Lékařská mikrobiologie ZDRL Týden 10: Úvod do sérologie, aglutinace, precipitace a komplementfixace; ředění séra Lenka Černohorská dle původních prezentací O. Zahradníčka Úvod nAntigen = makromolekula pocházející z cizího organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha. Mikrobiální antigeny = části mikrobiálního těla, které vzbuzují v hostiteli antigenní odpověď nProtilátka = imunoglobulin, tvořený v těle hostitele jako odpověď na antigenní výzvu (nejen u člověka, ale i u zvířat) n Metody lékařské mikrobiologie nPřímé metody: detekce mikroba, jeho části nebo produktu. Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita = agens je NYNÍ přítomno. nNepřímé metody: detekce protilátek proti mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal hostitele v minulosti (nevíme, zda před týdny/měsíci/roky) Dva způsoby využití: Průkaz antigenu: laboratorní protilátky + vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda Antigen a protilátka II Antigen a protilátka I nU přímého průkazu rozlišujeme: nPrůkaz antigenu ve vzorku, např. v mozkomíšním moku. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v.těle pacienta nAntigenní analýza (identifikace) kmene izolovaného ze vzorku (např. meningokoka) n nU nepřímého průkazu pracujeme se vzorkem séra, kde hledáme protilátky. Odhadujeme, kdy se pacient s mikrobem setkal: nMnožství protilátek (relativní – titr) nTřída protilátek: IgM/IgG (více v další přednášce) n(Avidita protilátek) n Průběh infekce nAkutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM nPacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť) nChronická infekce: různé možnosti IgM a IgG 1 1 2 2 Jak provést reakci „kvantitativně“ nJe těžké zjistit koncentraci protilátek v jednotkách mol/l, mg/l apod. Ale dá se mnohonásobně ředit pacientovo sérum. nReaguje-li i po mnohonásobném ředění à à v séru je velké množství protilátky nReaguje jen při nevelkém zředění séra à à jen malé množství protilátky Geometrická řada nNejjednodušší způsob, jak ředit sérum pacienta, je použití geometrické řady s koeficientem dva. nVycházíme z neředěného séra, nebo ze séra o určitém předředění (např. 1:5, 1:10, 1:20 atd.) nV každém dalším důlku je dvojnásobné ředění oproti předchozímu, např. řada 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160… Počítání ředění v serologii nPozor, v serologii např. ředění 1 : 4 znamená 1 díl séra a 3 díly fyziologického roztoku (tj. 4 díly celkem)! nPři „biochemickém“ počítání (počet dílů séra ku počtu dílů diluentu) bychom naše geometrické řady museli značit např. 1:9, 1:19, 1:39, 1:79. To by bylo nepraktické Geometrická řada: a) bez předředění původního séra C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Geometrická řada.bmp b) s předředěním původního séra nPředředění nemusí být zrovna 1 : 100, může být třeba 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20 či jiné. C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Geometrická řada 2.bmp Poté, co se provede naředění… nPo naředění séra geometrickou řadou se do všech zkumavek/důlků přidá antigen. Buď dojde, nebo nedojde k reakci; to může být vidět, nebo se zviditelňuje přidáním další složky nSledujeme, jak moc můžeme sérum naředit, aby ještě byla viditelná pozitivní reakce Pojem TITR Titry Titr – nejvyšší ředění, kde je ještě viditelná pozitivní reakce. I pokud jsme reakci provedli ve 2 řádcích místo 1 (s různým počátečním předředěním), určí se jen 1 titr. Vzestup/pokles titru o 1 důlek znamená dvojnásobný vzestup/pokles. Proč nestačí samotný titr nMálo reaktivní pacient může mít v.akutní fázi titr dosti nízký Dva pacienti Velmi reaktivní pacient má naopak i dlouho po infekci titr relativně vysoký Párová a nepárová séra nPárová séra = 1 vzorek je uchováván v.ledničce, dokud nepřijde i druhý. Pak jsou oba hodnoceny naráz. 