BC_Dusíkaté látky_N2011 1 Dusíkaté látky nebílkovinné povahy Petr Breinek Analytická část 2 •CELKOVÝ DUSÍK •= celkové množství dusíku všech dusíkatých látek •= bílkovinný + nebílkovinný dusík • •Metody stanovení: KJELDAHLOVA metoda • • V supernatantu po DEPROTEINACI (kyselinou trichloroctovou) vznikne z DUSÍKATÝCH látek (za varu po rozkladu konc.H2 SO4 a v přítomnosti katalyzátorů) SÍRAN AMONNÝ, z kterého se oddestiluje AMONIAK, který se stanoví TITRAČNĚ 3 • 1) MOČOVINA • 2) KREATININ (KREATIN) • 3) KYSELINA MOČOVÁ • 4) AMONIAK • 5) blíže nedefinované látky + peptidy • 6) AMINOKYSELINY (např.Homocystein) Nejčastěji se jedná o odpadní látky, výjimku tvoří aminokyseliny 4 Jaké jsou doporučené metody? 4 Enzym Referenční metoda Certifikovaný referenční materiál Kyselina močová ID-GC/MS HPLC SRM 909b NIST NIST/SRM 913a Močovina ID-GC/MS ID-LC/MS SRM 909b NIST NIST/SRM 912a Kreatinin ID-GC/MS ID-LC/MS SRM 967 SRM 909b NIST NIST/SRM 914a Cystatin C IFCC/IRMM metoda 5 Jaká je povolená chyba v EHK?(2011) 5 Enzym TMU (SEKK 2011) TMU teoretická S-Kyselina močová 14% 12% U-Kyselina močová 26% 29% S-Močovina 15% 16% U-Močovina 17% 27% S-Kreatinin 15% 8,2% U-Kreatinin 24% 28% Cystatin C 15% Homocystein 30% 6 Močovina: výpočet teoretické TMU 6 (CVw) Intraindividuální biologická variabilita* 12,3% (CVa) Přesnost odvozená z biologických variabilit 6,2% (CVg) Interindividuální biologická variabilita* 18,3% (b) Systematická chyba (bias) odvozená z biologických variabilit 5,5% (CVb) Celková biologická variabilita 22,0% Celková chyba (TE) odvozená z biologických variabilit Teoretická TMU (cílová nejistota měření) 15,7% www.westgard.com Variabilita (proměnlivost) TE = |b| + 1,65.CVa = 0,25.CVb + 1,65.0,5.CVw (%) a b c 7 •Referenčními metodami / postupy • RMP Reference Method Procedure • •Validovanými metodami v expertních laboratořích • AV Assigned Value • •Jako průměr výsledků měření všech účastníků po vyloučení odlehlých hodnot • ALTM All Laboratory Trimmed Mean • •Průměr výsledků měření stejnorodých skupin účastníků po vyloučení odlehlých hodnot • ConV Consensus Value Jak se získávají cílové hodnoty? 8 • MOČOVINA (urea) • Je konečným produktem metabolismu bílkovin (aminokyselin) – detoxikace NH3 •Bílkoviny • •Aminokyseliny • •Močovinový cyklus (játra) • •Močovina (krev → moč) 9 •Močovina • •Vzniká v játrech (cca 16g/d= 0,5-0,7 mol/d) v močovinovém cyklu • ( metabolizováním 2,9 g bílkovin vzniká 1g močoviny) •Vylučuje se glomerulární filtrací močí ( na rozdíl od kreatininu je zpětně resorbována), malá část je metabolizována ve střevě. • • V proximálním tubulu se zpětně resorbuje 40-50% profiltrované močoviny, v distálním tubulu závisí resorpce na tom, zda je vylučována koncentrovaná nebo zředěná moč (dehydratace organismu se projevuje vzestupem močoviny). 