8. Model peptické ulcerace žaludku na zvířeti Michal Jurajda 1. Cíl Vysvětlit etiopatogenezi vzniku peptických ulcerací žaludku a dvanáctníku. Demonstrovat na zvířecím modelu ulcerogenní působení nesteroidních antiflogistik a antiulcerózní působení blokátorů H2 receptoru. 2. Úvod do problematiky Peptické ulcerace v žaludku a dvanáctníku vznikají při nerovnováze v působení obranných slizničních mechanismů a agresivních žaludečních šťáv. Vznik peptických ulcerací usnadňují látky a stavy, které vedou ke zhoršení trofiky žaludeční sliznice a ke snížené produkci hlenu. Uplatňuje se také zvýšená sekrece žaludečních šťáv. Naopak protektivně působí látky snižující sekreci HCl nebo látky zvyšující sekreci hlenu. 3. Materiál a metody Laboratorní zvířata (Rattus norvegicus) lačná po dobu 24 hodin, indometacin substance, ranitidin (RANITAL, Lek Pharmaceutical), anestetická směs, chirurgické instrumentárium, katetr. 4. Postup U laboratorních potkanů vyvoláme aplikací suspenze indometacinu do žaludku vznik peptických ulcerací. Porovnáním kontrolní a pokusné skupiny zjišťujeme antiulcerózní působení ranitidinu. Zvířata uvedeme do lehké inhalační éterové narkózy. Pomocí katétru nasondujeme žaludek a podáme ranital (u kontrolní skupiny fyziologický roztok). Po půl hodině opět v lehké éterové narkóze aplikujeme všem zvířatům suspenzi indometacinu. Experiment vyhodnocujeme po 24 hodinách. Zvířata utratíme predávkovaním etheru a vypreparujeme žaludek. Žaludek rozstrihneme podél velké kurvatury a sliznici pod tekoucí vodou zbavíme žaludečnflio obsahu a hlenu s krví. Preparáty žaludku napneme mezi dvěma skly a spočítáme leze. Poté napneme žaludky na korkovou destičku a zafixujeme v 10% formalínu. Trvalé preparáty vyfotíme a vyhodnotíme plochu a počet lézí. K hodnocení můžeme použít program ImageJ. 5. Výsledky 29 Porovnáme počty a plochy žaludečních lézí mezi pokusnou a kontrolní skupinou. K zjištění statisticky signifikantního rozdílu použijeme nepárový neparametrický test (např. Mann -Whitney U test). 6. Závěr Několik poznámek k možné interpretaci výsledků (závěr samozřejmě koncipují studenti sami), např. očekávaný nárůst hodnot je... možné zdroje chyb při měření 30 9. Radiační poškození krevních buněk I. a II. Lydie Izakovičová Hollá 1. Cíl Cílem praktického cvičení je zjistit, jak se mění v důsledku celotělového ozáření dávkou 4 Gy u experimentálních potkanů počet, eventuálně další vlastnosti erytrocytu, leukocytu a trombocytů, a to ve dvou různých časových odstupech po ozáření (3 a 20 dní, tj. ve stadiu nejhlubší deprese a ve stadiu regenerace). Dále nás zajímá, zda dochází ke změnám hmotností ozařovaných zvířat a některých jejich orgánů (sleziny). 2. Úvod do problematiky Po celotělovém ozáření vyšších organizmů se rozvíjí tzv. nemoc z ozáření, jejíž projevy závisí na velikosti dávky a na tom, zda šlo o jednorázové ozáření nebo organizmus obdržel výslednou dávku v dlouhých časových intervalech. Vedle primárních poruch, vyvolaných vlastním ozářením, probíhají v organizmu i sekundární reakce, které mohou dále poškozovat tkáně. Citlivost na ozáření ionizujícím zářením je u různých tkání rozdílná. Účinky záření se projevují nejvýrazněji u buněk, které se intenzívně dělí. Mezi nejcitlivější buňky patří buňky lymfatické tkáně a kostní dřeně, dále pak buňky střevní sliznice. Po ozáření se mění krevní obraz, v rané fázi dochází ke vzestupu počtu bílých krvinek v periferii (v důsledku vyplavení nezralých leukocytu z kostní dřeně), po němž následuje jejich prudký pokles, který je charakteristickým rysem klinického stádia onemocnění (je způsoben depleci prekurzorů ve dřeni). Po ozáření vyššími dávkami se ihned objeví pokles lymfocytů (v důsledku jejich vyšší citlivosti na ozáření a aktivace stresové osy) přetrvávající relativně dlouhou dobu. Rychle také dochází k poklesu počtu trombocytů, později i erytrocytu (jejichž životní doba v cirkulaci je nejdelší, a proto trvá nejdéle, než se projeví „deficit" erytropoezy v periferní cirkulaci). Množství erytrocytu v periferní krvi je totiž dáno vztahem mezi jejich „přítokem" (zde kvantifikovaným pomocí retikulocytů) a jejich odtokem (ozářením použitou dávkou nejsou erytrocyty v periferii postiženy), který můžeme považovat za danou dávkou neovlivnitelný, tj. u potkana 100/56 = 1.79% denně, (průměrná délka života erytrocytu u potkana činí totiž 56 dní). Výsledky by měly potvrdit elementární logickou úvahu, že rychlost produkce (zde indikovaná koncentrací retikulocytů) a koncentrace erytrocytu se po ozáření mění každá jinak, i když přirozeně v zákonité souvislosti. Díky tomu, že u potkana přetrvává tvorba krevních elementů ve slezine i postnatálně, bude se měnit během vývoje nemoci z ozáření i hmotnost a buněčnost sleziny (po prvotní depleci vzroste hmotnost sleziny nad původní úroveň a hemopoeza ve slezině rychle nahrazuje přetrvávající menší deficit hemopoezy v kostní dřeni). Poznámka: Mezi potkanem a člověkem jsou velké rozdíly jak v radiosenzitivitě (tedy citlivosti na ozáření - potkan je mnohem odolnější a je tedy schopen tolerovat vyšší dávky záření), tak i v krevním obraze (u potkana je obrácený poměr v zastoupení počtů neutrofilů/lymfocytů oproti lidem a kratší životní doba erytrocytu v periferii-kolem 56 dnů - závisí na kmeni potkanů). 