurální trubice NTD • syndrom Smith-Lemli-Opitz (AR) • Výpočet individuálního rizika pro těhotenství (počítačový program) -hodnotí specialista • 1/250 – positivní screening • Hraniční riziko 1/250-1/350 M. Down – BCH screening 16.-18. t.g. • Počítačové vyhodnocení-individuální riziko hranice 1 : 250 (až 1 : 350) • Kombinovaný screening • Integrovaný screening Syndrom Edwards – BCH screening II. trim. • AFP – snížen • HCG – snížen • uE3 - snížen • Počítačové vyhodnocení – ind. riziko!!! • UZ – hypotrofie, VVV, atypické držení prstů, atypický profil obličeje…. BCH screening - jiné chromosomové aberace • zvýšená hodnota HCG • patologie při UZ specializovaném vyšetření • atypický screening • Screening hodnotí vždy specialista • Nespolehlivé a nespecifické Prenatální biochemický screening • Hodnotí se počítačový výsledek • Individuální riziko • Zvýšené riziko = doporučení genetické konzutlace a dalšího upřesňujícího vyšetření • ultrazvuk • odběr plodové vody UZ screening • 10-13.t.g. - délka těhotenství, počet plodů, srdeční akce, základní anatomie plodu, projasnění na krčku plodu NT, přítomnost nosní kůstky NB+/- k hodnocení riziko Downova syndromu u plodu) • 20.t.g. – poznatelné vrozené vývojové vady a nepřímé známky VCA, velikost plodu, množství plodové vody, srdeční akce • 21.t.g. – vrozené srdeční vady • Vyšetření by měl vždy provádět specialista Prenatální kardiologie ve 21.t.g. (detekce poznatelných srdečních vad) • Vrozené srdeční vady jsou nejčastější vývojovou vadou u člověka, často spojené s dalším postižením • Prenatální diagnostika srdečních vad vyžaduje specializovanou erudici a zkušenost • Poznání srdeční vady u plodu umožňuje dle závažnosti modifikovat další postup (ukončení těhotenství, léčba plodu, sledování a porod na specializovaném pracovišti) Invazivní postupy • CVS – odběr choriových klků – po 10.t.g. • AMC – odběr plodové vody • Časná AMC – 12-14.t.g. • Klasická AMC 15-18.t.g. • Pozdní AMC • Kordocenteza – odběr fetální krve z pupečníku • Placentocenteza Důvody k odběru plodové vody • Positivní biochemický screening • Patologický ultrazvukový nález u plodu • Vyšší věk rodičů • Nosičství balancované chromosomové aberace u rodičů • Chromosomová aberace v rodině • Monogenně dědičné nemocnění v rodině Preimplantační genetická diagnostika (PGD) • Jedná se o časnou prenatální diagnostiku, která je vázaná na techniky umělého oplodnění. • PGD je metoda umožňující genetickým vyšetřením jedné nebo dvou buněk (blastomer) odebraných z vyvíjejícího se embrya odhalit genetické abnormality budoucího plodu. K transferu do dělohy lze vybrat pouze embrya bez genetické zátěže. • Před provedením PGD doporučujeme prekoncepční genetické vyšetření a stanovení karyotypu partnerů, DNA analýza rodičů při monogenně dědičném onemocnění. Preimplantační genetická diagnostika v.s. preimpalntační genetický screening častých aneuploidií • PG Diagnostika – vyšetření u párů s vysokým genetickým rizikem onemocnění u plodu – nositelé translokací nebo vlohy pro monogenně dědičné onemocnění • PG Screening – screening nejčastějších aneuploidií, riziko je zvýšené vzhledem k věku nebo nepříznivé reprodukční anamnese Preimplantační genetický screening nejčastěších aneuploidií Nejčastěji vyšetřované chromosomy • 13,15,16,18,21,22,X, Y • příčiny nejčastějších aneuploidií • příčiny spontánních potratů Výhody PGD • detekce genetických vad v nejrannějším stádiu prenatálního vývoje • zvýšení pravděpodobnosti úspěšného transferu a tím i úspěšné gravidit • snížení rizika spontánního potratu výběrem embrya bez chromozomové aberace • snížení potřeby ukončení gravidity z genetické