10 • • Koncentrace v krvi závisí na: • •vylučování močoviny ledvinami močí •její tvorbě (zvýšený rozpad bílkovin - horečka, sepse, hladovění) •obsah proteinů v dietě • • 11 • • Referenční rozmezí: • • S-Močovina muži 2,0-8,3 mmol/l • ženy 2,0-6,7 mmol/l • • dU-Močovina 167-583 mmol/24h 12 •Metody stanovení • 1.REFERENČNÍ metody • • a) ID-GC/MS ID-LC/MS • standardní přidání značené močoviny (izotopová diluce) do analyzovaného vzorku a následné stanovení kombinací plynové nebo kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií • • b) HPLC • vysokoúčinná kapalinová chromatografie 13 1. •2. Doporučená metoda (enzymová) (ureáza/GMD) • • H2N-CO-NH2 + H20 + ® CO2 + 2 NH3 • močovina ureáza • • • • 2 NH4+ • • • • + 2H+ 14 • • •NH4+ + 2-oxoglutarát + NADH ® L-glutamát +NAD++H20 • •glutamátdehydrogenáza (GMD) • • spektrofotometricky - pokles absorbance NADH při 340 nm • 15 • 3. 3.ELEKTROCHEMICKÉ metody (biosenzory) • urea Gem 3000 GEM 4000,IL 16 4.Jiné možnosti stanovení (starší metody) • •enzymové metody (ureasa/Berthelotova reakce) reakce amoniaku s chlornanem a fenolem za vzniku barevného (modrého) indofenolu • •chemické • - reakce močoviny s a diketony nebo jejich oximy (např.diacetylmonoxim, DAM) • - reakce močoviny s o-ftaldialdehydem (OFA) • 17 • • Kreatinin vzniká ve svalové tkáni jako konečný produkt přeměny kreatinu (dehydratace). • (Kreatin vzniká v játrech, pankreatu a ledvinách, podílí se na tvorbě energie potřebné ke kontrakci svalů) • •kreatin + ATP ® kreatinfosfát + ADP (CK) •kreatinfosfát ® kreatin ® kreatinin + H20 • KREATININ 18 • • Koncentrace v krvi závisí na: • •vylučování kreatininu ledvinami močí •syntéze kreatinu (svalové hmotě) 19 • • Referenční rozmezí: • • S-Kreatinin muži 60-100 μmol/l • ženy 50- 90 μmol/l • • dU-Kreatinin 8,8-15,0 mmol/24h 20 Kreatininová clearance (výpočet) •Informace o množství krve profiltrované ledvinami za 24h (filtrační schopnost ledvin) •Méně kvalitní ukazatel GFR než výpočet z eGFR z koncentrace kreatininu v séru • •za fyziologických podmínek nadhodnocuje glomerulární filtraci asi o 10% ,u renálního selhání o 100% (!) • Nutný sběr moče • GF = (U-kreatinin x V ) : S-kreatinin 21 Doporučení IFCC •2005: pracovní skupina IFCC WG-GFRA • Working Group- GFR Assessment •Doporučení: • ….používání specifičtějších metod na stanovení kreatininu …. • 22 Stanovisko ČSKB k současnému stavu standardizace stanovení kreatininu v séru/plasmě •Upozornění na pozitivní bias (15 až 25%) Jaffého metody v oblasti do 130-140 µmol/l •Bias +20 µmol/l u Jaffého metody při koncentraci 140 µmol/l sníží hodnotu eGFR pod rozhodovací limit (učiní ji falešně patologickou) •Nepoužívat Jaffého metodu u dětí a novorozenců (nízká koncentrace bílkovin) •V Německu je enzymová metoda povinně vyžadována u pacientů na dialýze •Doporučena enzymová metoda s návazností na refernční metodu a NIST SRM 967 • 23 GF_vypocet SLP 24 MDRD_vypocet SLP 25 • 1.Referenční metoda • ID-GC/MS a ID-LC/MS • standardní přidání značeného kreatininu (izotopová diluce) do analyzovaného vzorku a následném stanovení kombinací plynové nebo kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií •Certifikovaný referenční materiál • SRM 967 (SRM-NIST 909b, SRM-NIST 914) • 26 Kreatinin enzymaticky •1.Stanovení kreatinu vzniklého z kreatininu • •kreatininasa/kreatinasa/SOX/POD •kreatininasa/CK/PK/LD • •2. stanovení amoniaku vzniklého z kreatininu • •Kreatininiminohydrolasa//GlDH • 27 • kreatinin + H20 ® kreatin • kreatininasa • kreatin + H20 ® sarkosin + močovina •kreatinasa • •sarkosin + H20 +O2 ®glycin +formaldehyd + H2O2 • sarkosinoxidasa • •H2O2 +AAP+fenol ® chinonmonoiminové