25. Enzymové a jiné markery využívané v diagnostice vybraných patologických stavů Lukáš Pácal 1. Cíl Srovnání elektoforeogramů izoenzymů laktátdehydrogenázy separovaných v agarózovém gelu ze vzorků normálních a patologických sér. 2. Úvod do problematiky Laktátdehydrogenáza (LD, EC 1.1.1.27) je cytoplazmatický ubikvitární enzym. Katalyzuje reverzibilní přeměnu laktátu na pyruvát (poslední krok anaerobní glykolýzy). V organizmu jsou přítomny dva typy polypeptidových řetězců označovaných jako H (heart) a M (muscle). Každá molekula enzymu je tetramer tvořený jedním nebo oběma typy podjednotek. Různými kombinacemi těchto podjednotek vzniká pět izoenzymů (enzymy, které mají stejnou funkci, ale liší se strukturou; primární izoenzymy vznikají v důsledku rozdílů ve struktuře dvou a více genů, v případě sekundárních izoenzymů je odlišnost způsobena posttranslační modifikací; izoenzymy se liší svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi, např. elektroforetickou pohyblivostí): LD1 (H4), LD2 (H3M), LD3 (H2M2), LD4 (HM3) a LD5 (M4). Podjednotky M převládají v izoenzymech LD4 a LD5 vyskytujících se hlavně v tkáních s převahou anaerobního metabolizmu (kosterní svalstvo, játra) kde katalyzují přeměnu pyruvátu na laktát. Izoenzymy s převahou podjednotek H (LD1 a LD2) katalyzují přeměnu laktátu na pyruvát ve tkáních s aerobním metabolizmem (myokard, mozek, ledviny, erytrocyty). laktát + NAD+ -> pyruvát + NADH + H+, redukovaný NADH + H+ lze dokázat následující reakcí s tetrazoliovou solí NADH + H+ + tetrazoliová sůl (NBT) -► NAD+ + formazan Zvýšené hodnoty LD v plazmě nacházíme u: 1) poškození myokardu • vzestup izoenzymů LD1 a LD2, např. při akutním infarktu myokardu (LD1/ LD2 větší než jedna, u zdravých osob je poměr menší než jedna) 2) poškození jater • elevace izoenzymů LD4 a LD5, např. akutní virová hepatitída, cirhóza, otrava organickými rozpouštědly 3) krevních chorob 85 • hemolytické a megaloblastické anémie Izoenzymy se liší nábojem, a proto se dají elektoforeticky rozdělit. Izoenzym LDl se pohybuje nejrychleji směrem k anodě, LD5 naopak ke katodě. Při následné inkubaci v roztoku obsahujícím substrát enzymu (laktát) a barvivo lze vizualizovat jednotlivé izoenzymy, které reagují se substrátem za vzniku NADH a H+, který redukuje bezbarvý indikátor NBT na barevný formazan. Intenzita zabarvení je přímo úměrná množství jednotlivých izoenzymů. 3. Materiál Skleněná podložní sklíčka (7,6 x 2,6 cm), elektroforetická vana, el. zdroj, termostat, automatická pipeta a špičky, vzorky séra. Roztoky: Barbitalový pufr: Barbitalum solubile 10,3 g Kyselina dietylbarbiturová 1,84 g Aqua destillata ad 1000 ml Barvící roztok: Lithiumlaktát (substrát pro enzym) Koenzym NAD+ Oxidované barvivo tetrazoliová modř (NBT) Přenašeč elektronů mezi NADH a barvivem (fenazinmethosulfát) Pufr o pH 8,6 a aktivující ionty 4. Postup Na očištěná skleněná podložní mikroskopická sklíčka nalijeme na nivelizačním stolku 1 % agarózový roztok a necháme ztuhnout. Na sklíčka nanášíme analyzované vzorky séra (10 |il) pomocí hrany filtračního papíru a necháme 15 minut difundovat do agarózy. Na každé sklíčko nanášíme 2 vzorky. Po 15 minutách povrch gelu opláchneme destilovanou vodou a vložíme do elektroforetické aparatury. Sklíčka s gelem spojíme s barbitalovým pufrem pomocí proužků filtračního papíru, uzavřeme aparaturu, spojíme se zdrojem a dělíme za následujících podmínek : U = 200 V, I = cca 32 mA, t = 55 min, T = 10°C. Po ukončení elektroforetického dělení vložíme sklíčka agarózovou vrstvou dolů do Petriho misek (3 sklíčka/misku) a opatrně podlijeme inkubačním roztokem. Barvíme 45 min při 37°C. Po obarvení vložíme na 30 min do vypírací lázně a poté vysušíme. 