3. Materiál a metody 31 Hayemův roztok, Bürkerova komůrka, světelný mikroskop, mikropipeta 25 |xL, kyveta tloušťky 1 cm, fotometr s barevným filtrem pro 530 - 550 n (SPECOL), transformační roztok podle Drabkina, Turkův roztok, banička s 475 |il prokainového roztoku (20ti násobné zředění), barvící roztok 1 (Eosin Y + fosfátový pufr pH 6.8), barvící roztok 2 (Azur II + fosfátový pufr pH 6.8), oplachovací roztok (fosfátový pufr pH 7.2). 4. Postup a) Stanovení počtu erytrocytu - melanžérová metoda: Provedení: Do melanžéru pro červené krvinky nasajeme pomocí gumové násavky krev přesně po značku 0.5 (ředění 1:200). Očistíme pečlivě hrot melanžéru od krve a zkontrolujeme výšku sloupce krve. Přitom je nutné, aby byl melanžér ve zcela kolmé poloze. Zcela nepatrně povytáhneme jemným nasátím sloupec krve v melanžéru a kolmo jej vložíme do lahvičky s Hayemovým roztokem. Tento roztok nasajeme s již nasátou krví po značku 101. Potom sejmeme opatrně gumovou násavku, uzavřeme palcem a ukazovákem obě ústí melanžéru a dobře mícháme 2-3 minuty. Po odkápnutí několika kapek z melanžéru vpustíme další kapku krevní suspenze pod krycí sklíčko počítací komůrky, až se kapka rozlije v souvislé vrstvě mezi krycím sklem a spodní plochou komůrky. Cca za 3 minuty počítáme krvinky ve 20 obdélnících: E = Z 20 x 10 000 při ředění 1: 200 (počet/iiL) b) Stanovení množství hemoglobinu - hemiglobinkyanidová metoda: Roztokem ferrikyanidu draselného se hemoglobin oxiduje na hemiglobin (methemoglobin). Ten se pomocí kyanidu draselného přemění na hemiglobinkyanid. Stabilní barevný komplex má hnedočervenou barvu a hodí se k fotometrickému stanovení. Provedení: Do zkumavky se 7 ml transformačního roztoku podle Drabkina přidáme 25 |il krve a po promíchání necháme 10 min stát. Potom měříme extinkci vzorku ve fotometrické kyvetě tloušťky 1 cm oproti Drabkinově roztoku. Současně měříme extinkci standardů o známých koncentracích pro kalibrační přímku. Z této přímky odečteme koncentraci Hb v g/l. c) Stanovení hematokritu - mikrohematokritová hodnota: Centrifugujeme kapiláry délky 75 mm s nasátým krevním sloupcem 3 min. při 100 000 g. Oddělený sloupec erytrocytu se odečítá pomocí odečítacího zařízení (tabulka). Z počtu erytrocytu, množství hemoglobinu v krvi a hematokritu je možno spočítat tzv. indexy červené krvinky podle těchto vztahů: 32 MCV (|0.m3) = Het x 10 / počet ery v miliónech, kde MCV je střední objem erytrocytu v |0,m3 MCH (ng) = Hgb x 10 / počet ery v miliónech , kde MCH je střední korpuskulárni hemoglobin v ng. MCHC (%) = Hgb / Het x 100, kde MCHC je střední korpuskulárni hemoglobinová koncentrace v %. d) Počítání leukocytu - melanžérová metoda: Provedení: Krev odebíráme analogicky jako u červených krvinek příslušným melanžerem, který má dělení 0.5, 1, 11. Krev nasáváme přesně ke značce 0.5 (ředění 1: 20). Pomocí násavky dosajeme ředicí roztok pro bílé krvinky po značku 11. Bílé krvinky počítáme v 50 středních čtvercích: L = Z x 100 při ředění 1: 20 (počet/iil) e) Počítání krevních destiček - dle Piettových: Provedení: Do baničky s prokainovým roztokem napipetujeme 25 |il krve. Zředěná krev se nechá stát alespoň 20 minut, aby nastala hemolýza a aby se trombocyty stabilizovaly a zvýraznily. Poté se krev protřepe a napipetuje do prostoru Burkerovy komůrky. Trombocyty se nechají cca 10 min sedimentovat a potom se počítají při zvětšení 240x, resp. 150x v dobře zacloněném světelném poli. T = Z 20 x 1 000 (počet/iil) f) Příprava periferního nátěru: Kapku krve jsme kápli na podložní sklíčko asi 1 cm od pravého okraje. Druhé sklíčko položíme na toto sklíčko vlevo od kapky krve pod úhlem 30 - 40 °. (Čím je tento úhel ostřejší, tím je nátěr tenčí). Kapku rozetřeme rychlým pohybem ve směru od kapky. Nátěr má být homogenní, rovnoměrný a přiměřeně tenký, což vyžaduje jistý cvik. Dlouhé okraje mají být rovné, na konci nátěru cípaté až do ztracena. Barvení: Nátěry mají před barvením schnout 0.5-4 hodiny. Barví se pomocí soupravy LEUKODIF 200 (LACHEMA Brno). Provedení: • Krevní nátěry se zhotoví obvyklým způsobem na odmaštěná sklíčka a nechají se uschnout volně na vzduchu. • Roztoky 1-4 se nalijí do vhodných nádobek • Nátěr se fixuje tak, že se ponoří 5x na 1 sekundu do fixačního roztoku. Po každém ponoření se nechá roztok stéci a jeho přebytek se odstraní otřením kapky o stěnu nádobky • Fixovaný nátěr se ponoří 3x na 1 s do barvícího roztoku 1. Po každém ponoření se nechá roztok stéci a jeho přebytek se odstraní otřením kapky o stěnu nádobky 33 • Nátěr se ponoří 6x na 1 s do barvícího roztoku 2. Po každém ponoření se nechá roztok stéci a jeho přebytek se odstraní otřením kapky o stěnu nádobky • Sklíčko se opláchne oplachovacím roztokem a nechá se zaschnout volně na vzduchu g) Nátěr na stanovení retikulocytů - nepřímá metoda pomocí brilantkrezylové modři: Provedení: Nátěr zhotovíme obvyklým způsobem na plochu podložního sklíčka s předem nanesenou zaschlou kapkou 1% brilantkrezylové modři. Nabarvené preparáty necháme řádně uschnout před dalším zpracováním. h) Počítání retikulocytů: Provedení: Určuje se počet mladých erytrocytu se zbytky