OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno KLINICKÁ CYTOGENETIKA SEMINÁŘ Mgr.Hanáková OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SCHEMA LIDSKÉ BUŇKY •buněčné jádro •(DNA + proteiny, RNA) img003 cytoplasma s organelami (DNA je v mitochondriích) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno interf buňka ZMĚNA ORGANIZACE GENETICKÉHO MATERIÁLU BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU SOMATICKÝCH BUNĚK mitóza (metafáze) chromosomy = spiralizované molekuly DNA 46 chromosomů lidí s normálním karyotypem jádro v interfázi – despiralizované molekuly DNA (různé stupně spiralizace) mitóza OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SPIRALIZACE CHROMOSOMŮ •během buněčného cyklu •se chromatin nachází •v různých fázích spiralizace •(v interfázi nízký stupeň •spiralizace, během mitózy •postupná kondenzace, •maximální v metafázi •mitózy) • spiral DNA OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI • dvouchromatidový metafázní chromosom • schema chromosomu chromosom s G- pruhy 12-8 zlomy1 img001 chromosom konvenčně barvený q dl ram text p kr ram text centrom text sest chromatidy text 1151-06wcp chromosom metoda FISH OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMOVÉ ABERACE (CHA) Cílem cytogenetického vyšetření je zjištění přítomnosti / nepřítomnosti chromosomových aberací (patologických chromosomových změn) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ - VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ – prenatální a postnatální vyšetření - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (vznikajících v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření IHOK FN BRNO – klasická cytogenetika - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (u onkologických onemocnění) vyšetření z kostní dřeně a tkáně solidních tumorů OLG FN BRNO OLG FN BRNO – molekulárně cytogenetická vyšetření OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ většina vyšetření OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ODDĚLENÍ LÉKAŘSKÉ GENETIKY FN BRNO •ambulance laboratoře klinické cytogenetiky laboratoř molekulární diagnostiky - laboratoř klasické cytogenetiky - laboratoř molekulární cytogenetiky stanovení karyotypu G – pruhování chromosomů metody – FISH, SKY, CGH, MLPA OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU (v různých typech laboratoří) •vyšetření chromosomů • – metodami klasické cytogenetiky • (G-pruhování chromosomů) • vyšetření celého karyotypu (všech chromosomů) • rozlišovací schopnost nejnižší (do10 Mb) • •vyšetření chromosomů, interfázních • jader i izolované DNA • - metodami molekulární cytogenetiky • (vyšetření pomocí fluorescenčně značených sond, PCR) • vyšetření celého karyotypu • vyšetření konkrétních oblastí • rozlišovací schopnost vyšší (až po rozdíly v jednotlivých • nukleotidech – závisí na konkrétní metodě) • •vyšetření izolované DNA • - metody molekulární genetiky • rozlišovací schopnost nejvyšší (rozdíly v sekvenci DNA) 12-8 Zemna tel 11 DNA+ +21 fish dvoušroubovice DNA chromosom s fluorescenčně značenými sondami (vlevo), interfázní jádro (vpravo) chromosom s G-pruhy OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ •postnatální materiály: periferní krev •prenatální materiály: plodová voda, choriové klky, • krev plodu, kůže potracených plodů • kůže, placenta 011 nasazení plodovky 001 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY •odběr materiálu •kultivace – získání dostatečného množství dělících se buněk • (s chromosomy), zastavení dělení buněk kolchicinem •zpracování suspenze (hypotonizace, fixace) – získání suspenze jader •vykapání na podložní sklíčka •pruhování / barvení chromosomů • metody 1. volby v indikovaných případech OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu kultivace4 inverzní mikroskop 2 nasazení plodové vody nasazení periferní krve fotky 005 aplikace kolchicinu – mitotického jedu po kultivaci nádory2 024 kultivace v termostatu 1 2 3 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze •hypotonizace, fixace – získání suspenze jader • fotky 044 fotky 190 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY • vykapání suspenze jader na podložní sklíčka přednáška 090 kapání2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G -pruhování chromosomů • G - pruhování chromosomů přednáška 022 přednáška 065 1 – inkubace preparátu v roztoku trypsinu (natrávení proteinů na povrchu chromosomů) 2 – barvení barvivem Giemsa- Romanowski OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení •chromosomy s