1.1 Stanovení počtu erytrocytů Potřeby: banička, Hayemův roztok, mikropipety 25 ml a 4 975 ml, kapátka, podložní sklíčko, Bürkerova komůrka, krev, emetní miska, čtverečky buničité vaty. Postup práce: Striktní zásada pro práci s krví: pracujeme pouze v gumových rukavicích! 1. Do baničky odměříme velkou žlutě značenou mikropipetou 4950 ml Hayemova roztoku. 2. Lahvičku s krví krouživým pohybem zlehka promícháme, otevřeme a postavíme do emetní misky. 3. Na menší, modře značenou pipetu nasadíme špičku. Vnoříme ji do lahvičky s krví a nebereme 25 ml krve. 4. Špičku mikropipety s krví zevně otřeme tamponem a zmáčknutím vyprázdníme do baničky s Hayemovým roztokem. 5. Pomalým krouživým pohybem obsah baničky promícháme. 6. Nachystáme si Bürkerovu komůrku a překryjeme ji krycím sklíčkem. 7. Čistým kapátkem kápneme 1 kapku připraveného roztoku z baňky pod krycí sklíčko Bürkerovy komůrky. 9. Vložíme pod mikroskop a začneme odečítat počet erytrocytů v jednotlivých čtvercích podle pravidla: počítáme pouze erytrocyty uvnitř čtverce a ty, které se dotýkají horní a pravé boční strany čtverce a to i z vnější strany (tmavé kroužky). Nezapočítáváme ty elementy, které se dotýkají čtverce na levé a spodní straně - světlé kroužky (viz obr. č. 1.2.). Udávaná chyba tohoto vyšetření při tomto typu určení počtu erytrocytů je ± 200 000/ml (ml = mm3). Obrázek č. 1.2 Bürkerova komůrka a zásady odečtu erytrocytů 1/400 mm^2 1.2 Stanovení koncentrace hemoglobinu Potřeby: transformační roztok, odměrný válec, kapátko, podložní sklíčko, trychtýř, mikropipeta 20 ml, emetní miska, tampon Postup práce: 1. Zkontrolujeme zapnutí přístroje pro odečet c Hb – Spekolu. 2. Vložíme do paměti přístroje faktor pro přepočet absorbance na látkovou koncentraci Hb (1Fe), vynulujeme oproti destilované vodě. 3. Do zkumavky žlutě značenou mikropipetou odměříme 5 ml transformačního roztoku. . 4. Modrou mikropipetou odměříme 20 ml krve (obdobně dle návodu pro stanovení počtu erytrocytů). 5. Obsah mikropipety vyprázdníme do zkumavky s transformačním roztokem, promísíme a čekáme 5 minut na hemolýzu erytrocytů. 6. Pomocí kapátka připraveným roztokem naplníme kyvetu pro Spekol. Zasuneme ji do přístroje (kyveta je zde prosvícena světlem o vlnové délce 540 nm) a na displeji odečítáme výsledek koncentrace Hb (1Fe) v mmol/l, (přepočet g/l = mmol/l x 16.115). 1.3 Stanovení krevní skupiny sklíčkovou metodou Potřeby: kapátko, podložní sklíčka, standardní séra, emetní miska, tampon Postup práce: 1. Na podložní sklíčko kápneme jednotlivá krevní séra. 2. Na další podložní sklíčko kápneme z lahvičky testovaný vzorek krve. 3. Do kapky krve namočíme roh dalšího čistého podložního sklíčka a toto malé množství krve přeneseme do první kapky testovacího séra. Druhý – čistý roh téhož sklíčka opět namočíme do kapky vyšetřované krve a přeneseme do druhého testovacího séra v pořadí. Postup opakujeme i u vzorku třetího testovaného séra. Nikdy bychom neměli zapomenout dobře promíchat vyšetřovanou krev v séru. 4. Krev se séry promícháváme opatrným kolébáním podložního sklíčka na všechny strany, čímž urychlíme případnou aglutinaci. Výslednou reakci odečítáme, při nejasnostech lze použít i mikroskop. Aglutinace se projeví vytvořením vloček v testovacím séru (viz tabulka č. 1.2). 1.4 Sedimentace erytrocytů Potřeby: kapátko, stojan se sedimentačními kapilárami a gumovými kalíšky, vzorky zkoumané krve (plná krev skotu, plná krev koňská, krev lidská a krev koňská, ve kterých byla plazma nahrazena fyziologickým roztokem). Postup práce: 1. Do každého z gumových kalíšků nalijeme po předchozím jemném promíchání asi 2 ml krve (každý vzorek má svůj vlastní kalíšek). 2. Levou rukou uchopíme sedimentační pipetu, která směřuje do středu gumového kalíšku s krví. Gumový váleček zmáčkneme, zmáčknutý nasadíme na horní konec sedimentační pipety a pomalým povolováním stisku válečku tak nasáváme krev do sedimentační pipety až po rysku s označením 0. Po dosažení rysky levou rukou přitiskneme sedimentační pipetu proti středu spodiny gumového kalíšku, odděláme nasávací váleček a polohu pipety zafixujeme (utáhneme šroubem). 3. Při správném postupu sloupec krve neklesá. V časových intervalech odečítáme v milimetrech rychlost sedimentace krevního sloupce erytrocytů 1.5 Osmotická rezistence erytrocytů Potřeby: kapátko, krev, sada 13 skleněných zkumavek, destilovaná voda a 1 % roztok NaCl, fyziologický roztok NaCl (0,9%). Postup práce: 1. Do 12 zkumavek odměříme podle rozpisu (viz tabulka 1.5.1) 1% roztok NaCl a destilovanou vodu, do 13 odměříme 10 ml 0,9% fyziologického roztoku (tabulka 1.5.1) Tabulka 1.5.1 NaCl 1% (ml) 6,3 6,0 5,7 5,4 5,1 4,8 4,5 4,2 3,9 3,6 3,3 3,0 H[2]O (ml) 3,7 4,0 4,3 4,6 4,9 5,2 5,5 5,8 6,1 6,4 6,7 7,0 % NaCl 0,63 0,60 0,57 0,54 0,51 0,48 0,45 0,42 0,39 0,36 0,33 0,30 2. Promísíme. 3. Do každé ze zkumavek přidáme 2 kapky krve. 4. Opatrně promísíme. 5. Nejméně po půl hodině stání odečítáme výsledek.