ribonukleové kyseliny v plasmě, tzv. substantia reticulofilamentosa (zbytky RNA se pomocí brilantkrezylové modři obarví tmavě modře, takže retikulocyty můžeme odlišit od zralých erytrocytu). Počítáme s imerzí, při 10-násobném zvětšení objektivu. Určujeme počet retikulocytů připadajících na 1000 erytrocytu a výsledek uvádíme v tisícinách (promile). Z jistého hlediska informatívnejší je vypočítat z této hodnoty a ze zjištěného počtu erytrocytu absolutní počet retikulocytů (přepočet faktorem x 109/1). i) Diferenciální rozpočet bílých krvinek: Provedení: Počet jednotlivých druhů určujeme nejméně na 100, lépe na 200 leukocytu, nátěr přitom prohlížíme meandrovitě, protože rozložení jednotlivých subtypů bílých krvinek není v nátěru stejnoměrné. Počet jednotlivých druhů nakonec vyjádříme procentuálně. Vyšetříme skupinu potkanů kontrolních a 2 skupiny potkanů ozářených (v první budou zvířata ozářená před třemi dny a ve druhé potkani ozáření před 20 dny). Před začátkem experimentu uvedeme zvířata do lehké anestézie (inhalačním podáním Halo tanu), zvážíme je a poté podáme intraperitoneálně (i.p.) Rometar s Narcamonem v dávce 0.5 ml/100 g (roztok získáme smícháním 0.5 ml 2% Rometaru s 10 ml 1% Narcamonu), čímž uvedeme zvířata do celkové anestézie. Torakotomií otevřeme hrudník a odebereme krev ze srdeční komory do 2 ml plastikové stříkačky s jehlou namočenou do heparinu. 34 Obrázek 1: Odběr krve ze srdečních dutin Ihned po skončení odběru odkápneme 2 kapky na 2 podložní sklíčka pro zhotovení krevního nátěru a stanovení retikulocytu (sklíčko pro počítání retikulocytu bude označeno). Zbytek krve vystříkneme do zkumavky s protisrážlivou oxalátovou směsí a jemně promícháme. Po odběru krve zvážíme také vypreparované sleziny, jejichž odběr provádíme ze střední laparotomie. Poté stanovíme počty jednotlivých krevních elementů (erytrocytu, leukocytu a trombocytů), dále množství hemoglobinu, hematokritu a zhotovíme krevní nátěry pro počítání diferenciálního krevního obrazu a stanovení zastoupení retikulocytu výše uvedenými postupy. 5. Výsledky Získaná data budou porovnána vzájemně mezi všemi skupinami (tj. budeme sledovat rozdíly mezi skupinou kontrolních zvířat, potkanů ozářených před 3 dny a před 20 dny), abychom mohli posoudit dynamiku změn parametrů krevního obrazu. Statistické zpracování Mann-Whitney testem bude doplněno korekcí na mnohonásobné srovnání vybranou metodou (Holm, Bonferroni). 6. Závěr Z výsledků praktika vyhodnotíme dosažené změny v krevním obraze a vysvětlíme případné odchylky od předpokládaných výsledků (možné zdroje chyb). 35 10. Ikterus u laboratorního potkana Lukáš Pácal 1. Cíl Cílem praktika je diagnostikovat ikterus a jeho typ. 2. Úvod do problematiky Ikterus (žloutenka) je žluté zabarvení kůže a sliznic způsobené zvýšenou hladinou bilirubinu v séru. Při mírném zvýšení nemusí být žluté zbarvení zřetelné (subikterus). Pro zvýšenou hladinu bilirubinu v séru se používá termín hyperbilirubinémie. Bilirubin je konečný produkt degradace hernu. Při zániku erytrocytu se z nich uvolňuje hemoglobin, z hemové části je hemoxygenázou odstraněno železo a zbytek je přeměněn na bilirubin. Další zpracování bilirubinu se děje výhradně v hepatocytech. Po vstupu do hepatocytu následuje jeho rychlá konjugace s glukuronovou kyselinou proti koncentračnímu gradientu do žluči. Vzniká ve vodě nerozpustný konjugovaný bilirubin. Podle mechanismu vzniku dělíme ikterus do tří skupin: prehepatální, hepatální a posthepatální. Prehepatální ikterus vzniká nadměrnou tvorbou bilirubinu při zvýšeném rozpadu erytrocytu (hemolytické anémie). Hepatocyty nestíhají konjugovat a vyloučit všechen bilirubin, zvyšuje se jeho hladina v séru a jeho ukládání v tkáních způsobuje jejich žluté zbarvení. Hepatální ikterus je způsoben poruchou metabolizmu bilirubinu v játrech (vychytávání, konjugace nebo vylučování z hepatocytu) nebo poškozením až zánikem hepatocytu při jaterních chorobách. Příčinou vzniku posthepatálnflio ikteru je cholestáza (porucha odtoku žluči). 3. Materiál a metody Anestetická směs (1% Narcamon s Rometarem), chirurgické instrumentárium, operační stolek, injekční stříkačky, jehly, nitě, tampony, zkumavky, heparin, reagencie na stanovení bilirubinu v plazmě, proužky na diagnostiku bilirubinu a urobilinogenu v moči. 4. Postup a) Modelování obstrukčnflio ikteru podvazem ductus choledochus Laboratorního potkana zvážíme a uvedeme do celkové anestézie. Hmotnost si zaznamenáme. Potkana fixujeme na operačním stolku a provedeme laparotomii. Pomocí rozvěrače otevřeme dutinu břišní a najdeme játra, žaludek a duodenum, ve spojce jater a duodena je spolu s vénou 36 portae ductus choledochus. Ductus choledochus opatrně oddělíme od vena portae a podvážeme. Operační ránu uzavřeme ve dvou vrstvách. Potkana umístíme do klece na břicho. Nakonec umyjeme a uklidíme operační nástroje. Stejný postup mimo podvazu ductus choledochus provedeme u kontrolních potkanů. Další fáze pokusu následuje za týden. b) Diagnostika ikteru Potkana uvedeme obvyklým způsobem do narkózy. Porovnáme váhu zvířat před a po operaci, sledujeme zabarvení uší, paciček a ocasu a porovnáme s kontrolními zvířaty. Srdeční punkcí odebereme krev do stříkačky propláchnuté heparinem. Krev ze stříkačky (již bez jehly) opatrně vstříkneme do plastové zkumavky určené k centrifugaci. Po 10 minutách centrifugace (3000 otáček za minutu) získáme plazmu, kterou dále analyzujeme. Sledujeme zabarvení plazmy po centrifugaci. Punkcí močového měchýře odebereme moč. Pomocí indikátorových papírků vyšetříme přítomnost bilirubinu a urobilinogenu. 