BC_Enzymy_2011 1 Enzymy a Izoenzymy Analytika Principy metod a klinický význam Petr Breinek Logo MU 2 Enzymy - úvod •Biokatalyzátory(bílkoviny/makromolekuly,katalyzátory) •Snižují aktivační energii potřebnou pro chemickou reakci - urychlují reakce • •Účinnost je o mnoho řádů vyšší než u jiných katalyzátorů • Kdyby reakce v biologických systémech nebyly katalyzovány enzymy, byly by tak pomalé, že by nemohly zajistit existenci živé hmoty • • • enzymé „ v kvasinkách“ 1926 J.Sumner: ureasa (bílkovinná povaha) 1 buňka živých organismů obsahuje až 3000 druhů enzymů 3 •Řada enzymů má stejné nebo velmi podobné katalytické účinky, liší se v primární struktuře (složením aminokyselin). • Pokud tyto změny mají genetický základ, tak tyto rozdílné formy jednoho enzymu nazýváme izoenzymy • •Liší se fyzikálními, chemickými a imunologickými vlastnostmi • Izoenzymy 4 •Pokud jsou rozdíly ve struktuře způsobené sekundárními změnami, např. • - glykosylací • - tvorbou komplexů s imunoglobuliny • - nejsou to izoenzymy! Makroenzymy Obecné vlastnosti enzymů •Proteiny •Katalyzátory •Specifický účinek •Vysoká účinnost: •- účinnost o mnoho řádů vyšší než u jiných katalyzátorů •- reakce s enzymem jsou o 106-1014 rychlejší než bez enzymu •Mohou být regulovány Jak reaguje enzym se substrátem •vazba substrátu do aktivního místa vyvolá odpovídající konformační změnu molekuly enzymu •vytvoří se komplex enzym-substrát Enzymatická reakce probíhá v několika stupních •Tvorba komplexu enzym-substrát: E + S ↔ ES •Aktivace komplexu ES: ES ↔ ES* •Chemická přeměna substrátu, přičemž vzniká komplex enzym-produkt: ES* ↔ EP •Oddělení enzymu od reakčního produktu: • EP ↔ E + P 7 Aktivní (katalytické) centrum enzymu •Skupina atomů na povrchu molekuly enzymu, na které se váže substrát •Nejčastěji několik zbytků aminokyselin s reaktivními skupinami ve vedlejších řetězcích •Vytváří prostorové a vazebné podmínky pro navázání substrátu a jeho aktivaci pro určitou reakci •Vazba aktivního centra na substrát je vysoce specifická •U mnoha enzymů nestačí samotné aktivní centrum pro vazbu substrátu, substrát se váže i prostřednictvím koenzymu 8 Základní pojmy •Reakce: S ¾® P (S = substrát, P = produkt) •Definice reakční rychlosti: 9 10 •1. Teplota ( 25 - 30 - 37 oC) •2. Pufr (pH, iontová síla, typ pufru) •3. Koncentrace substrátu •4. Koncentrace koenzymu •5. Moderátory enzymové aktivity –inhibitory (kompetitivní a nekompetetivní) –aktivátory • Faktory ovlivňující enzymovou reakci Na čem závisí rychlost reakce? •Na koncentraci substrátu •Na teplotě •Na přítomnosti efektoru (aktivátoru, inhibitoru) 11 Závislost reakční rychlosti (vo) na koncentraci substrátu [S] 12 Při nízkých koncentracích substrátu se reakce řídí kinetikou 1. řádu Při vysokých koncentracích substrátu se reakce řídí kinetikou 0. řádu 13 • Øbílkovinná část apoenzym Ønebílkovinná část kofaktor • • Kofaktor: •Prostetická skupina ( Mg2+, Zn2+, organické látky ve formě vitaminů,… ): pevně vázaná •Koenzym (NAD+, P5P): vázán slabě /disociovatelná molekula Složení enzymové molekuly Metaloenzymy •Obsahují funkční