4-násobný vzestup se v tom případě má za signifikantní pro akutní infekci. Bohužel párová séra nejsou běžná. nSéra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto zpravidla vyžadujeme 8-násobný vzestup titru. Tyto údaje se liší případ od případu. Serologické reakce nExistuje několik typů reakcí. Některé jsou jednoduché, výsledek reakce antigenu s protilátkou je přímo viditelný, jiné jsou složité, je nutné přidání dalších složek nTéměř všechny mohou být použity k průkazu antigenu, k antigenní analýze i k průkazu protilátky; ne všechny se ale ke všem těmto účelům doopravdy používají nV rámci reakcí existují různé možnosti technického provedení Typy reakcí a jejich využití Průkaz antigenu Antigenní analýza Nepřímý průkaz Aglutinace občas často někdy Precipitace málokdy málokdy občas KFR často (viry) ne často (viry) Neutralizace občas ne často Značené složky velmi často výjimečně velmi často Precipitace, aglutinace, aglutinace na nosičích nPrecipitace: Antigeny jsou ve formě izolovaných makromolekul (koloidní antigen) nAglutinace: Antigen je součástí buňky mikroba (pracujeme tedy s.celými mikroby) nAglutinace na nosičích: Původně izolované antigeny jsou navázány na nosič (latex, erytrocyt, polycelulóza) Precipitace n Se využívá v nepřímém průkazu: nReakce RRR u syfilis (je to reakce s tzv. heterofilním antigenem, t.j. antigen nepochází z mikroba) nMikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho (u aspergilózy, dříve i u toxoplasmózy) nV přímém průkazu se používala prstencová precipitace u streptokoků Precipitace RRR precipitace nDetekce protilátek, které jsou pozitivní u syfilis, i když nejde o protilátky proti Treponema pallidum, nýbrž proti kardiolipinu (látka, která se objevuje u syfilitiků v těle) nTakovým reakcím říkáme průkaz heterofilních protilátek – jsou to protilátky, které nejsou zaměřené proti antigenu mikroba, ale proti jinému antigenu, který je v době výskytu mikroba přítomen v.těle pacienta. nReakce je dost citlivá, ale málo specifická (pozitivita se ověřuje jinými, spolehlivějšími metodami) Mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho nV prostředním důlku je suspenze antigenu. Do 4 ostatních důlků se dají séra pacientů. Antigen difunduje z prostředního důlku do okolí. Je-li sérum pozitivní, difundují z něj protilátky. Uprostřed cesty se antigen s protilátkou setká a vznikne precipitační linie. ouchterlony + - - - Prstencová precipitace nPrecipitace k detekci antigenu: n1) zvířecí sérum s protilátkami se napipetuje do pipetky zabodnuté do plastelíny n2) čtyři různé extrakty kmenů se opatrně převrství na séra (aby se nesmíchaly) n3) při pozitivitě se na styku tekutin objeví prstenec – důkaz precipitace Prstencová Aglutinace: příklady použití nK antigenní analýze: nurčení serotypu u střevních patogenů, zejména salmonel, shigel a yersinií, určení některých serotypů Escherichia coli n Provedení: smíchání kmene (nebo jeho suspenze ve fyziologickém roztoku) s příslušným sérem nK přímému průkazu ve vzorku se používá spíše aglutinace na nosičích (viz dále) n nNepřímý průkaz různých bakterií (yersinií, tularémie). Provedení: v mikrotitrační destičce s využitím ředěných sér pacienta Aglutinace Antigenní analýza pomocí aglutinace: Průkaz Enteropatogenní Escherichia coli nVětšina kmenů E.coli je „hodných“. Ze všech antigenních typů E. coli je 12 „enteropatogenních“ (EPEC) – způsobují novorozenecké průjmy. nPři testu smícháme suspenzi podezřelého kmene s protilátkami na sklíčku. Pozitivita se projeví jako vznik vloček. Bylo by nutno provést 12 testů s různými protilátkami. V praxi ale použijeme polyvalentní séra: nonavalentní obsahuje protilátky proti 9 typům EPEC, trivalentní proti dalším 3. Průkaz EPEC – výsledek Clumping faktor Aglutinace k průkazu protilátek v mikrotitrační destičce nPozitivní – nepravidelný chuchvalec (aglutinát) nNegativní – malé pravidelné kolečko (neaglutinované bakterie sedimentují na dno) Aglutinace !!Titr = nejvyšší ředění s pozitivní reakcí. První důlek je ředěn 1 : 2, druhý 1 : 4 atd. Příklad výsledku: aglutinace k detekci protilátek proti yersiniím nK+ pozitivní, titr = 1 : 200 nČ. 1 negativní nČ. 2 pozitivní, tit. = 1 : 400 nČ. 3 negativní nČ. 4 pozitivní, titr = 1 : 200 1:100 1:200 1:400 1:800 Konkrétní ukázka Tularemie detail V prvním sloupci jsou kontroly, vlastní reakce začíná od druhého sloupce 1:2 1:4 1:8 www.medmicro.info Aglutinace na nosičích nJe to vlastně precipitace převedená na aglutinaci použitím nosiče (červená krvinka, latexová či polycelulózová částice). nPoužíváme ji tam, kde pracujeme s koloidním (makromolekulárním) antigenem