5. Závěr Popíšeme pozorované změny. Porovnáme hladiny bilirubinu v plazmě a v moči mezi pokusnými a kontrolními zvířaty. 37 11. Model venózní trombózy u laboratorního potkana Dana Bůčková 1. Cíl Porovnat hmotnost trombu vytvořeného ve venózním řečišti v nepřítomnosti a v přítomnosti heparinu a srovnat naměřené hodnoty koagulačních testů v obou skupinách pokusných zvířat. 2. Úvod do problematiky Trombózou rozumíme vytváření krevních sraženin uvnitř cirkulačního systému. Ke vzniku tohoto stavu vede poškození cévní stěny (zánětem, aterosklerózou), vyšší srážlivost krve (při poruše antikoagulačních faktorů nebo uvolněním koagulačních faktorů z poškozené tkáně) a snížená rychlost průtoku krve (např. u ležících pacientů). K těmto mechanismům přispívá i zvýšená viskozita krve (u polycytémie, dehydratace apod.). Mezi přirozené antikoagulační faktory patří specifický endotelový protein trombomodulin a plazmatické proteiny jaternflio původu (protein C, protein S a antitrombin III). Heparin (ať už tělu vlastní nebo dodávaný za léčebným účinkem) snižuje srážení krve aktivací antitrombinu III. 3. Materiál a metody anestetická směs (20 dílů 1% Narkamonu a 1 díl 2% Rometaru, 2 ml hypotonického roztoku (25 % roztok fyziologického roztoku), roztok heparinu v Michaelisově pufru, injekční jehly a stříkačky (1 stříkačka na 2 ml s obsahem 0,2 ml natrium citricum), chirurgické instrumentárium, preparační stolek, vlhká komůrka (Petriho miska s filtračním papírem, namočeným ve fyziologickém roztoku), tampony, papírová vata, gáza, SEVATEST aPTT Test, koagulometr KC 4A a příslušenství, centrifuga, zkumavky, automatická pipeta 100 ul, trombinové reagens 4. Postup Model venózní trombózy u laboratorního potkana dle Hladovce (1986) umožňuje kvalifikovat i kvantifikovat tvorbu trombu ve venózním řečišti, která se dá standardně vyvolat společným působením dvou základních patogenetických mechanismů poškozujících cévní endotel -působením hypotonického roztoku a stagnací krve ve venózním řečišti. Hmotnost trombu je možno modifikovat aplikací heparinu. Aktuální situaci v koagulaci je možno monitorovat pomocí koagulačních testů, např. aPTT (aktivovaný parciální tromboplastinový čas) a TT (trombinový čas), nebo stanovením koncentrace fibrinogenu. Anestézie Laboratorní potkany po úvodní inhalační anestézii uvedeme do celkové narkózy podáním směsi 20 dílů 1% NARKAMONU a 1 dílu 2% ROMETARU i.p. v množství 0,5ml/100g váhy. 38 Operační výkon Experimentální zvířata (laboratorní potkani 180-220 g) rozdělíme na dvě skupiny: • 1. skupina: experimentální venózní trombóza bez antiko agulační terapie • 2. skupina: experimentální venózní trombóza s antikoagulační terapií Zvířatům podáme do vena jugularis 2 ml hypo tonického roztoku (25% roztok fyziologického roztoku). Ve skupině s antikoagulační terapií přidáme do tohoto roztoku ještě vypočtené množství heparinu tak, aby zvíře dostalo antikoagulační dávku 4 U/kg. Zvíře fixujeme na operačním stolku v poloze na hřbetě. Nůžkami rozstrihneme kraniokaudálně kůži cca lem laterálně od manubrium sterni tak, aby byla viditelná v. jugularis externa v místě, kde se zanořuje pod m. pectoralis. Cévu nepreparujeme! Jehlu zavedeme kraniálně přes m. pectoralis do v. jugularis tak, aby hrot jehly při jejím mírném zvednutí lehce prosvítal tenkou stěnou žíly. Do vény velmi pomalu aplikujeme fyziologický roztok (bez nebo s heparinem, podle skupiny). Operační ránu uzavřeme v jedné vrstvě několika stehy. Ze střední laparotomie pomocí očního rozvěrače otevřeme dutinu břišní a tupou preparací opatrně uvolníme cévní svazek abdominální aorty a vena cava inf. tak, aby bylo pod uvolněný cca 2 cm dlouhý segment možno naložit dvě ligatury (horní ligatura pod levou renální vénou, dolní cca 2 cm pod horní). Obě ligatury zatáhneme. Po uplynutí 10 min rozstrihneme hrudník ve stření čáře a provedeme intrakardiální odběr krve do stříkačky s připraveným citrátem (1:9). Dobře promíchanou krev ze stříkačky opatrně stříkneme do plastikové zkumavky pro centrifugaci. Po 10 min centrifugace (3000 ot) získáme plasmu, kterou dále analyzujeme. Po odběru krve ze srdce (zvíře uhyne) vystřihneme cévní segment z dutiny břišní a umístíme ho do vlhké komůrky. Segment zvážíme nejprve celý, pak jej rozstrihneme, opláchneme fyziologickým roztokem, vysušíme a znovu zvážíme. Z rozdílu obou hmotností vypočítáme hmotnost trombu (tímto postupem se do jisté míry relativizuje rozdíl v délkách segmentů izolovaných na jednotlivých pracovištích). Laboratorní část a) aPTT (aktivovaný parciální tromboplastinový čas) Do 0,1 ml plasmy přidáme 0,1 ml kefalinkaolinového reagens a stejné množství 0,025 mol/l CaC12. Kefalinová složka reagens aktivuje XII. Hagemannův faktor vnitřní koagulační kaskády. Kaolinová zrna standardně imitují membrány krevních destiček, které byly od plasmy odděleny centrifugaci. Koagulační faktory obsažené ve vzorku plasmy po aktivaci kefalinkaolinovým reagens a po přidání 0,025 mol/l CaC12 začnou srážet fibrinogen v plasmě na fibrin. Dobu srážení (s) registruje koagulometr jako aPTT. b) Trombinový čas (TT) Přidání standardního množství trombinu k plasmě způsobí přeměnu fibrinogenu na fibrin v určitém čase, jehož délka závisí na množství a kvalitě fibrinogenu a na přítomnosti případných inhibitorů krevního srážení. 