G-pruhy hodnotíme ve světelném mikroskopu •zdroj světla - viditelná část spektra (halogenová žárovka) • (stanovení karyotypu) kongo4 přednáška 038 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení zvětšení přibližně 1000x dlouhý2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno přednáška 059 METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení •světelný mikroskop •s CCD kamerou •napojený na počítač přednáška 054 přednáška 056 ke třídění chromosomů a sestavení karyotypu lze využít počítačové analýzy obrazu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI karyotyp •soubor chromosomů jedince nebo buňky, označujeme počet chromosomů, typ • pohlavních chromosomů a případné • aberace (zápis karyotypu např. 46,XY) • •normální lidský karyotyp se skládá • ze 46 chromosomů, z toho 22 párů • autosomů (nepohlavních chromosomů) • a 2 gonosomů (pohlavních chromosomů) • •chromosomový pár je tvořen homologními • chromosomy, z nichž jeden je zděděn • od otce a druhý od matky, nepárové • chromosomy jsou nehomologní (somatické • diploidní buňky) • norm mužský obrázek = utříděný soubor chromosomů jednoho jádra, který vypovídá o chromosomech i v ostatních buňkách pacienta OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI normální mužský karyotyp 46,XY norm mužský OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI normální ženský karyotyp 46,XX norm OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • vykapání suspenze na podložní sklíčka (pro některá vyšetření (FISH)) přednáška 090 kapání2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY princip vazby fluorescenčně značené sondy na chromosomy nebo interfázní jádra na podložním sklíčku sonda značená sonda vazba značené sondy na cílovou DNA (chromosom) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY hodnocení •chromosomy fluorescenčně značené hodnotíme ve fluorescenčním •mikroskopu, zdroj světla - krátkovlnná část spektra (např. rtuťová •výbojka); fluorescenční mikroskop je také součástí systému analýzy obrazu zdroj krátkovlnného vysokoenergetického záření speciální filtry OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno 1045-03 darkyne METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY - FISH CEP8 Zemna tel 11 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno •SKY (spektrální karyotypování) • M-FISH (multicolor FISH) •CGH (komparativní genomová hybridizace) •MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) •M-BAND (mnohobarevné pruhování) DALŠÍ METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE •početní abnormality •polyploidie – znásobení počtu chromosomových sad • (samovolné aborty) •abnormality počtu chromosomů v páru • - aneuploidie (trisomie chromosomů 21, 18, 13, gonosomů, • monosomie chromosomu X)- viz základní přednáška •strukturní abnormality • translokace, inverze, delece, duplikace, inzerce, zvláštní • typy chromosomů – viz základní přednáška Vznik VCA - de novo - poruchy v procesu meiózy (tvorby gamet z primárních oocytů a spermatocytů); během procesu mitózy (mozaika) - zděděné – potomci rodičů – nositelů balancovaných přestaveb OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno STRUKTURNÍ ZMĚNY (aberace) počet chromosomů většinou zachován, ale změna struktury chromosomů (změna lokalizace, ztráta, nadbytek genetického materiálu) POČETNÍ ZMĚNY (aberace) počet chromosomů v karyotypu jiný než 46 lze spolehlivě odhalit metodou G – pruhování chromosomů lze odhalit metodou G-pruhování chromosomů u větších aberací (v rámci rozlišovací schopnosti metody), menší změny (např. mikrodelece) lze detekovat metodami molekulární cytogenetiky OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VCA – STRUKTURNÍ ABERACE OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno KARYOTYP BALANCOVANÝ (genetický materiál nechybí ani nepřebývá) - balancované strukturní přestavby (translokace, inverze) KARYOTYP NEBALANCOVANÝ (část genetického materiálu chybí a část přebývá, event. je možné pouze chybění nebo pouze nadbytek genetického materiálu) - nebalancované strukturní přestavby (nebalancovaní potomci rodičů s balancovanou přestavbou, delece, duplikace vzniklá de novo) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) - příklady strukturní změny – balancované přestavby – např. reciproká translokace balancovaný karyotyp Hitra 1151-06wcp 46,XY,t(5;19)(q15;p12) G-pruhování chromosomů metoda FISH nositelé vrozených balancovaných přestaveb většinou nemají žádné změny fenotypu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – vztah mezi