Parametry metod automatické fotometrické analýzy •Každá metoda prováděná automatickým biochemickým analyzátorem má v softwaru řídícího počítače nadefinované parametry: • číslo (aplikační kód) metody • název metody • biologický materiál (sérum, plazma, moč…) • typ měření změn absorbance (end-point, kinetické měření) • délka inkubace – doba trvání reakce ( do 10 min) • měřící body reakce • vlnová délka • objem pipetovaného vzorku, • objem pipetovaných reagencií (R1, R2, R3…) • podmínky při opakování analýzy s menším, stejným nebo větším • objemem vzorku • způsob/typ kalibrace • parametry pro zajištění validní kalibrace (limity pro citlivost a • opakovatelnost) • pracovní rozsah metody a další parametry k ověření integrity • výsledku (absorbanční limit, limit pro kontrolu linearity průběhu • reakce) Parametry metod automatické analýzy •Parametry definují analytickou metodu. •Zadávají se do automatických analyzátorů •takto: •Manuální vkládání jednotlivých parametrů • ( ustupuje, možnost chyby) • •Kompletní aplikace od výrobce – instalace z diskety, čárovým kódem nebo přes web, možnost úpravy pouze u některých parametrů Popis významných parametrů Vlnové délky, bichromatické měření: Všechny testy pro klinickou chemii jsou v současné době měřeny simultánně při dvou vlnových délkách – hlavní a vedlejší. sejmout0011 Bichromatické měření •Koncentrace se počítá z rozdílu absorbance obou měření. •Výhodné, neboť kompenzuje : •variace světelné emise fotometru •citlivost fotodiod •bublinky nebo částečky v cestě světla • •Hlavní vlnová délka je dána absorpčním maximem reakce •Vedlejší vlnová délka je zvolena tak, aby •rozdíl absorbancí mezi hlavní a vedlejší λ byl co největší •současně se při ní musí minimálně uplatňovat interference •současně má být co nejblíže k hlavní λ • •Na analyzátorech bývá běžně možnost využívat pro různé •metody 12 vlnových délek Měřící body reakce: •Absorbance reakčních roztoků v kyvetě je periodicky měřena po každém cyklu přístroje (kolem 20s) během reakčního času ( 3 – 10 minut) • •Přístroje jsou schopny přidávat vzorky a činidla v určité fázi reakčního času dle typu prováděného měření • •Přesná specifikace měřícím bodem sejmout0010 Typy měření: End point – jednobodové (měří se absorbance na konci reakce) sejmout0012 End point - dvojbodové (blank + konec reakce) sejmout0013 End point - tříbodové (např. pro ISE) Kinetické (rate) – měří se změna absorbance za časovou jednotku Při reakci dochází k nárůstu (stanovení CK) či poklesu absorbance (stanovení ALT, AST) sejmout0014 sejmout0003 Způsoby kalibrace: •Automatické analyzátory umožňují např. tyto typy •kalibrace: •Lineární dvoubodovou – pro fotometrické metody •Nelineární Logit-log 3P •Nelineární Logit-log 4P •Nelineární Logit-log 5P – pro turbidim. a imunoturb.m. •Nelineární exponenciální •Nelineární Spline •Isoenzym P •Isoenzym Q •Nelineární Point to Point •ISE (tříbodová) sejmout0017 sejmout0016 sejmout0007 sejmout0004 sejmout0009 sejmout0005 Ověření integrity výsledku: •Aby se zabránilo vydání nesprávného výsledku při extrémní koncentraci, analyzátory automaticky provádí zkoušky na ověření správnosti výsledku • •Není-li výsledek po technické stránce v pořádku, je označen chybovým hlášením a ve většině případů automaticky naředěn • •Používají se následující zkoušky: test na linearitu, • test na dodržení absorbančního limitu, test na kontrolu vyčerpání substrátu, test detekující Hook efekt •Test na linearitu •Je prováděn automaticky u všech kinetických metod •Linearita je kontrolována pomocí lineární regresní analýzy. Není-li splněna, vzorek je označen chybovým hlášením (př. Lin.) •Test na dodržení absorbančního limitu •Naměřená absorbance vzorku je tak vysoká, že nelze zajistit spolehlivé výsledky •U vzorků se objeví chybové hlášení a musí se ředit •Integrita výsledku je zajištěna nastavením absorbančního limitu •Test na kontrolu vyčerpání substrátu •Uplatňuje se absorpční limit i kontrola linearity •Není-li reakce lineární, do výpočtu jsou zahrnuty pouze body z lineární oblasti sejmout0024 sejmout0006 Test detekující Hook efekt -při nadbytku antigenu u imunoturbidimetrických stanovení (Prozone Check) -koncentrace antigenu je tak vysoká, že dochází k rozpouštění precipitátu sejmout0023 Test detekující Hook efekt •Objevuje se u imunoturbidimetrických stanovení •Koncentrace ve vzorku vysoká •Leží na pravé straně Heidelbergovi křivky •Chybně stanovená nízká koncentrace měřením absorbance je s využitím Prozone Check detekována a označena chybovým hlášením •Stanovení je pak znovu provedeno z menšího objemu nebo z naředěného vzorku •Prozone Check je nejčastěji proveden následovně: Po skončení reakce se stoupající směrnicí absorbance je přidán další definovaný objem antigenu. Absorbance je měřena před i po přidání antigenu (viz 1-Point Assay) •Vyjímečně – zpravidla stačí pracovní rozsah metody • Vybrané charakteristiky automatických analyzátorů •Minimální reakční objem: •významná charakteristika analyzátoru •Odvíjí se od něj cena za analýzu jednoho testu (100 – 180 ul - pro R1 činidlo) •Některé stroje reagencie předřeďují. Pracují pak s menším objemem a minimálními náklady (Avia 1650, Siemens) • •Minimální pipetovací objem – 2 ul: •Minimální objem se týká vzorku, kontrolních a kalibračních materiálů •Reagencie jsou pipetovány proti vzorku většinou minimálně v desetinásobném nadbytku •Při potřebě provést analýzu z menšího objemu vzorku (ředění) se vzorek předředí Pořadí přidávání reakčních komponent: •Existují dva typy pipetování •1. Nejdříve se pipetuje vzorek (jehla se musí dotknout dna) a potom činidlo - př. Analyzátory řady Cobas, Roche • •2. Nejprve se pipetuje činidlo (výplach jehly vodou), potom vzorek – př. analyzátory Integra, Roche • •Jednoreagenční metody jsou označovány jako „Sample start“ a dvoureagenční jako „Substrate start“ Technický limit – výsledky, které leží mimo technický limit jsou označeny chybovým hlášením a nesmí být vydány dokud nejsou zopakovány - nejčastěji po naředění Repeat limit – výsledky jsou technicky správně, jsou pouze mimo limit zvolený laboratoří pro opakování sejmout0008 Příklady parametrů používaných u automatické analýzy: •Analyzátor na klinickou chemii: •Minimální reakční objem: 180 µl •Objem vzorku: 2 – 35 µl •Vlnové délky: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800 nm •Reakční teplota: 37°C •Reakční čas: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 minut • • •Stanovení ISE: •Metody: Na, K, Cl •Objem vzorku: 15 µl •Objem diluentu:: 450ul/vzorek •Ředění: 1 : 31 •Objem vnitřního standardu: 1050 ul/vzorek •Referenční roztok: 130 ul/vzorek •Možnost korekce na nespecifické výsledky •Existuje možnost vložit korekční faktory – např. pro kreatinin, kdy se u Jaffého metody projevuje vliv reakce proteinů • • •Sérové indexy •Stupeň potenciální interference způsobené bilirubinem, hemoglobinem nebo lipémií lze stanovit - tzv. sérové indexy •Test je založen na měření naředěných vzorků při různých vlnových délkách Sérové indexy sejmout0015