39 Do 0,2 ml vyšetřované plasmy přidáme 0,2 ml trombinového reagens. Koagulometr měří čas, za kterou se suspenze srazí. Prodloužený TT je při snížené hladině fibrinogenu, dysfibrinogenémii, v přítomnosti heparinu a při získaných poruchách koagulace (DIC). c) Stanovení fibrinogenu dle Clausse Po přidání vysoce koncentrovaného trombinu ke zředěné plasmě (zředění eliminuje vliv inhibitorů koagulace) je doba koagulace přímo úměrná koncentraci fibrinogenu. K 0,2 ml vyšetřované plasmy ředěné 1:9 fyziologickým roztokem přidáme 0,2 ml trombinového reagens. Koagulometr změří čas srážení. Z kalibrační křivky pak přímo odečteme koncentraci fibrinogenu v plasmě v g/l. Zvýšené hodnoty bývají u zánětlivých a neoplastických onemocnění a u akutních interních stavů. Snížené hodnoty nacházíme u hypofibrinogenémie, DIC, při fibrinolytické léčbě, při těžkých poruchách jaterního parenchymu. 5. Výsledky bez heparinu s heparinem m trombu [mg] aPTT [s] TT[s] Fgen [g/l] m trombu [mg] aPTT [s] TT[s] Fgen [g/l] 1. 1. 2. 2. 3. 3. 4. 4. 5. 5. 6. 6. Výsledky zapsané do tabulky srovnáme pomocí neparametrického nepárového Wilcoxonova testu. 9. Závěr Zhodnotíme výsledky experimentu na základě provedené statistické analýzy. 40 12. Experimentálně navozený diabetes mellitus u pokusného zvířete - diagnostický průkaz glukózovým tolerančním testem Kateřina Kaňková 1. Cíl Provedení glukózového tolerančního testu k průkazu porušené schopnosti regulace glykémie, popř. manifestnflio diabetů u pokusného zvířete s experimentálně vyvolaným diabetem. Seznámení se s možnostmi diagnostiky diabetů mellitu a hodnocením nálezů. 2. Úvod do problematiky Diabetes mellitus (DM) je syndrom charakterizovaný deficiencí účinku inzulínu. Z hlediska příčin deficitu inzulínu rozeznáváme dva základní typy onemocnění: (1) DM typu I - porucha vzniká v důsledku absolutního nedostatku inzulínu při autoimunitní destrukci ß buněk Langerhansových ostrůvků pankreatu a (2) DM typu II - relativní deficience vzniká v důsledku inzulínové rezistence v periferních tkáních normálně citlivých na inzulín (kosterní sval, tuková tkáň, játra). Při manifestním diabetů je možno zjistit hyperglykemii již nalačno (<6.7mmol/l v žilní nebo kapilární krvi po osmihodinovém lačnění). Její opakovaný průkaz stačí ke stanovení diagnózy diabetů. Kromě manifestního diabetů ovšem existuje i tzv. porušená glukózová tolerance (PGT), kdy je glykémie nalačno normální, ale po zátěži glukózou dlouho přetrvává hyperglykémie a její maximální hodnota je vyšší než norma ( 0 4mm (obr. 1), 0.5% Evansova modř, fixace dle Bouina, alkohol, xylen, parafin, mikrotom, hematoxylin-eosin, protilátky (anti-vWf aj.). 44 Obrázek 1. Schematicky Fogartyho arteriální embolektomický katetr. 4. Postup a) Experimentální navození aterosklerózy Zvíře uvedeme do anestézie (inhalační úvod, anestetická směs 0.5ml/100g i.p.) a fixujeme na operačním stolku v hřbetní poloze. Nůžkami provedeme opatrně incizi kůže na krku poněkud laterálně od stř. čáry. Zpřístupníme operační pole v místě, kde se z a. carotis communis rozdělují a. externa carotis interna a externa (viz obr. 2). Podvážeme a. carotis ext., zavedeme Fogartyho katetr a provedeme denudaci endotelu nafouknutým balónkovým katetrem (postup detailně viz obr. 3). Poté podvážeme a. carotis externa pod místem vpichu. U kontrolních zvířat postupujeme stejným způsobem ovšem bez nafouknutí balónku. Operační ránu uzavřeme v jedné vrstvě několika jednotlivými stehy. Zvířeti v mezidobí poskytneme náležitou pooperační péči a nutrici. 45 a, carotis interna a. carotis externa 0, a. carotis communis Obrázek 2. Schéma operačního přístupu a topografie tepen krku. A a. carotis externa a. carotis communis a. carotis interna Obrázek 3. Praktické provedení úvodní části experimentu. A - podvaz a. carotis externa, B - zavedení Fogartyho katétru, C - zavedení katétru do a. carotis communis, inflace balónku a deendotelizace zpětným tahem, D - uzavření místa punkce podvazem a. carotis ext. b) Euthanasie a zhotovení preparátů cév Zvířata budou utracena v časových intervalech 3, 14 a 28 dní po provedení denudace endotelu. U poloviny zvířat v každé skupině (nativní preparáty) aplikujeme 1 hodinu před euthanasií Ewansovu modř i.v. do ocasní žíly (lmg/kg). Před euthanasií provedeme pro účely fixace preparátů cév tlakovou perfúzi (proplach fyziol. roztokem a násl. fixace Bouinovou tekutinou po dobu 16-ti hodin). Poté vystřihneme cévy, odvodníme, zalijeme do parafinu a krájíme mikrotomem řezy tloušťky ~4um. Barvíme přehledně hematoxylin-eosinem a speciálními protilátkami - anti-von Willebrandův faktor (endotel), anti-elastin (tunica media). c) Hodnocení histologických preparátů cév Obarvené preparáty prohlížíme ve světelném (H-E, elastin) a fluorescenčním (anti-vWf/DAB/fluorescein) mikroskopu a hodnotíme následující parametry: (i) tloušťku intimy a médie (mm), (ii) průměr lumen, (iii) plochu lumen (mm2) na příčných řezech cévou a (iv) délku defektu endotelu (mm) na podélných řezech cévou. Schematické znázornění sledovaných parametrů ukazuje obr. 4. 