barvivo + H20 peroxidasa (oxidační kopulace) 28 Princip a postup měření •1. vzorek + R1 •KREATIN + H20 ® SARKOSIN + MOČOVINA (kreatinasa) •SARKOSIN + H20 +O2 ®GLYCIN + HCHO + H2O2 (SOX) • H2O2 + AAP + ESPMT ® barevný komplex + H20 (POD) •Odstranění endogenního kreatinu, H2O2 (katalasa), kyseliny askorbové (AOX) • •2. + R2 •KREATININ + H20 ® KREATIN (kreatininasa) • 29 • •kreatinin + H2O ® 1-methylhydantoin + NH3 • kreatininiminohydrolasa • •NH4++2-oxoglutarát+ NADH ® L-glutamát + NAD++ H20 • glutamátdehydrogenasa (GMD) • •Spektrofotometricky, pokles absorbance NADH při 340nm • 30 • kreatinin + H20 ® kreatin • kreatininasa • kreatin + ATP ® kreatinfosfát + ADP kreatinkinasa (CK) •ADP + fosfoenolpyruvát ® pyruvát + ATP • pyruvátkinasa (PK) •pyruvát + NADH + H+ ® laktát + NAD+ • laktátdehydrogenasa (LD) •Spektrofotometricky, pokles absorbance NADH při 340nm Jiný princip enzymového stanovení 31 Metody využívající Jaffeho reakci • • • • • • • •Nespecifičnost měření •Reagují: proteiny, ketony, bilirubin, některé léky,… kreatinin + kyselina pikrová komplex kreatinin- kyselina pikrová alkalický roztok KREA Jaffe 32 Snížení nespecifičnosti •Celá řada modifikací v průběhu více než 100 roků •Částečně snížena kinetickými metodami •Rate-blank, kompenzace, detergenty, …. •Optimalizace koncentrace reagencií •Rozdílné výsledky mezi jednotlivými modifikacemi Jaffeho metody 33 • •4. Jiné metody: • a) elektrochemické metody (biosenzory) • POCT • • b) HPLC • c) CE • Gem 3000 34 • KYSELINA MOČOVÁ (1,3,8-trioxypurin) • • U člověka je konečným produktem metabolismu purinů. • Puriny jsou součástí nukleových kyselin (DNA), do krve se dostávají z potravy nebo při rozpadu a obnově buněk těla. • • Je málo rozpustná a cirkuluje v krvi v hladinách blízkých hodnotě, při které již není rozpustná. • Sodná sůl je rozpustnější (uráty). • • U lidí a primátů chybí enzym urikáza, která umožňuje přeměnu kyseliny močové na lépe rozpustný allantoin. • • 35 • • Je vylučována z 1/3 zažívacím traktem a ze 2/3 ledvinami. Není to jen látka odpadní, má význačný antioxidační účinek. • • Zvýšenou koncentraci v krvi (hyperurikemie) způsobuje: •její zvýšená produkce (maso, zvýšená degradace buněk-leukémie) •její snížené vylučování • • 36 • • Referenční rozmezí: • • S-Kyselina močová muži 200-420 μmol/l • ženy 140-340 μmol/l • • dU-Kyselina močová 0,5-6,0 mmol/24h 37 •Metody stanovení 1.Referenční metody • ID-GC-MS a HPLC • standardní přidání značené 1,3-15N kyseliny močové (izotopová diluce) do analyzovaného vzorku a následné stanovení plynovou chromatografií s hmotnostní spektrometrií • nebo stanovení kyseliny močové vysokoúčinou kapalinovou chromatografií (HPLC) • • • 38 • • 2.Doporučená rutinní metoda • (enzymové stanovení,urikáza/peroxidáza) • •kyselina močová +2 H20 +O2 ®allantoin + H2 O2+ CO2 • urikáza • • • KM 39 • • •kyselina močová +2 H20 +O2 ®allantoin + H2 O2+ CO2 • urikáza • •H2O2 +AAP+fenol ® chinonmonoiminové barvivo + H20 peroxidáza (oxidační kopulace) • 40 • • •3. Jiný princip enzymového stanovení • (urikasa/kataláza) • •kyselina močová +2 H20 + O2 ® allantoin + H2 O2 + CO2 •urikáza • • H2O2 + methanol ® formaldehyd + 2 H20 • kataláza • 41 • • • •kyselina močová +2 