86 Obarvená a vysušená sklíčka naskenujeme a analyzujeme pomocí softwaru TotalLab. 5. Závěr Počítačově zpracované výsledky elektroforetické separace zaznamenáme do protokolu. Popíšeme rozdíly mezi spektrem izoenzymu LD z normálního a patologického séra a interpretujeme je. 87 26. Hyperlipoproteinemie Julie Bienertová Vašků 1. Cíl Prokázat přítomnost/nepřítomnost mutace R395W v genu pro LDL receptor u pokusného subjektu a srovnání výsledku se zdravým kontrolním subjektem a pacientem s familiární hypercholesterolémií. 2. Úvod do problematiky Primární dyslipidémie jsou vrozené poruchy metabolismu spojené jak s alterovanou hladinou lipoproteinů v plazmě, jejich neobvyklou distribucí a/nebo tvorbou aberantních Hpoproteinových molekul. Poruchy mohou obecně postihovat alfa-lipoproteiny (např. Tangierská choroba, deficit LCAT, deficit Apo A-1, porucha jaterní triacylglycerolové lipázy) nebo beta-lipoproteiny, kde je pak možné dílčí třídění na: 1. poruchy syntézy a sekrece betalipoproteinů 2. výskyt anomálnflio apoproteinu B 3. poruchy v přeměně betalipoproteinů 4. běžná polygenně determinovaná hypercholesterolémie Mezi nejčastější poruchy metabolismu betalipoproteinů patří 1. vrozené defekty apoB - předpokládá se u velkého procenta pacientů se šlachovými xantomy, kde se dříve myslelo na poruchu LDL receptoru 2. hypobetalipoproteinémie spojená s modifikovanými apo B - abnormální molekuly Apo B (B-25, B-28, B-37, B-39, B-40, B-46) vedou k nižší stabilitě plazmatických lipoproteinů a nižší plazmatické hladině lipidů 3. familiární hypercholesterolémie - nejčastější primární dyslipidémie, heterozygotní forma má frekvenci cca 1/500, homozygotní forma je mnohem vzácnější - má frekvenci cca 1/106; na pokladě poruchy LDL receptoru dochází ke zvýšené produkci LDL, jejich prodloužené cirkulaci a sníženému vychytávání. To vede u heterozygotů ke 2-3x zvýšené plazmatické hladině LDL cholesterolu oproti zdravým, ICHS se u nich rozvíjí během třetího až čtvrtého decenia. U homozygotů jsou hladiny LDL cholesterolu 6-8 vyšší oproti normě a neléčení pacienti většinou umírají na infarkt myokardu před 20 rokem věku. Podkladem onemocnění jsou mutace v LDL receptoru. 4. polygenní hypercholesterolémie - velmi časté civilizační onemocnění, na geneticky predisponovaném terénu dochází sumací určitých environmentálních vlivů (faktory vnějšího prostředí, zejména faktory životního stylu) k hypercholesterolémii. Je zřetelná nutriční závislost, onemocnění lze výrazně kompenzovat dietou. 88 Mutace R395W způsobuje záměnu argininu za tyrozin v pozici 395, což je podmíněno substitucí GGG—>TGG v 9. exonu genu pro LDL-receptor. Tato mutace ruší reštrikční místo pro endonukleaázu Hpall, takže normální alela po PCR a restrikci poskytuje fragmenty 137, 56 a 30 bp, zatímco restrikce mutantní alely vede k zisku alel 167 a 56 bp. Uvedená mutace patří mezi asi dvacet nejčastějších mutací v LDL receptoru v české populaci. 3. Materiál, metody PCR: molekulárně-biologická metoda sloužící k amplifikaci fragmentů DNA o definované délce, což umožňuje získat v krátkém čase velké množství kopií příslušné sekvence a tím představuje východisko pro celou řadu dalších molekulárně-biologických postupů. Metoda má tři fáze: 1. denaturace DNA - oddělování dvou řetězců DNA od sebe, 2. annealing - navázání ohraničujících oligonukleotidů (primerů) a 3. elongace - syntéza očekávaných fragmentů DNA. Roztoky: H20, reakční pufr obohacený o bovinní sérum albumin (RP+BSA)(10xkoncentrovaný), MgCL; (25mM), deoxynukleotid trifosfáty-dNTP (směs dATP, dTTP, dCTP, dGTP, lOmM), primer 70 a 71 (lOmM), genomová DNA pacienta heterozygotního pro FH, jedince suspektního z FH a zdravého člověka (asi 50ng/|0,l), Taq polymeráza (5U/|0,1). 