47 kontrola B tlouška intimy + medie N plocha lumen tlouška intimy + medíe průměr lumen délka defektu endotelizace Obrázek 4. Hodnocení sledovaných parametrů na histologických preparátech cév. A - parametry hodnocené na příčných řezech cévou (hematoxylin-eosin), B - podélný řez cévou (technika "roláda") ukazující (ne)kompletní reendotelizaci (Evansova modř, anti-vWf). 5. Výsledky U jednotlivých naměřených hodnot (viz tab. 1) spočítáme deskriptivní statistiku (průměry a směrodatné odchylky) a graficky znázorníme (sloupcové, popř. krabicové grafy). Statisticky zhodnotíme významnost rozdílu hodnot v intervalech 3, 14 a 28 dní mezi skupinami kontrolních a pokusných zvířat skupiny 1 a mezi pokusnými zvířaty skupin 1, 2 a 3 (neparametrické nepárové testy). kontrola pokusná 1 (normo TK/CH) pokusná 2 (Ttk) pokusná 3 (TCH) dny tloušťka intimy + medie (mm) 3 14 28 0 lumen (mm) 3 14 28 plocha lumen 3 48 (mm2) 14 28 délka defektu endotelu (mm) 3 14 28 6. Závěr Komentář a interpretace výsledků - došlo v důsledku denudace endotelu k nastartování atero sklerotického procesu? Jak byla progrese aterosklerózy ovlivněna působením dalších kardiovaskulárních rizikových faktorů (hypertenze a hyperlipidemie)? Jakým způsobem se endotel za fyziologických okolností podílí na udržení normálních morfologických a funkčních poměrů v cévě? 49 14. EKG a arytmie na zvířecím modelu - změny EKG při adrenergní stimulaci, hypokalcemii a hyperkalemii Kateřina Kaňková 1. Cíl Popsat a vysvětlit příčinu změn EKG při adrenergní stimulaci, hypokalcemii a hyperkalemii, experimentálně vyvolané podáním adrenalinu, blokátorů Ca-kanálů (verapamil) a KCl, jako modelových situací a potencionálně život ohrožujících patofyziologických stavů v humánní medicíně. 2. Úvod do problematiky Autonomní nervový systém (sympatický prostřednictvím ßl adrenergních receptoru a parasympatický prostřednictvím M2 cholinergních receptoru) moduluje především rychlost geneze akčního potenciálu v pacemakerových buňkách SA uzlu (chronotropní efekt) a vedení AV junkcí (dromotropní efekt). Adrenergní stimulace má rovněž vliv na kontraktilitu myokardu (inotropní efekt). Bilance vápníku v organizmu je udržována jeho přiměřenou resorpcí z potravy ve střevě (nabídka, vitamin D), regulovanou exkrecí v ledvině (parathormon) a rovnováhou mezi resorpcí a novotvorbou kosti (parathormon, kalcitonin). Celková plazmatická hladina Ca (2.2 - 2.7 mmol/1) je zhruba z poloviny tvořena ionizovaným, a tedy fyziologicky relevantním, vápníkem; zbytek je vázán na bílkoviny (zejm. albumin) a komplexy s bikarbonátem, fosfátem aj. Ionizace kalcia je ovlivněna pH. Velký vliv na plazmatickou [Ca2+] mají fosfáty, součin koncentrace kalcia a fosfátů je zhruba konstantní. Pokles hladiny ionizovaného Ca vede ke zvýšení nervosvalové dráždivosti. Hypokalcémie prodlužuje repolarizaci, hyperkalcémie ji naopak zrychluje. Mimo to má kalcium pozitivní inotropní účinek. Bilance draslíku v organizmu (3.8 - 5.5 mmol/1 v ECT) je určena jeho příjmem potravou a exkrecí ledvinami. Na regulaci exkrece ledvinami se podílejí kromě samotné plazmatické hladiny kalia hormony aldosteron, inzulin a adrenalin. Při zachovalé funkci ledvin nedojde ani při značně zvýšeném příjmu kalia potravou k jeho retenci a hyperkalemii. Závažná hyperkalémie (>7 mmol/1) se rozvíjí zpravidla v oligoanurické fázi akutního renálnflio selhání a při chronickém selhání ledvin, pokud není snížen jeho příjem potravou; k snížení exkrece draslíku dále dochází při hypokortikalismu (např. m. Addison) a při predávkovaní diuretiky šetřícími K. Nejvýznamnějším projevem hyperkalémie jsou změny převodu v myokardu, které mohou vyústit v srdeční zástavu. 50 Obrázek 1. Součásti EKG křivky - záznam jednoho elektrického srdečního cyklu. 3. Materiál Monitory EKG, zařízení pro záznam EKG, operační stolek pro potkana, skleněné akvárium (inhalační narkóza), narkotikum (směs 1% Narkamon + 2% Rometar, 20:1), kanyly, stříkačky, roztoky: adrenalin lmg/ml (Epinefrin Léčiva inj., lmg/ml), verapamil 20mg/ml (Isoptin Abbot, 40mg/tbL), KCl 12.5% (Kalium chloratum, piv.). 4. Postup Zvíře uvedeme do celkové anestézie. Po úvodní inhalační narkóze aplikujeme směs Narkamon + Rometar v dávce 0.5 mg/100 g hmotnosti zvířete i.p. Potkana fixujeme na operační stolek, umístíme končetinové EKG svody (jehly jednotlivých končetinových elektrod zavedeme podkožně) a natočíme klidový záznam EKG. Zavedeme intraperitoneální kanylu (periumiblikálně). Do stříkačky natáhneme 2ml roztoku látky pro konkrétní model (adrenalin, verapamil nebo KCl) a pomalu podáme 0.5ml do kanyly i.p. Sledujeme rozvoj EKG změn. Za kontinuálního sledování EKG takto frakcionovaně (po 0.5ml/každých 5-7min) podáme celý objem roztoku (tj. 2ml). 5. Výsledky Popis výchozí fyziologické EKG křivky, popis časových změn u jednotlivých modelů při kumulativní expozici účinnou látkou. 