kovové ionty, které se přímo účastní katalyzované reakce, ionty kovu vázány poměrně pevně •Některé enzymy potřebují ionty kovů pouze k aktivaci,v tom případě jsou vázány slabě, ionty dvojmocných kovů, Ca2+ (koagulační faktory), Mg2+ (kinázy),… 14 Kofaktory enzymů •Nízkomolekulární neproteinové sloučeniny •Přenášejí 2H nebo e- ® oxidoreduktázy •Přenášejí skupiny ® transferázy •Pevně vázané - prostetická skupina •Volně vázané - koenzymy 15 Vitamin Kofaktor Funkce kofaktoru Nikotinamid Nikotinamid Riboflavin ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- NAD+ NADPH + H+ FAD tetrahydrobiopterin molybdopterin lipoát ubichinon hem cytochromů nehemové Fe a S 2 GSH akceptor 2H donor 2H akceptor 2H donor 2H přenos elektronů akceptor 2H přenos 2 elektronů (a 2H+) přenos 1 elektronu přenos 1 elektronu donor 2H Vitaminy a kofaktory oxidoreduktáz 16 Kofaktory oxidoreduktáz vždy existují ve dvou formách oxidovaná D redukovaná tvoří redoxní pár 17 Vitamin Kofaktor Přenášená skupina --- --- Listová kyselina Biotin Thiamin Pyridoxin Pantothenová kyselina --- [Methionin] Kyanokobalamin ATP PAPS H4-folát karboxybiotin thiamindifosfát pyridoxalfosfát CoA-SH dihydrolipoát SAM methylkobalamin -PO32- -SO32- C1 skupiny CO2 aldehydová -NH2 acyl acyl -CH3 -CH3 Vitaminy a kofaktory transferáz 18 Inhibice enzymů (snížení aktivity) •Ireverzibilní •Inhibitor pevně vázán na enzym (akt. místo) •organofosfáty •ionty těžkých kovů •kyanidy •Reverzibilní •Inhibitor volně vázán •Rovnováha E+I Û E-I •Inhibitor lze odstranit (dialýza, gel. filtrace) •Dva základní typy: kompetitivní • nekompetitivní 19 Kompetitivní inhibice •inhibitor je strukturně podobný substrátu •váže se do aktivního místa •soutěží s fyziologickým substrátem o vazebné místo 20 Příklad: Otrava methanolem se léčí ethanolem Enzym je kompetitivně inhibován netoxickým substrátem na úkor toxického substrátu 21 Nekompetitivní inhibice •Inhibitor se váže mimo aktivní centrum na E i na komplex E-S •Km se nemění (aktivní místo je volné pro substrát) •Vmax se snižuje, protože klesá koncentrace funkčního komplexu E-S 22 Příklad: léky •Mnohá léčiva jsou inhibitory enzymů •Statiny (HMG-CoA reduktáza) – hypolipidemika, snižují syntézu cholesterolu (lovastatin) •Inhibitory ACE (angiotensin konvertující enzym) – léčba hypertenze (enalapril) •Antibiotika inhibují enzymy nutné pro určitý životní děj bakterií •Peniciliny – inhibují transpeptidázy (výstavba buněčné stěny) •Tetracykliny, makrolidy, chloramfenikol – inhibice proteosyntézy 23 24 Názvosloví enzymů •4 Triviální / historické Diastáza 4 Obecně užívané a-Amyláza ( AMS) 4 Systémové (vědecké) • 1,4-a-D-glukan glukanohydroláza, EC 3.2.1.1. • • •ENZYME COMMISSION International Union of Biochemistry and Molecular Biology •EC 3. TYP KATALYZOVANÉ REAKCE •EC 3.2.1. SUBSTRÁTY •EC 3.2.1.1. KATALOGOVÉ ČÍSLO • 25 Třídění enzymů • 1.Oxidoreduktázy (LD, GLDH, CHOD) 2. Transferázy (AST, ALT, GGT,CK) 3. Hydrolázy (ALP, LPS, AMS, CHE) 4. Lyázy (NSE) 5. Ligázy (Syntetázy) 6. Izomerázy Množství enzymu v biologickém materiálu lze vyjádřit dvojím způsobem •Nepřímé stanovení •katalytická koncentrace aktivity •μkat/l •stanoví se produkt enzymové reakce •většina klinicky významných enzymů •Přímé stanovení •hmotnostní koncentrace •μg/l, ng/l •stanoví se molekula enzymu jako antigen (imunochemicky) •např. tumorové markery, ALP kostní Metody stanovení katalytické koncentrace aktivity enzymu •Kinetické •Spektrofotometrické stanovení rychlosti enzymové reakce kontinuálním měřením absorbance v závislosti na čase •Průběžně se měří [S] nebo [P] •Řada měření •Konstantního času •-„dvoubodové stanovení“ • -„end-point“ •Měří se [P] po proběhnutí reakce •Jedno měření •nedoporučovány a 28 • Optický test • měříme změny absorbance v UV-oblasti • (při 340 nm) způsobené změnami koncentrace redukovaných forem koenzymů NADH + H+ nebo NADPH + H+ NAD NADH 29 Princip optický test ABSORBANCE VLNOVÁ DÉLKA Stanovení katalytické koncentrace aktivity enzymu •Optimální podmínky (teplota, pH, kofaktory) •Měří se D[S] nebo D[P] v určitém časovém intervalu •Kinetika 0. řádu, [S] >> Km Þ nasycený enzym, rychlost je konstantní, blíží se Vmax 30 31 Enzymy prubeh 1 Vliv časového intervalu, ve kterém měříme 32 Enzymy prubeh 2 vyčerpání substrátu Rozšíření linearity n n t1 t2 A B A Čas (t) R1 R2 S Flex rate Flex rate 34 • • Katalytická aktivita enzymu jednotka katal (kat) definice: 1 kat = 1 mol/s • Katalytická koncentrace aktivity enzymu jednotka: kat/l používané jednotky: mkat/l a nkat/l jiné jednotky: U/l 1 mkat/l = 60 U/l 1 U/l = 0,0167 mkat/l Vyjadřování výsledků měření Jaká je povolená chyba v EHK? 35 Enzym TMU (SEKK 2011) TMU teoretické ALP 21% 12% AMS 15% 15% AST 15% 15% ALT 15% 32% CK 21% 30% GGT 20% 22% LD 21% 11% LPS 24% 29% CHS 21% 8,9% PAMS 21% 18% ACPP 21% CKMB mass 30% •Referenčními metodami / postupy • RMP Reference Method Procedure • •Validovanými metodami v expertních laboratořích • AV Assigned Value • •Jako průměr výsledků měření všech účastníků po vyloučení odlehlých hodnot • ALTM All Laboratory Trimmed Mean • •Průměr výsledků měření stejnorodých skupin účastníků po vyloučení odlehlých hodnot • ConV Consensus Value Jak se získávají cílové hodnoty? AST: výpočet teoretické TMU 37 (CVw) Intraindividuální biologická variabilita* 11,9% (CVa) Přesnost odvozená z biologických variabilit 6,0% (CVg) Interindividuální biologická variabilita* 17,9% (b) Systematická chyba (bias) odvozená z biologických variabilit 5,4% (CVb) Celková biologická variabilita 21,5% Celková chyba (TE) odvozená z biologických variabilit Teoretická TMU (cílová nejistota měření) 15,2% www.westgard.com Variabilita (proměnlivost) TE = |b| + 1,65.CVa = 0,25.CVb + 1,65.0,5.CVw (%) a b c Jaké jsou doporučené metody? 