Fluorescenční in situ hybridizace - postup



Materiál
•→ v naší laboratoři se zpracovává:
•
•kultivovaná kostní dřeň
•kultivovaná periferní krev
•kultivovaná plodová voda
•nekultivované amniocyty
•otisky kostní dřeně a tumoru
•
•

Denaturace a renaturace
obr1
zhotovení kvalitního preparátu obsahující cílové místo   (metafázní
   chromozómy, interfázní jádra, tkáňové preparáty, celé buňky)
.příprava a značení sond
.denaturace sondy
.denaturace cílového místa
.hybridizační reakce mezi sondou a cílovým místem
.odstranění nenavázané či nespecificky vázané sondy
…..barvení pozadí
…….vyhodnocení a zpracování  fluorescenčního signálu

nakapaná sklíčka – suspenze jader po kultivaci



DSCF7771
zestaršení preparátů
v roztoku 2xSSC při
37OC

dehydratace skel vzestupnou alkoholovou řadou



sušení zestaršených skel pod větráčkem



komerčně dodávané sondy



sklo s nakapanou suspenzí
sonda


sklo s nakapanou suspenzí + sonda dohromady



orámování preparátu chemoprénem






denaturace DNA a sondy
teplota závisí na typu sondy (75°C)
(přítomný formamid snižuje teplotu denaturace)

vložení skel do vlhké komůrky
- v termostatu pak probíhá sekvenčně specifická hybridizace


DSCF7798
inkubace skel  přes noc (1-2 dny) při 37OC


odmytí preparátů v 0,5xSSC - 4 min při 73OC



oplach preparátů v 2xSSC
DSCF7810


sušení preparátů ve tmě (v šuplíkuJ )



celo15h
celochromosomové sondy


jedinh
Lokus specifické sondy