6. Závěr Vysvětlení patofyziologického mechanizmu elektrofyziologických změn při nadměrné adrenergní 51 stimulaci, hypokalcémii a hyperkalémii. 52 15. Model peritoneální dialýzy na laboratorním potkanovi Julie Bienertová Vašků 1. Cíl Demonstrovat využití difúzních vlastností peritonea pro ovlivnění hodnot draslíku v organismu. Demonstrovat účinnost peritonea při terapeutickém ovlivňování hyperkalémie při akutním renálním selhání (ARS). 2. Úvod do problematiky Při peritoneální dialýze se užívají obdobné principy (difúze a filtrace) jako při dialýze klasické, dialyzační membránou je přitom peritoneum, jehož plocha se rovná přibližně ploše tělesného povrchu, průtok krve činí zhruba 70 ml/min. Velkou výhodou peritoneální dialýzy je vyšší kvalita života pacienta a absence krevních ztrát, nebezpečím je zejména zvýšené riziko peritonitidy. Úkolem je sledování EKG změn po podání dialyzačnflio roztoku o různé koncentraci K+ u laboratorního potkana, jehož ledviny jsou nefunkční (v důsledku působení toxické noxy) a u nějž se tedy v důsledku ARS rozvíjí hyperkalémie. 3. Materiál a metody Anestetická směs (1% Narcamon s Rometarem), injekční stříkačky, inj. jehly, kanyla (pro periferní žílu člověka),nitě, 2 pinzety, preparační stolek, chirurgické instrumentárium, tampony, papírová vata, gáza, EKG monitor se svody, roztok pro peritoneální dialýzu, 7,5% roztok KCl, roztok 0,1M HCl, bromfenolová červeň (indikátor pH 5.0 - 6.8), kapilára na stanovení Astrupova vyšetření 4. Postup Cílem je u experimentálního zvířete navodit toxickým poškozením akutní renální selhání s manifestní hyperkalémií a sledovat efekt peritoneální dialýzy na rozvoj této hyperkalémie Laboratorního potkana uvedeme do celkové anestézie obvyklým způsobem pomocí diethyletheru, intraperitoneálně 1% Narcamonu a Rometaru (0,5ml/100g). Nejdříve provedeme odběr krve z ocasní žíly na stanovení normálních hodnot acidobasické rovnováhy. Po provedení kožního řezu aplikují studenti pracující s kontrolní skupinou zvířat přes musculus 53 pectoralis do v. jugularis fyziologický roztok a studenti pracující s experimentální skupinou roztok ethylenglykolu v množství 0,15ml/100 g tělesné hmotnosti. Po 15 min asi v polovině vzdálenosti mezi spina iliaca anterior a pupkem zavedeme kanylu s jehlou, po proniknutí břišní stěnou jehlu odstraníme a kanylu zasuneme ještě asi o 1 cm hlouběji do dutiny břišní a zafixujeme leukoplastí.. Z roztoku pro peritoneální dialýzu a roztoku KCl připravíme roztoky o koncentraci 0, 4 a 10 mmol/1. Potkany připojíme k EKG a provedeme výchozí záznam před aplikací dialyzačního roztoku. Posluchači změří pravítkem na EKG 10 komplexů QRS a spočítají průměrnou hodnotu v mm. Kontrolní skupina provede dialýzu s roztokem o koncentraci 4 mmol/1, další 2 skupiny s koncentracemi 0 a 10 mmol/1 (celkové množství roztoku vpraveného do dutiny břišní je až 30 ml). Studenti budou kontinuálně sledovat EKG a po nástupu změn provedou zápis EKG křivek. U jednotlivých EKG změn bude zaznamenán čas od podání dialyzačního roztoku do vzniku příslušných změn, které studenti popíší. Po zachycení nesporných známek hyper- nebo hypokalemic na EKG se provede odběr venózní krve z ocasní žíly na stanovení parametrů ABR. Nakonec studenti po otevření hrudníku provedou intrakardiální odběr 1,5 ml srážlivé krve. Otevřením hrudníku a punkcí srdce zvíře uhyne. Krev zcentrifugujeme (10 min při 3000 ot/min), stáhneme plasmu a provedeme acidimetrické stanovení alkalické rezervy. Ke vzorku 500 |il plasmy přidáme 10 |0,1 indikátoru (bromfenolová červeň) a titrujeme 0,1M HCl po 1,0 (xl. Zaznamenáme spotřebu HCl a orientačně porovnáme alkalickou reservu. 5. Závěr Vysvětlit pato fyziologický mechanismus hyperkalémie při ARS, statistické zhodnocení výsledků (formulace nulové a alternativní hypotézy, výběr vhodného statistického testu) 54 16. Stanovení kinetiky vylučování inulinu ledvinami Michal Jurajda 1. Cíl Vysvětlit princip stanovení glomerulární filtrační rychlosti (GFR) pomoci stanovení ledvinné clearance inulinu. Demonstrovat na zvířecím modelu změny GFR při snížení počtu funkčních glomerulů podvazem jedné renální arterie. 2. Úvod do problematiky Glomerulární filtrační rychlost udává množství glomerulárního ultrafiltrátu (primární moče) vyprodukovaného za jednotku času. Pokles GFR je významným ukazatelem poškození funkce ledvin - ledvinného selhání. Stanovení clearence inulinu umožňuje určit GFR při nemožnosti kvantitativního sběru moče vyšetřovaného subjektu. 