38 Enzym Referenční metoda Certifikovaný referenční materiál ALP IFCC metoda JC ERM 20327 AMS IFCC metoda ERM-AD456 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 AST IFCC/IRMM metoda JC-ERM 20327 ALT IFCC/IRMM metoda ERM-AD454 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 CK IFCC/IRMM metoda ERM-AD455 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 GGT IFCC/IRMM metoda ERM-AD452 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 LD IFCC metoda ERM-AD453 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 LPS CHS PAMS IFCC metoda ERM-AD456 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 ACPP CKMB mass 39 Metody IFCC a primární CRM •GGT IRMM/IFCC 452 (ERM-AD 452) •LD IRMM/IFCC 453 (ERM-AD 453) •ALT IRMM/IFCC 454 (ERM-AD 454) •CK IRMM/IFCC 455 (ERM-AD 455) •AMS IRMM/IFCC 456 (ERM-AD 456) •AST IRMM/IFCC „new“ •ALP • 40 •Primární referenční měřící postupy,SOP •CRM pro enzymy + sekundární CRM •Mezinárodní srovnání referenčních laboratoří •Akreditace kalibračních laboratoří •Mezinárodní síť referenčních laboratoří •Společné referenční intervaly a rozhodovací limity • IFCC standardizace (+37oC) 41 Kalibrace * Primární CRM * Sekundární CRM * Pracovní kalibrátory výrobců • * Pracovní kalibrátory uživatelů • * Kalibrační faktor vypočítaný z teoretického molárního absorpčního koeficientu nebo stanoveného experimentálně • 42 Aspartátaminotransferáza (AST) •L-aspartát + 2-oxoglutarát « oxalacetát + L-glutamát Je obsažena v cytoplasmě a v mitochondriích všech buněk ( zvláště hepatocytů,buněk srdečního svalu, ledvin a kosterních svalů) 43 AST EC 2.6.1.1 L-aspartát: 2-oxoglutarát aminotransferáza Klinický význam • onemocnění myokardu (nekróza, AIM) • jaterní choroby • onemocnění kosterního svalstva 44 AST •L-aspartát + 2-oxoglutarát « oxalacetát + L-glutamát •oxalacetát + NADH + H+ → L-malát + NAD+ • MDH • •SPEKTROFOTOMETRICKY - pokles absorbance NADH při 340 nm • pyruvát + NADH + H+ Þ L-laktát + NAD+ •koenzym: pyridoxal-5-fosfát + ApoAST Þ AST* •doporučuje se předinkubace 10 min při +37oC • start : 2-oxoglutarát ( 2 činidlová metoda) •start : sérum ( 1 činidlová metoda) 45 Alaninaminotransferáza (ALT) • • L-alanin + 2-oxoglutarát Û pyruvát + L-glutamát • • • • • Je obsažena v cytoplasmě všech buněk, zvláště hepatocytů, buněk srdečního svalu, ledvin a kosterních svalů 46 ALT Klinický význam • onemocnění jater (infekční virová hepatitida, mononukleóza, chronické jaterní choroby,…) • onemocnění žlučových cest • dekompenzované srdeční vady (venostáza v játrech) • poškození svalstva 47 ALT •L-alanin + 2-oxoglutarát Û pyruvát + L-glutamát •pyruvát + NADH + H+ Þ L-laktát + NAD+ • LD • •SPEKTROFOTOMETRICKY - pokles absorbance NADH při 340 nm • •pyruvát + NADH + H+ Þ L-laktát + NAD+ •koenzym: pyridoxal-5-fosfát + ApoALT Þ ALT* •doporučuje se předinkubace 10 min při +37oC • start : 2-oxoglutarát ( 2 činidlová metoda) •start : sérum ( 1 činidlová metoda) 48 Alfa-amyláza (AMS) •štěpí a-1,4 glykozidické vazby • • • • • •Polysacharidy Þ Oligosacharidy Þ Maltóza •AMS je sekreční enzym vytvářený pankreatem a slinnými žlázami, (část vzniká v játrech, plících) •Sérum obsahuje přibližně stejnou katalytickou koncentraci pankreatického a slinného izoenzymu. 