4. Postup a) Rozpis přípravy mastermixu pro PCR na 1 vzorek (v Ml) na 3 vzorky (v Ml) 1.H20 13,3 40 2. RP+BSA 2,5 7,5 3. MgCl2 1 3 4. dNTP 0,5 1,5 5. primer 70 1,25 3,75 6. primer 71 1,25 3,75 7. DNA 5 8. Taq 0,125 0,38 PCR směs 20 celkem 25 Do 3 označených eppendorfek napipetujeme 5m,1 DNA zkoumaného vzorku (A), pacienta heterozygotního pro FH (B) a DNA zdravého člověka (C). Vypočítané množství roztoků 1-6 pro 3 vzorky uvedené v tabulce napipetujeme do zvláštní eppendorfky, nakonec napipetujeme roztok 89 8 a dobře pipetou promíchejte. Z této směsi odebereme 20|ol a přidáme k jednotlivým vzorkům DNA, vše dobře promícháme. Eppendoríky s amplifikační směsí vložíme do amplifikátoru a spustíme uložený program reakce: počet cyklů denaturace (teplota/čas) annealing (teplota/čas) elongace (teplota/čas) 1 95°C/5' 62°C/r 72°C/r 35 95°C/r 62°C/r 72°C/r 1 95°C/r 62°C/r 72°C/5' b) Restrikce amplifikovaného produktu příslušnou restriktázou Roztoky: H20, reštrikční pufr (lOx), Hpall (8U/|ol) Provedení: Rozpis reštrikční směsi: 1 vzorek (|jj) 3 vzorky (|jj) 1.H20 7,3 22 2.restrikční pufr 2 6 3.HpaII (reštrikční enzym) 0,7 2,1 4.DNA (amplifikační produkt) 10 celkem 20 Do označených eppendorfek (A,B,C) napipetujeme 10(0.1 DNA. Ve zvláštní eppendorfce promícháme roztoky 1-3 a směs rozpipetujeme do eppendorfek s DNA. Reštrikční směs umístíme do termostatu (37°C) na min. 2 hod. c) Elektroforetická separace produktu 90 Roztokyi lxTBE pufr (příprava gelu a elektroforeticky pufr), nanášecí pufr (bromfenolová modř:ficol,l:l), etidium bromid Provedení: Příprava 2% gelu: 2g NuSieve agarózy rozvaříme ve 100ml lxTBE, po zchladnutí na 50°C přidáme 10|0,1 etidium bromidu, nalijeme na misku s hřebenem a necháme 30 minut ztuhnout, opatrně vysuneme hřeben a gel umístíme do elektroforetické aparatury s lxTBE pufrem Vzorky pro nanášení na gel smícháme s nanášecím pufrem na parafinovém filmu takto: 10|0,1 vzorku+5|ol nanášecflio pufru, celý objem potom naneseme pipetou do komůrek na gelu. Vzorky pro elektroforézu: 1) DNA A (zkoumaný vzorek) po amplifikaci 2) DNA A po amplifikaci a restrikci 3) DNA B (jedince suspektnflio z FH) po amplifikaci 4) DNA B po amplifikaci a restrikci 5) DNA C (zdravého člověka) po amplifikaci 6) DNA C po amplifikaci a restrikci 7) DNA po kontrolní amplifikaci a restrikci Po nanesení všech vzorků připojíme elektroforézu ke zdroji, zdroj nastavíme na 90-100V a necháme asi 30 minut elektroforeticky rozdělit fragmenty DNA (DNA je záporně nabitá, putuje ke kladnému pólu, přičemž se do ní navazuje etidium bromid, který v UV svítí oranžově). Po skončení elektroforézy gel prohlížíme na UV transiluminátoru a výsledek vyfotíme. 4. Výsledky Popis získaného elektroforeogramu ve vztahu k mutaci R935W v genu pro LDL receptor, popis délky jednotlivých alel. 5. Závěr Stručně popíšeme princip metody. Zhodnotíme, zda zkoumaný pacient byl/nebyl heterozygotem/homozygotem pro mutaci R395W v genu pro LDL a zdůvodníme proč. Podáme vysvětlení výsledků elektroforézy zaznamenaných na kopii fotografie. Zdůvodníme, proč 91 heterozygotní pacient má po restrikci daný počet fragmentů DNA ve srovnání se zdravým jedincem a amplifikačním produktem. 92