3. Materiál a metody Inulin, spektrofotometr, kyvety, operační instrumentárium, anestetická směs (1% Narcamon s Rometarem), roztok polyfruktosanu (25mg/l,5ml fyziologického roztoku), 75 mmol/1 roztok kyseliny beta-indolyloctové v methanolu, koncentrovaná kyselina chlorovodíková, 0,5 % roztok Tritonu X-100, spektrofotometr, centrifuga, pipety, injekční stříkačky, inj. jehly, nitě, 2 pinzety, preparační stolek, tampony, papírová vata, gáza. 4. Postup Laboratorního potkana uvedeme do celkové anestézie obvyklým způsobem pomocí diethyletheru,poté podáme intraperitoneálně směs 1 % Narcamonu a Rometaru (0,5ml/100g). Provedeme střední laparotomii v linea alba, isolujeme v. cava inferior a podvlečeme ligaturu pod arteria renalis sinistra. Studenti pracující s kontrolní skupinou potkanů nechají ligaturu nezataženou, studenti pracující s experimentální skupinou zaváží ligaturu, a tím zruší přítok krve do levé ledviny. Dále provedeme chirurgické zpřístupnění v. jugularis, kam aplikujeme polyfruktosan (PFS 25mg/1.5ml fyziologického roztoku). V předem stanoveném intervalu (po 5, 10, 15 a 30 min) otevřeme hrudník a intrakardiálně odebereme 1,5 ml srážlivé krve. Otevřením hrudníku a punkcí srdce zvíře uhyne. Krev zcentrifugujeme (lOmin při 3000ot/min). Do zkumavek pipetujeme 50 ml roztoku indoloctové kyseliny (75mmol/l), 1,5 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a 50 ml biologického materiálu (séra). Promícháme, inkubujeme při 60°C 10 min a pak přidáme 50 ul Tritonu X-100 (0, 5 %). Po ochlazení měříme v kyvetě při 520 nm, absorbanci testu odečítáme 55 proti kompenzaci testu. Výpočet koncentrace PFS ve vzorku se provede běžným způsobem ze změřených absorbancí testu, standardu a známé koncentrace standardu. Protože známe křivku závislosti koncentrace standardně zředěného inulinu na absorbanci, je možné odečíst koncentraci vzorku i z grafu. Pokles plazmatických koncentrací probíhá v exponenciální závislosti na čase, takže naneseme-li jednotlivé body na semilogaritmický papír, dostáváme přímku. 5. Výsledky Stručný návod k hodnocení daného praktika - poznámky ke statistice. 6. Závěr Několik poznámek k možné interpretaci výsledků, např. očekávaný nárůst hodnot je... možné zdroje chyb při měření, atd. 56 17. Renální ischémie, vznik reninu v ledvině Julie Bienertová-Vašků 1. Cíl Ischemizace ledviny u laboratorního potkana, zhodnocení makroskopických změn a mikroskopické sledování granul reninu v ischemizované a neischemizované ledvině. 2. Úvod do problematiky Omezení perfúze parenchymu ledvin je spojeno s aktivací systému renin- angiotenzin- aldosteron (RAAS). V důsledku protrahované těžké ischémie se snížením nutričního průtoku (a velmi často s morfologickými změnami) vzniká ischemické akutní renální selhání. Na vzniku ischemického ARS se podílejí čtyři hlavní mechanismy: 1. pokles průtoku krve, zejména kůrou ledviny 2. snížení permeability glomerulární kapilární stěny 3. reflux filtrátu z tubulů do intersticia ledvin 4. tubulární obstrukce Dlouhodobá ischémie endotelu vrenálních cévách snižuje produkci vazodilatačních působků (NO, prostacyclin) a stimuluje uvolnění vazokonstrikčních látek typu endotelinu. Poškození buněk tubulů a ztráta resorpční schopnosti vede k nadměrnému přísunu solutů do oblasti macula densa distálnflio tubulu s aktivací tubuloglomerulární zpětné vazby a konstrikcí aferentních arteriol ústící v pokles glomerulární filtrace. 3. Materiál a metody Anestetická směs (1% Narcamon s Rometarem), injekční stříkačky, inj. jehly, kanyla (pro periferní žílu člověka),nitě, 2 pinzety, preparační stolek, chirurgické instrumentárium, tampony, papírová vata, gáza, EKG monitor se svody, váhy, preparáty, mikroskop. 4. Postup Levá a. renalis odstupuje z aorty distálněji než pravá. Proto je experiment modifikován tak, že stenosa se provádí na aortě mezi odstupem obou renálních tepen. Při provádění stenosy aorty musíme dbát na přítomnost odstupující a. mesenterica a podvaz volit tak, aby byl umístěn mezi a renalis sin. a a. mesenterica. Pravá ledvina je intaktní. Tato ledvina hypertrofuje, zatímco hypoperfundovaná levá ledvina se zmenšuje. Laboratorní potkan po výkonu přežívá cca jeden měsíc. 57 Laboratorního potkana uvedeme do celkové anestézie obvyklým způsobem pomocí diethyletheru, intraperitoneálně 1% Narcamonu a Rometaru (0,5ml/100g). Potkana upevníme v poloze na zádech na pracovní stolek a provedeme laparotomii ve střední rovině od processus xiphoideus po symfýzu. Rozevřeme operační ránu a jemnou tupou pinzetou odpreparujeme v. cava inf. od aorty v místě mezi oběma aa. renales. Peánem provedeme tupou preparaci abdominální aorty a opatrně protáhneme pod aortou šicí vlákno. Na aortu jemně přiložíme připravenou otupělou jehlu o průměru 0.5 mm, paralelně s osou cévy a naložíme několika uzly ligaturu aorty s jehlou. Jehlu odstraníme. Dutinu břišní po vrstvách zavřeme (sval- pokračovací steh, kůže- jednotlivé stehy). Po třech týdnech provedeme oboustrannou nefrektomii. Očistíme obě ledviny, společně s myokardem zvážíme a zapíšeme do protokolu. Následuje histologická analýza přítomnosti epiteloidních buněk v ledvině u potkana kontrolního a experimentálního a histochemický průkaz zvýšené produkce reninu v ischemizované ledvině. Proximal tubule Capillary loops Glomerular epithelium Capsular basal amina Red blood cells Glomerular "| basal lamina Capsular thelium Juxtaglomerular e rve fibers Afferent arteriole Distal tubule Smooth muscle cells Obrázek 1: Detail juxtaglomerulárního aparátu ledvin 58 5. Závěr Vysvětlit patofyziologický mechanismus hypertenze při ischemickém akutním renálním selhání, statistické zhodnocení výsledků (formulace nulové a alternativní hypotézy, výběr vhodného statistického testu pro porovnání váhy ischemizované a neischemizované ledviny u pokusného zvířete). Stručný popis Goldblattova pokusu dvou a jedné ledviny. 59