1-6branch2 49 AMS Klinický význam • onemocnění pankreatu (akutní pankreatitida) • onemocnění slinných žláz ( parotitis) • přítomnost makroamylasového komplexu • onemocnění jater • ledvinná nedostatečnost 50 • • Doporučená metoda IFCC • •substrát : EPS-G7-PNP (EPS) •4,6-ethyliden(G7)-4-nitrofenyl(G1)-a-(1,4)-D-maltoheptaosid • 51 • 4 Maltoheptaosid Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο 7 glukóz • 4+ a-Glukosidáza • 4 substráty značené 4-nitrofenolem na konci molekuly • Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- ¢ • • 4 na opačném konci molekuly substrátu navázána např. ethylidenová skupina Þ „blokovaný“ substrát • ¢- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο-¢ • 52 •1 molekula EPS •4,6-ethyliden(G7)-4-nitrofenyl(G1)-a-(1,4)-D-maltoheptaosidu 4. • •7 molekul glukózy + 1 molekula 4-nitrofenolu • •SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE 4-NITROFENOLU 405 nm • 53 • 4 druhý doporučený substrát: (CNP-G3 také Cl-G3-PNP) • • 2-chloro-4-nitrofenyl-a-D-maltotriosid • 54 Izoenzymy AMS • SLINNÝ • PANKREATICKÝ • (geneticky podmíněný polymorfismus) •4 MAKROAMYLÁZOVÝ komplex = komplexy glykosylovaných izoenzymů s imunoglobulíny a jinými bílkovinami v séru • Mr = 400 000 až 2 000 000 • Þ způsobuje zvýšení hodnot AMS v krevním séru 55 •Metody stanovení 1.Selektivní INHIBICE isoenzymů monoklonálními protilátkami, např. stanovení pankreatické AMS 2. 2.ELEKTROFORÉZA 3.CHROMATOGRAFIE 4.IZOELEKTRICKÁ FOKUZACE 5.INHIBIČNÍ metody • 56 ALP monoestery kyseliny o-fosforečné + H2O b alkohol / fenol + fosfátový anion V séru dospělých zdravých osob převažují jaterní a kostní izoenzymy (přibližně 1:1) u dětí je zvýšena aktivita kostního izoenzymu, u těhotných žen je detekovatelný placentární izoenzym a u osob s krevní skupinou 0 a B jsou přítomny stopy střevního izoenzymu. Vyskytuje se prakticky ve všech tkáních, je součástí buněčných membrán 57 Hydrolýza R-OPO(OH)2 + H2O → R-OH + H3PO4 Transfosforylace (přenos fosfátové skupiny na jiný alkohol za vzniku esteru) R-OPO(OH)2 + R´-OH « R-OH + R´-OPO(OH)2 58 Klinický význam: • onemocnění jater • onemocnění žlučových cest • onemocnění kostí • fyziologicky zvýšené hodnoty: rostoucí děti a těhotné ženy (max. 3 trimestr těhotenství) • zánětlivé střevní choroby 59 Metody stanovení: Substrát: 4-NITROFENYLFOSFÁT 4-NITROFENYLFOSFÁT + H2O →4-NITROFENOL+ fosforečnan SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE 4-NITROFENOLU při 405 nm 60 •pufr AMP ( 2-amino-2-methyl-propanol) •pufr MEG ( N-methylglukamin) • 61 1.Imunochemicky ( kostní izoALP) 2. 2.ELEKTROFORÉZA 3.INAKTIVAČNĚ - INHIBIČNÍ metody 4.srážení LEKTINEM ( kostní izoenzym) • Izoenzymy ALP 62 Kreatinkináza (CK) EC 2.7.3.2 AT:kreatin-N-fosfotransferáza Kreatinfosfát + ADP « Kreatin + ATP V cytoplazmě a mitochondriích buněk kosterního svalstva, srdce, mozku a hladké svalovině (Poznámka: erytrocyty neobsahují CK) v myokardu: 80% CK-MM a 20% CK-MB v kosterním svalstvu: 98% CK-MM a 2% CK-MB(!) 