Aglutinace na nosičích Aglutinace na nosičích – využití nPřímý průkaz ve vzorku nprůkaz antigenů bakterií, které způsobují záněty mozkových blan, přímo ve vzorku mozkomíšního moku nAntigenní analýza s kmeny bakterií nskupinové určení streptokoků nurčení antigenního typu u Haemophilus influenzae nurčení seroskupiny meningokoků aj. nK nepřímému průkazu méně často, příkladem je reakce TPHA k průkazu protilátek u syfilis Aglutinace na nosičích Treponema pallidum hemaglutinace (TPHA) k průkazu syfilis nPoužijeme červené krvinky, na které je navázán antigen T. pallidum (Dnes se v tomto testu červené krvinky nahrazují polycelulózovými částicemi – v tom případě jde o TPPA (T. p. polyceluózová aglutinace) nJde o nepřímý průkaz, ale nepoužívá se ředění a nezjišťují titry. Jde o tzv. screeningovou reakci a případná pozitivita se dále ověřuje spolehlivějšími metodami Ukázka výsledku TPHA nV horním řádku jsou pozitivní kontroly od vysoce pozitivní (+++) po hraniční (+/-) nVe druhém řádku jsou negativní kontroly nVýsledky se odečítají v dalších řádcích, vždy ve čtvrtém sloupci. Pacienti 1, 2 i 3 jsou negativní. TPHA detail +++ ++ + +/- - - - - nsoučást nespecifické humorální imunity nsložitý kaskádový systém C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\KFR\02 komplement.bmp http://img.tfd.com/dorland/thumbs/complement.jpg Komplement Komplementfixace (KFR) nKomplement = složka imunitní reakce nPotřebujeme pracovat s přesně odměřeným množstvím komplementu, proto pacientův vlastní komplement před reakcí inaktivujeme a do reakce používáme komplement morčecí nKomplement není schopen vázat se na samotný antigen ani na samotnou protilátku nKomplement je schopen vázat se pouze na KOMPLEX obou Princip komplementfixace nKomplement se váže na komplex antigen-protilátka (nezůstává žádný volný komplement) To ale není vidět. nProto používáme tzv. indikátorový komplex – beraní erytrocyty + králičí protilátky proti nim (tzv. amboceptor). Pokud zbyl volný komplement, naváže se na indikátorový systém a dojde k hemolýze Pokus k ověření funkce komplementu nAmboceptor = králičí protilátka proti beraním erytrocytům 1.Beraní ery + amboceptor bez komplementu à není hemolýza (chybí komplement) 2.Beraní ery + komplement bez amboceptoru à není hemolýza (chybí protilátky) 3.Beraní ery + komplement + amboceptor à hemolýza (všechny složky přítomné) 4.Králičí ery + komplement + amboceptor à není hemolýza (chybí „ten správný“ antigen) Princip KFR (negativní, pozitivní) KFR Problémy s KFR nPříliš mnoho komplementu à falešná negativita. Co dělat? Titrovat komplement (viz další obrazovka) nNěkterá složka séra sama o sobě vyvazuje komplement (složka antikomplementarity): falešně pozitivní výsledky. Co dělat? Provést test antikomplementarity. Je to vlastně „normálně“ provedená reakce, ale bez antigenu Test antikomplementarity KFR antikomplementarita Titrace komplementu nPro reakci potřebujeme množství morčecího komplementu, které není moc velké ani malé. nProto zjišťujeme, jaké množství komplementu hemolyzuje pracovní jednotku krvinek s.amboceptorem (hemolytická jednotka) Použití KFR nKFR lze použít pro diagnostiku mnoha, zejména virových infekcí nJako i jiné serologické reakce se KFR používá k průkazu antigenu či protilátky. Častější je průkaz protilátky. nBerme to tak, že máme laboratorní antigen, který konfrontujeme se sérem pacienta (kde hledáme protilátky) Praktické provedení KFR nKFR se provádí v mikrotitrační destičce. nU průkazu protilátek se zpravidla postupuje následovně: npacient má celý řádek (u párových sér 2 řádky – jeden na první, druhý na druhý vzorek) nv prvním důlku (nalevo od čáry) je test antikomplementarity (musí být hemolýza, jinak nutno opakovat) nv dalších důlcích (napravo od čáry) je vlastní test s různě ředěnými séry nU vlastních testů (napravo od čáry) platí: tečka = pozitivita, hemolýza = negativní Ukázka KFR toxoplasmózy nVlevo od čáry jsou testy antikomplementarity. nPředředění séra je 1:10, další důlky mají ředění 1:20, 1:40 atd. nPozitivní je pacient 1 (titr 1:80), a pacienti 2, 3, 4, 6, 7 (titr 1:20, u 3 a 4 možná 1:40). Ostatní pacienti jsou negativní (nemají protilátky) D:\Atlas (F)\atlas\serology\kfr\kfr.jpg Děkuji za pozornost