balancovanou a zděděnou formou nebalancované přestavby – přenos na potomky - reciproká translokace, inverze •translokace a pericentrické inverze u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp •vysoké riziko vzniku nebalancovaných gamet – samovolné aborty •narození postižených dětí (nebalancovaný karyotyp - parciální monosomie jednoho a parciální trisomie druhého chromosomu) Možné typy gamet rodiče s balancovanou translokací : - bez přestavby (normální haploidní sada chromosomů) - s balancovanou přestavbou (oba translokované chromosomy) - s nebalancovanou přestavbou (1 část translokace) !!!!!!!!!!!! - OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – např. translokace - derivovaný chromosom vztah mezi balancovaným karyotypem a zděděnou formou nebalancovaného karyotypu • dítě s nebalancovaným • karyotypem • 46,XY,der(21)t(16;21)mat •nebalancovaný karyotyp (parciální monosomie jednoho a parciální trisomie •druhého chromosomu) – potomek rodiče – nositele balancované translokace Škrdlová 16 Škrdlová 21 karyotyp matky 46,XX,t(16;21) chromosomy, které se zúčastnily translokace 21 16 21 Škrdlová 21 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno •46,XX,t(16;21)(q22;q22.1) 46,XY,der(21)t(16;21)(q22;q22.1)mat • Škrdlová Škrdla rodič potomek VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – např. translokace - derivovaný chromosom vztah mezi balancovaným karyotypem a zděděnou formou nebalancovaného karyotypu G-pruhování chromosomů (klasická cytogenetika) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – např. translokace - derivovaný chromosom vztah mezi balancovaným karyotypem a zděděnou formou nebalancovaného karyotypu 127-06 Škrdlová potvrzení translokace u matky a derivovaného chromosomu u dítěte metodou molekulární cytogenetiky - FISH Skrdla 1 Skrdla 2 matka potomek OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – nebalancované aberace – např. koncová delece de novo • 46,XX,del(5)(p14.1) • syndrom Cri du Chat Křížová G-pruhování chromosomů (klasická cytogenetika) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – nebalancované aberace – např. koncová delece de novo metoda MLPA (metoda molekulární cytogenetiky) – potvrzení nálezu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – nebalancované aberace mikrodelece (pod rozlišovací schopností vyšetření chromosomů s G – pruhy) vyšetření metodami molekulární cytogenetiky – vyšší rozlišovací schopnost (FISH) vyšetření metodami klasické cytogenetiky G-pruhování chromosomů 46,XX normální karyotyp 46,XX nalezena delece na 22. chromosomu v oblasti 22q11-13 (Di George syndrom – VSV) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – suspektně balancované přestavby (apparently balanced rearrangement) Přestavby se jeví jako balancované (dostupnými metodami nebyla nalezena ztráta ani nadbytek genetického materiálu), ale pacient je postižen. Možný důvod – vyřazení genu z funkce, ovlivnění regulačních oblastí genu, přítomnost kryptických komplexních chromosomových přestaveb v místech zlomů na chromosomech. OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) komplexní strukturní přestavby 46,XX,der(2)t(2;5),der(5)t(2;5;10),der(10)t(2;10)de novo suspektně balancovaná translokace Le Huyen karyotyp diskrétní stigmatizace, těžká PMR, neprospívání OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno FISH: WCP 2, 5 899-03upravtom OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SKY: t(2;5),t(2;5;10),t(2;10) Le Huen Trang SKY OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno HR-CGH: negativní suspektně balancovaná chromosomová přestavba Le Huen Trang HR-CGH OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno der(2)t(2;5) der(5)t(2;5;10) der(10)t(2;10) chrom2 chrom5 chrom10 Le Huyen der(2) Le Huyen der(5) Le Huyen der(10) 2b 5 5 2b 10 10 2b OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMOVÉ ABERACE komplexní strukturní přestavby ZÁVĚR •složité (komplexní) chromosomové přestavby nelze vyšetřit • pouze metodami klasické cytogenetiky (G – pruhování • chromosomů), nutné vyšetřit metodami molekulární cytogenetiky (SKY, CGH) 46,XX,der(2)t(2;5),der(5)t(2;5;10),der(10)t(2;10)de novo suspektně balancovaná translokace OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS •má – li osoba chromosomovou abnormalitu, bývá většinou aberace přítomna ve všech jejích buňkách •mozaicismus = v těle jedince jsou přítomny 2 nebo více linie buněk s odlišnou chromosomovou konstitucí • - nejčastější výskyt mozaiky gonosomů (poruchy fertility) • 45,X[6]/47,XXX[4]/46,XX[190] • - mozaika