63 Klinický význam: • onemocnění kosterního svalstva • onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu) • onemocnění centrální nervové soustavy (CNS) 64 Metody stanovení: IFCC (37°C) Kreatinfosfát + ADP Þ Kreatin + ATP ATP + D-Glukóza Þ ADP + D-Glukózo-6-fosfát Hexokináza D-GLU-6-P + NADP+ Þ D-Glukonát-6-P+NADPH+H+ G6PD SPEKTROFOTOMETRICKY -nárůst absorbance NADPH při 340 nm Reaktivace: N-ACETYL CYSTEIN ( NAC) 65 Izoenzymy CK CK se skládá ze 2 podjednotek (dimer; Mr=40 000): M ( muscle) a B (brain) kombinací vznikají 3 izoenzymy:CK-MM, CK-MB, CK-BB je možné detekovat i makroenzym: CK- makro Izoformy izoenzymů: vznikají odštěpením koncových lysinových molekul CK-MB1 (žádný lysin) a CK-MB2 (1 lysin) CK-MM1 (žádný lysin), CK-MM2 (1 lysin) a CK- MM3 (2 lysiny) 66 Metody stanovení: 1.IMUNOCHEMICKY CK-MB mass (hmotnostní koncentrace) CK-MB mass: zvyšuje se asi o 1h dříve než CK-MB aktivita je kardiospecifický vyšší analytická citlivost stanovení 67 Předpoklad: CK-BB v séru nepřítomen (=0) potom: pokud CK-BB = 0 (nepřítomen) a CK-MM = 0 ( inhibice) stanovíme aktivitu CK-B (tj.polovinu přítomného CKMB) CK-MB = 2 x CK-B 2. IMUNOINHIBIČNĚ (s protilátkou proti M-podjednotkám CK) 68 Izoenzymy CK 69 Laktátdehydrogenáza (LD) •Cytoplasmatický enzym, který katalyzuje reakci anaerobní glykolýzy, to vysvětluje přítomnost LD ve všech tkáních. • pyruvát + NADH + H+ « laktát + NAD+ • •Zvýšení jeho aktivity v krvi není orgánově specifické LD 70 Klinický význam: •onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu, myokarditida) •onemocnění svalů •hemolytická a perniciozní anémie •onemocnění jaterního parenchymu •maligní choroby (tumory, leukémie) Zvýšení jeho aktivity v krvi není orgánově specifické → stanovení dnes slouží spíše k vyloučení onemocnění 71 Metody stanovení: 1. 1.IFCC (37°C) Substrát: L-laktát L-laktát + NAD+ → pyruvát + NADH + H+ SPEKTROFOTOMETRICKY -nárůst absorbance NADH při 340 nm 2. 2.Substrát: pyruvát pyruvát + NADH + H+ → L-laktát + NAD+ SPEKTROFOTOMETRICKY -pokles absorbance NADH při 340 nm 72 Izoenzymy LD •Aktivní enzym je tetramér - skládá se ze 4 podjednotek • •Existují 2 druhy podjednotek: • M( muscle/sval) a H (heart/srdce) • •Kombinací vzniká 5 izoenzymů : • LD1 H4 LD2 H3M LD3 H2M2 LD4 HM3 LD5 M4 73 Izoenzymy LD 74 Detekce izo LD na elektroforeogramu L-laktát + NAD+ → pyruvát + NADH + H+ NADH + H+ + tetrazoliová sůl → NAD+ + FORMAZAN NBT,INT nerozpustný + PMS (fenazinmetosulfát) 75 GGT Katalyzuje přenos g-glutamylového zbytku z g-glutamylpeptidů na jiný akceptor (např. peptid nebo aminokyselinu) GMT je vázána na cytoplasmatické membrány epitelu žlučových cest, ledvinných tubulů, jater, pankreasu, střeva, erytrocytů,…) V krvi dokazatelný enzym je převážně jaterního původu. 76 Klinický význam: • onemocnění jater • obstrukce žlučových cest • sekundární nádory jater • monitorování chronického alkoholismu (poškození jater alkoholem) 77 1.IFCC (37°C) Substrát: g-L-glutamyl-3-karboxy-4-nitranilid (GLUCANE) • GLUCANE + Glygly → GLU-Glygly + 5-A-2NB 5-AMINO-2-NITROBENZOÁT Glygly = GLYCYLGLYCIN 78 LPS TRI- a DIACYLGLYCEROLY + H2O → GLYCEROL + 3-,2 MK Výskyt: pankreatická lipáza jaterní lipáza lipoproteinová lipáza,… 79 Klinický význam: • detekce a vyloučení akutní pankreatitidy (4-6 h, maximum 24h, 8-14 d normalizace) • chronická pankreatitida ( relapsující) • obstrukce pankreatického traktu • 80 1. TURBIDIMETRICKÉ: štěpení emulze trioleinu lipasou za přítomnosti kolipasy a