BC_HbA1c_N2011 1 Glykovaný hemoglobin HbA1c Petr Breinek 2 •Ukazatel dlouhodobé kompenzace diabetu •Diagnostika onemocnění •Kontrola terapie •Včasné odhalení hrozících komplikací •V roce 2009 ADA (USA) připustila užití HbA1c k diagnostice diabetu Glykovaný hemoglobin (HbA1c) 3 •Není třeba konzervovat krev (větší stabilita) •Menší intraindividuální variabilita (CV<2%) •HbA1c není ovlivněn krátkodobou glykémií •Nemocný nemusí být lačný •Využití pro diagnostiku i kontrolu léčby Výhody proti glykémii 4 • • Návrh (IFCC-IUPAC C-NPU): • • Hemoglobin beta chain(Blood)-N-(1-deoxyfructos-1-yl)hemoglobin beta chain • • Jednotky: místo % → mmol/mol • 5 • vHbA1c odpovídá dlouhodobému stavu koncentrace glukózy v krvi (průměrný poločas života erytrocytů je 60 dní → koncentrace HbA1c odráží průměrnou koncentraci glukózy v průběhu předcházejících 2-3 měsíců) • vHbA1c neodpovídá aktuální hodnotě glykémie, jejímu poklesu nebo zvýšení (glykémie může velmi kolísat beze změn HbA1c) Co je vyšetřováno? 6 • vPřítomnost abnormálního typu hemoglobinu (např. thalasemie) vHemolýza vTěžké krvácení Co může ovlivnit hodnocení vyšetření HbA1c 7 Glykace proteinů * chemická vazba sacharidů na N-koncové aminokyseliny proteinů (neenzymová reakce) * in vivo- vznikají glykované (modifikované) proteiny se závažnými patobiochemickými důsledky * in vitro- hnědnutí proteinů v přítomnosti sacharidů 8 Glykace hemoglobinu - rychlá tvorba labilní Schiffovy báze (aldimin) -- pomalý Amadoriho přesmyk za vzniku stabilního ketoaminu (ireversibilní) -- koncentrace závisí na koncentraci glukózy a poločasu života erytrocytů 9 Faktory ovlivňující neenzymovou glykaci proteinů •koncentrace sacharidů a proteinů a jejich kolísání • (koncentrace proteinů v krvi relativně konstantní, rychlost glykace je úměrná koncentraci sacharidů) •doba expozice • biologický poločas daného proteinu • teplota • 10 HbA0 HbA1c Val His Leu Thr Pro Glu Gluc Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser . . . . Glu Lys Ser . . . . HbA1c vzniká glykací na N-konci ß-řetězce hemoglobinu Glykována je první AK - Val ß-chain 11 Hemoglobiny Hb HbA0 HbA1 HbA1a HbA1b HbA1c HbA (aaßß) HbA2 (aadd) HbF (aagg) 96% <2% 2-3% Normální Hb u dospělých Fetální Hb Neglykovaný Glykovaný 94% - hlavní glykovaný Hb -> 20 let využíván pro kontrolu glykémie 5% 12 Odběr a analyzovaný materiál •Krev (B) - odběr do EDTA • • Stabilita: 2d (+20 až +25°C) • 1t (+4 až +8°C) 1r (<-20°C lépe při -80°C) • 13 •HbA1c by měl být stanovován u nemocných minimálně 2x ročně, optimálně 4x ročně • •DM 1.typu – 4x ročně •DM 2.typu – 1x ročně, při léčbě perorálními antidiabetiky 2x ročně, inzulínem 4x ročně • 14 Referenční meze • •B-HbA1c 2,8-4,0 % • Kompenzace diabetu IFCC,2004 do 2004 Výborná < 4,5 % < 6,5 % Uspokojivá 4,5 - 6,0 % 6,5 - 7,5 % Neuspokojivá > 6,0 % > 7,5% 15 Referenční meze Klinický stav IFCC,2004 % IFCC mmol/mol Zvýšené riziko DM 4,2 - 4,6 % 42 - 46 Diagnóza DM ≥ 4,7% ≥ 47 Kompenzovaný DM ≥ 5,3% ≥ 53 Indikace změny terapie ≥ 6,4 % ≥ 64 Doporučení výboru ČSKB ČLS JEP 16 Přepočty výsledků •Xmmol/mol = 10 . X%IFCC • • •Xmmol/mol = (X%DCCT – 2,15)/ 0,0915 • 17 Metody stanovení 1.Referenční metody IFCC, 2002 Izolace a hemolýza erytrocytů (+ odstranění labilních pre-HbA1c) Enzymové štěpení hemoglobinu (endoproteináza Glu-C) Analytické měření (detekce glykovaných hexapeptidů) a) HPLC/ESI /MS b) HPLC/CE c)RM DCCT (HPLC) (Diabetes Control and Complication Trial, USA,v programu NGSP=The National Glycohemoglobin Standardization Program) 18 CRM: IRMM 466 IRMM 467 (směs čistých HbA0 a HbA1c) Přesnost měření a nejistota Opakovatelnost CV=1,05 % Reprodukovatelnost CV=1,8 % Kombinovaná standardní nejistota primárních kalibrátorů 0,63 % TMU (teoretická):4% 19 •2. Doporučené metody: •a) Chromatografické vHPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) vLC (nízkotlaká kapalinová chromatografie) • • •Afinitní chromatografie (aminofenylboronátová) •IEC (kapalinová chromatografie s výměnou iontů) • • 20 •Princip (Tosoh G7) •Iontově výměnná vysokoúčinná kapalinová chromatografie • •Hemolyzačním a promývacím roztokem se vzorek naředí a přivede na chromatografickou kolonu •Používá se třístupňový gradient roztoků s různou koncentrací solí •Na koloně dochází k výměně kationtů a rozdělení hemoglobinů •Rozdělené frakce postupují k detektoru, kde se měří absorbance při 415nm •Jednotlivé typy hemoglobinových frakcí jsou vyjádřené v % celkového množství hemoglobinu • 21 HPLC Tosoh Tosoh_HbA1c 22 Tosoh_HbA1c_chromatogram Tosoh_HbA1c_chromatogram2 23 •b) Elektroforetické • ELFO (elektroforéza) • IEF (izoelektrická fokusace) • CE a HPCE (kapilární elektroforéza) v • • • 24 •c) Imunoanalytické • IT (imunoturbidimetrie) • TINIA (Turbidimetric Inhibition Immunoassay) • (Imunoinhibiční turbidimetrie) • IN (imunonefelometrie) • v • • • 25 •d) Spektrofotometrické • Enzymové • • v • • •