autosomů • - mozaika linie s normálním karyotypem s linií s Downovým syndromem • 47,XY,+21[172]/46,XY[28] • - např. linie s normálním karyotypem s linií s monosomií • chromosomu 18 45,XX,-18[10]/46,XX,r(18)[190] – velmi zřídka •ve formě mozaiky mohou být přítomny numerické aberace i strukturní přestavby, početní se vyskytují častěji •nejčastější příčinou mozaicismu je nondisjunkce v časném postzygotickém mitotickém dělení (např. ztráta chromosomu č.21 • z buňky zygoty s trisomií tohoto chromosomu) • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) DEFINICE MOZAIKY •Jedinec nebo tkáň obsahuje 2 nebo více geneticky odlišných •buněčných klonů pocházejících z jediné zygoty, které vznikly •v důsledku mutace nebo nondisjunkce na různých úrovních •postzygotického dělení (mitotického dělení). • •(Chiméra – buňky jedince pocházejí z více zygot.) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno • 45,X[6]/46,XX[194] •10-30 mitóz hodnotíme z chromosomů s G-pruhy, zbytek vyšetření metodou FISH •z interfázních jader VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - gonosomy 46,XX 45,X 3% hraniční patologický nález OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - gonosomy Mozaika X • 45,X[6]/46,XX[194] • vyšetření % zastoupení jednotlivých linií buněk v periferní krvi • pacientky metodou FISH z interfázních jader • (3% zastoupení buněčné linie 45,X) 1 signál (přítomen 1 chromosom X v jádře buňky) 2 signály (přítomny 2 chromosomy X v jádře T-lymfocytu) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace Kapitančík1 kap4 buněčná linie 46,X,r(Y)? OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace Kapitančík2 1461-08 g foto buněčná linie 46,X,mar(Y)? OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace Kapitančík4 1461-08 b foto buněčná linie 46,X,t(Y;9)(p11?;q12?) t(Y;?), přítomna oblast SRY buněčná linie kap1a OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace Kapitančík3 1461-08 d foto buněčná linie 45,X OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace Karyotyp – chromosomy s G - pruhy: 46,X,r(Y)?[5]/46,X,t(Y;9)(p11.32?;q12?)[4]/45,X[1] Nálezy metodou FISH: Vyšetření na interfázních jádrech: XY [120] X [70] Vyšetření na mitózách: t(Y;?), přítomna oblast SRY [26] X + marker z chromosomu Y, oblast SRY přítomna [17] X [7] složitý zápis i interpretace složitých karyotypů v mozaice OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - význam •je obtížné posoudit význam nálezu mozaiky • - záleží na typu chromosomové abnormality • - význam má % zastoupení linie s patologickým karyotypem • - % zastoupení jednotlivých buněčných linií může být v různých • tkáních rozdílné (vyšetření z periferní krve, stěru z bukální sliznice • pro ověření a porovnání) • • • • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika •riziko vzniku pseudomozaiky kultivačního původu, potíže při interpretaci (kultivace 2 paralelních kultur, opakovaný odběr) •vyšetření choriových klků – extraembryonální tkáň, častý výskyt mozaikových karyotypů (mitotická nondisjunkce) – diskrepance v nálezech u embrya a extraembryonální tkáni (embryo má kontrolní mechanismy limitující dělení abnormálních buněk, v choriu se abnormální buňky dělí) • • • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika • • • mozaika CVS – diskrepance v karyotypu embrya a extraembryonální tkáně - vznik mozaiky v blastocystě před diferenciací na embryo a extraembryonální tkáň – mozaika přítomna v obou - vznik mozaiky v pozdějším stádiu v embryu nebo v extraembryonální tkáni (častěji) – mozaika přítomna jen tam, kde vznikla placentární mozaicismus – zdroj falešně pozitivních výsledků OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM VYŠETŘENÍ VCA - objasnit příčinu zdravotních potíží pacienta - stanovit prognózu onemocnění, nabídnout pacientovi možnosti léčby a péče - prevence výskytu vrozených chromosomových aberací v rodině VCA léčbou nevymizí OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ • • kostní dřeň solidní nádory periferní krev dřeň 002 nádory 003 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ CHROMOSOMŮ vyšetření v laboratořích klasické a molekulární cytogenetiky klasická cytogenetika – kultivace, zpracování vstupních materiálů založeny na obdobných principech - G-pruhování chromosomů molekulární cytogenetika – metoda FISH, SKY, CGH a další metody stanovujeme KARYOTYP MALIGNÍCH KLONŮ – v nádorové tkáni mohou být přítomny skupiny buněk s odlišným karyotypem – klony – v rámci klonu stejný karyotyp 12-8 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE u onkologických pacientů •početní abnormality •abnormality počtu chromosomových sad • - polyploidie (hypo-, hyper- (di-, tri- atd.) ploidie) •abnormality počtu chromosomů v páru • - aneuploidie (trisomie, monosomie)- často se týká jiných chromosomů než • u vrozených chromosomových aberací • •strukturní abnormality • translokace, inverze, delece, duplikace, inzerce, zvláštní • typy chromosomů – konkrétní aberace odlišné od VCA • amplifikace (mnohonásobné zmnožení onkogenu, detekovatelné cytogeneticky) • – pouze u onkologických pacientů – souvisí se vznikem a progresí onkologického onemocnění (poruchy dělení somatických buněk), vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno kalab-CYTO kalab-SKY ONKOCYTOGENETIKA komplexní karyotyp 56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8, +10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12) qdp(12p),+17,der(18) smíšený germinální tumor OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (u onkologických pacientů) MOZAICISMUS •nádorové buňky tvoří klony •klon - skupina geneticky identických buněk • (v nádorové tkáni pacienta se může vyskytovat více buněčných klonů, každý z nich nese jiné aberace) (stanovení karyotypu maligních klonů) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů U onkologických pacientů vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením, v souvislosti s onemocněním vznikají chromosomové změny. Cytogenetické vyšetření pomáhá zpřesnit diagnózu, stanovit prognózu onemocnění monitorovat úspěšnost léčby (záchrana života pacienta) – některé translokace – vznik fúzních genů, jejichž produkty mají změněnou funkci podporující nebo způsobující nádorové bujení - některé chromosomové změny souvisejí s horší/ lepší/ střední prognózou OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí - z periferní krve OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) •vlivem mutagenních faktorů prostředí dochází na chromosomech ke změnám (zlomy, vznik di-, tricentrických chromosomů, ring chromosomů ad.) • – nacházíme různé změny v různých buňkách • (v každé buňce jinou – nejedná se o mozaiku, ale o náhodné změny) (stanovení % aberantních buněk, hraniční patologie opakovaně 5% ab. b.) DIC DF tmavý zlomy1 dic chrb vyšetření z periferní krve metodou klasické cytogenetiky – konvenční barvení chromosomů OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) vyšetření z periferní krve • •rychlejší stárnutí organismu •vznik degenerativních onemocnění •možné maligní zvrhnutí • • Přítomnost aberací v somatických buňkách Přítomnost aberací v gametách •zvýšené riziko narození postiženého dítěte Konvenční barvení chromosomů Stanovení % aberantních buněk – buněk s poškozeným chromosomem zlomy1 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku • působení - fyzikálních faktorů • (ionizující záření) • - chemických látek • (cytostatika, imunosupresiva, oxidační, • alkylační činidla ad. látky používané • v průmyslu) • - biologických faktorů • (virové infekce – pravé neštovice, spalničky, • zarděnky ad.) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) typy aberací •chromatidové aberace – gap na 1 chromatidě • - zlom na 1 chromatidě • - chromatidové výměny •chromosomové aberace – gapy na 2 chromatidách • - zlomy na 2 chromatidách • - kruhové chromosomy • - di- a vícecentrické chromosomy viz základní přednáška OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno •důležité odlišnosti mezi přípravou preparátů z periferní krve pro: • 1.stanovení karyotypu – chromosomy s G – pruhy • - délka kultivace 72 hodin • - G-pruhování = inkubace v trypsinu + směs barviv Giemsa – • Romanowski • - zajímá nás typ aberace, snažíme se ji co nejpřesněji definovat • •2. stanovení % aberantních buněk – chromosomy konvenčně barvené • - délka kultivace 48 hodin (je třeba zachytit 1. buněčné dělení – • později dochází k opravě aberací) • - konvenční barvení = pouze Giemsa – Romanowski bez trypsinu • - nezajímá nás konkrétní typ aberace, pouze jestli je/není v dané buňce • některá přítomna VROZENÉ ABERACE / ZÍSKANÉ ABERACE (mutagenní faktory) zlomy1 12-8 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinické indikace k vyšetření ZCA •práce v riziku (kontakt se škodlivými látkami, zářením), vstupní prohlídky na pracovištích se zvýšeným rizikem •před chemoterapií, po chemoterapii, po jiné dlouhodobé léčbě •kontrolní vyšetření u podchycených případů • aberace vymizí po léčbě (vitamíny) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno chromozomy děkuji za pozornost