deoxycholanu, měří se úbytek absorbance (snížení zákalu) při 340 nm (UV- oblast) KOLIPASA je protein secernovaný z pankreatu, váže se s lipasou 1:1 ke žlučovým kyselinám na povrchu emulgovaných kapének TG, umožňuje štěpení TG působením lipasy 81 2. Chromogenní štěpení syntetických substrátů a) substrát : 1,2-DIGLYCERID 1,2-diglycerid + H2O → 2-monoglycerid + mastná kyselina 2-monoglycerid + H2O → glycerol + mastná kyselina glycerol + ATP → glycerol-3-fosfát + ADP Glycerol-3-fosfát+ O2 → dihydroxyacetonfosfát + H2O2 2 H2O2 + 4-AAP + deriv.fenolu → 4 H2O + barevný derivát 82 b) substrát : 1,2-o-DILAURYL-rac-GLYCERO-3-GLUTARIC ACID-(6´-METHYLRESORUFIN) ESTER DGGR (patent Roche) DGGR → 1,2-o-DILAURYL-rac-glycerol + GLUTARIC ACID-6´-METHYLRESORUFIN ESTER GLUTARIC ACID-6´- METHYLRESORUFIN ESTER Þ GLUTARIC ACID + METHYLRESORUFIN chromogen SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE METHYLRESORUFINU při 580 nm 83 Cholinesterázy (CHE) estery CHOLINU + H2O → CHOLIN + příslušná kyselina • Acetylcholinesterázy acetylcholin + H2O → CHOLIN + CH3COOH jsou obsaženy v erytrocytech, mozku, plících, štěpí přednostně acetylcholin (nervová zakončení) • Pseudocholinesterázy (butyrylcholinesterázy) pocházejí z ribosomů jaterních buněk → krev → sérum a plazma hydrolýza 84 Klinický význam: Patologické je především snížení aktivity. • poruchy proteosyntézy - těžké hepatopatie - hladovění organismu • otravy organofosfáty a karbamáty (nekompetetivní inhibitory cholinestráz) • vrozené chybění, atypické varianty 85 Metody stanovení: butyrylthiocholin + H2O → thiocholin + butyrát thiocholin + DTNB Þ 5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina žluté zbarvení DTNB = kyselina 5,5´dithio-bis-nitrobenzoová Ellmanovo činidlo 86 Metody stanovení: acetylthiocholin + H2O → thiocholin + acetát thiocholin + DTNB Þ 5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina 87 ACP monoestery kyseliny o-fosforečné + H2O b alkohol / fenol + fosforečnan ACP katalyzuje stejnou chemickou reakci jako ALP optimální pH je < 7,0 V séru lze dokázat prostatický a kostní izoenzym, dále malé množství jaterního,erytrocytárního a trombocytárního izoenzymu. ACP není v séru/plazmě stabilní ! 88 Klinický význam: • onemocnění prostaty ( karcinom) • některá kostní onemocnění (tumory a metastázy) • chronická ledvinná nedostatečnost ACPP je pro dg.ca prostaty nahrazeno imunochemickým stanovením PSA 89 ACP Metody stanovení: 1.Substrát: 4-NITROFENYLFOSFÁT 4-NITROFENOL v kyselém prostředí není barevný, pro stanovení používalo manuální provedení (end-point) po zastavení enzymové reakce např. roztokem NaOH 2.Substrát: 1-NAFTYLFOSFÁT 1-NAFTYLFOSFÁT + H2O Þ 1-NAFTOL + fosforečnan 1-NAFTOL + diazoniová sůl Þ azobarvivo 90 Enzymy v moči 1. AMS 2. NAG ( N-acetyl-beta-glukózaminidáza) TUBULÁRNÍ postižení LEDVIN 91 Enzymy -Tumorové markery NSE (neuronspecifická enoláza) cytoplazmatický, glykolytický izoenzym enolázy (katalyzuje přeměnu 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát) TK (thymidinkináza) enzym podílející se na syntéze DNA ukazatel buněčné proliferace