H20 + O2 ® allantoin + H2 O2 + CO2 •urikáza • H2O2 + methanol ® formaldehyd + 2 H20 • kataláza •formaldehyd +2 acetylaceton+ NH4+ ®3,5-diacetyl- 1,4-dihydrolutidin+ 3 H20 • •HANTZSCHOVA kondenzační reakce (A 405nm) 42 • • •4. ENZYMOVÉ stanovení (urikasa/UV) • 282-293 nm 43 • 5.Chemické metody • založené na redukčních vlastnostech kyseliny močové (oxidace) • • např. redukce kyseliny fosfowolframové v alkalickém prostředí za vzniku wolframové modře 44 • Vzniká při degradaci bílkovin (aminokyselin) ve všech tkáních, především v játrech (také v ledvinách a svalech). • Nezanedbatelným zdrojem amoniaku je také rozklad bílkovin bakteriálními enzymy ve střevě. • • Je toxický, v játrech je přeměňován na močovinu a glutamin. • V mozku a jiných tkáních, které nemají schopnost tvořit močovinu, se amoniak detoxikuje transaminační reakcí s 2-oxoglutarátem, za vzniku glutamátu. • AMONIAK (NH3),amonný kation NH4+ 45 • Zvýšená koncentrace v plazmě: • • Závažné jaterní onemocnění •Snížení průtoku krve játry •Při vrozených poruchách enzymů v močovinovém cyklu •Reyeův syndrom (vzácné poškození krve, jater a mozku, většina případů je vyvolána virovou infekcí) •Selhání ledvin • • Preanalytika: • Krev se musí po odběru ihned zchladit a zpracovat co nejdříve (30min), neboť hrozí falešně zvýšené hodnoty. • • • 46 • • Referenční rozmezí: • • P-Amoniak muži 15 - 55 μmol/l • ženy 11 - 48 μmol/l • • 18 - 72 μmol/l • • • 47 •Metody stanovení: • • 1. Referenční metoda: není k dispozici • 2. Rutinní metody • a) enzymové metody (GMD/UV) • •NH4++ 2-oxoglutarát + NADH ®L-glutamát+ NAD++ H20 • glutamátdehydrogenáza • •spektrofotometricky • pokles absorbance NADH při 340 nm • • 48 • 3. Elektrochemické metody (biosenzory, POCT) • - přímá potenciometrie • - konduktometrie • • 4. Jiné možnosti stanovení • - chemické metody • - mikrodifuzní metody • • • 49 Homocystein •neesenciální sirná aminokyselina •není součástí tělesných bílkovin •vzniká v organismu při přeměně methioninu (Met) na cystein(Cys) • jako degradační produkt S-adenosylmethioninu (donor merhylenové skupiny) •nezávislý rizikový faktor • 50 Nezávislý rizikový faktor * • • * kardiovaskulární onemocnění * periferní vaskulární onemocnění (arteriální i žilní trombóza) * cerebrovaskulární onemocnění * opakované ztráty plodu Rizikový faktor je přibližně stejný jako u hyperlipidémie a kouření. 51 • • Referenční rozmezí: • • P-Homocystein 5-15 μmol/l • • 52 •Metody stanovení: • 1. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) •(deproteinace) •redukce •derivatizace •analýza •detekce (fluorometrická) • 53 • 2. Imunochemické metody – •Redukce oxidovaných forem(např.1,4-dithio-D,L-threitol) •Enzymatická přeměna homocysteinu na – S-adenosylhomocystein •Kompetitivní imunochemická reakce se specifickou monoklonální protilátkou •Detekce – ELISA,imunoturbidimetrie, chemiluminiscence,… • 54 • •3. Enzymová metoda („cyklická“): • Hcy + L-serin Cystathionin • CBS (cystathion β-syntáza) • Cystathionin Pyruvát +Amoniak+Hcy • BBL (cystathion β-lyáza) • Pyruvát + NADH L-Laktát +NAD+ • LD (laktátdehydrogenáza) •SPEKTROFOTOMETRICKY • (pokles absorbance při 340 nm) • 55 •4. Kombinace plynové chromatografie s hmotovou spektrometrií (GC-MS) •