indikace • snížení psychické zátěže pro rodiče Nevýhody PGD • časová tíseň • finanční náročnost metody • možno provádět pouze malé množství materiálu • (dg. z 1 - 2 buněk) • nutnost IVF • nutno doporučit vždy kontrolu klasickými metodami • větší riziko diagnostického omylu • prenatální diagnostiky • neodhalení případného mozaicizmu !! • etické hledisko Etické a právní aspekty prenatální diagnostiky • vyšetření dobrovolné • vždy dle přání rodiny • dle platných zákonů • genetické poradenství • nedirektivní přístup • snaha o maximální informovanost rodiny Genetické poradenství a genetické vyšetření u poruch reprodukce • Je porucha fertility důsledkem genetické poruchy, která může být přenášena do další generace? • Může korekce fertility zvýšit riziko výskytu malformací, chorob a VCA u potomků? • Může genetické vyšetření a prenatální diagnostika snížit toto riziko? Genetické příčiny poruch reprodukce • Vrozená chromosomová aberace • Monogenně dědičné onemocnění • VVV, multifaktoriálně dědičné onemocnění • Zvýšená tendence ke spontánním potratům v rámci dědičných trombofílií • Poruchy spermatogeneze na základě poruchy v genetickém materiálu Příčiny opakovaných fetálních ztrát • gynekologické • genetické • hematologické • imunologické • endokrinologické • environmentální • jiné Genetické vyšetření • Anamnesa • Genealogie • Karyotyp • Mutační analýza CFTR genu • DNA analýza oblastí AZF a,b,c, (Yq) Další sledování • CAR • Endokrinologie • Urologie • Andrologie • Imunologie • Další vyšetření dle event. základního onemocnění Vrozené chromosomové aberace • Populační frekvence 0,58-0,7 %, z toho v balancované formě asi 0,2 % • Nosiči balancované přestavby mají zvýšené riziko reprodukčních obtíží • Neplodnost • Opakované fetální ztráty • Porod dítěte s nebalancovanou přestavbou Nejčastější chromosomové aberace u párů s poruchou reprodukce • Mozaiky aneuploidie X u žen (45,X/46,XX/47,XXX…) • Přestavby autosomů • Klinefelterův syndrom + mozaika (47,XXY) • Přestavby gonosomů • Marker chromosomy • 47,XYY • jiné • Genetické vyšetření neplodného páru doporučujeme vždy, a to ještě před prvním IVF cyklem • Cytogenetické vyšetření doporučujeme u všech párů s 2 a více spontánními potraty • Vyšetření trombofilních mutací vždy u pacientek se 3 a více fetálními ztrátami, • V případě 2 x SA mohou být výsledky diskutabilní • Prekoncepční podávání kyseliny listové je vhodnou prevencí opakovaných fetálních ztrát • Hematologické vyšetření doporučujeme u žen, u kterých zjistíme nosičství jedné z vyšetřovaných mutací, její další sledování se řídí doporučením hematologa • Dispenzarizaci a vyšetření rodinných příslušníků doporučujeme při nálezu mutace G1961A fV a G20210A f II, případně u homozygotů C677T MTHFR • Základní mutační analýza CFTR genu je jednou z mála možností prekoncepčního, genetického, preventivního i cíleného vyšetření • Mikrodelece Yq vyšetřovat pouze u mužů s těžkou oligo- nebo azoospermií opakovaně zjištěnou (po 1-2 mil/ml), ve spolupráci s andrologií Genetické poradenství je nezbytné na všech úrovních celého vyšetřovacího a terapeutického procesu. Veškeré nabízené postupy v reprodukční medicíně, reprodukční genetice a prenatální diagnostice musí být provedeny na základě požadavku rodiny a s jejím informovaným souhlasem. Rizika asistované reprodukce • Všechno nelze odhalit prekoncepčním ani prenatálním vyšetřením • Zvýšené riziko vícečetných gravidit • Zvýšené riziko předčasných porodů • Zvýšené riziko fetálních ztrát • U některých metodik mírně zvýšené riziko chromosomových aberací u potomků • Riziko přenosu mužské neplodnosti – delece AZF • Darované gamety, embrya