Hmotnostní spektrometrieHmotnostní spektrometrie
RNDr.AlenaRNDr.Alena MikuškováMikušková
FN BrnoFN Brno –– Pracoviště dětské medicíny, OKBPracoviště dětské medicíny, OKB
amikuskovaamikuskova@@fnbrnofnbrno..czcz
Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry)
 fyzikálněfyzikálně--chemická metoda, využívá separace urychlených ionizovanýchchemická metoda, využívá separace urychlených ionizovaných
částic ve vakuučástic ve vakuu podle jejich hmotnostipodle jejich hmotnosti při jejich průchodu magnetickými apři jejich průchodu magnetickými a
elektrickými poli.elektrickými poli.
 MS vyvinuta počátkem 20.století, vvyvinuta počátkem 20.století, v klinické biochemii se užívá již několikklinické biochemii se užívá již několik
desetiletí pro identifikaci a stanovení nízkomolekulárních látekdesetiletí pro identifikaci a stanovení nízkomolekulárních látek na základěna základě
měření hmotnosti jejich molekul (detekce látek ve spojení směření hmotnosti jejich molekul (detekce látek ve spojení s plynovouplynovou
chromatografií)chromatografií)
•• V první polovině 90. letV první polovině 90. let
20.století20.století -- nové techniky,nové techniky,
které umožnily využívatkteré umožnily využívat
metodu i pro látkymetodu i pro látky
vysokomolekulárnívysokomolekulární
• MS se stala nejdynamičtěji sese stala nejdynamičtěji se
rozvíjející metodikourozvíjející metodikou
současné biochemie (vedlesoučasné biochemie (vedle
metod molekulové genetiky)metod molekulové genetiky)
Hmotnostní spektrumHmotnostní spektrum
Výstupem MS je hmotnostní spektrumVýstupem MS je hmotnostní spektrum –– čarovýčarový diagram, na jehož vodorovnédiagram, na jehož vodorovné
ose je hodnotaose je hodnota m/zm/z (hmotnost / náboj iontu) a na svislé ose odezva detektoru(hmotnost / náboj iontu) a na svislé ose odezva detektoru
nebo relativní zastoupení daného iontu:nebo relativní zastoupení daného iontu:
Hmotnostní spektrometrHmotnostní spektrometr
Složený ze tří funkčních celků:Složený ze tří funkčních celků:
•• Iontový zdroj:Iontový zdroj: ionizace neutrálních molekul měřené směsi: molekulaionizace neutrálních molekul měřené směsi: molekula analytuanalytu
je převedena do plynné fáze (do vysokého vakua), přičemž získáváje převedena do plynné fáze (do vysokého vakua), přičemž získává
charakteristický náboj.charakteristický náboj.
•• Iontový separátor:Iontový separátor: rozdělenírozdělení
iontů různých hmotnostíiontů různých hmotností -- ionion
je urychlen a z charakteruje urychlen a z charakteru
jeho pohybu vakuovanýmjeho pohybu vakuovaným
prostorem lze vypočítat poměrprostorem lze vypočítat poměr
jeho hmotnosti a náboje m/zjeho hmotnosti a náboje m/z
•• Detektor:Detektor: detekce iontů podetekce iontů po
jejich separaci podle hodnotyjejich separaci podle hodnoty
m/z a určení relativní intenzitym/z a určení relativní intenzity
(četnosti) jednotlivých iontů(četnosti) jednotlivých iontů
Iontový zdrojIontový zdroj -- Ionizační technikyIonizační techniky
Existuje celá řada ionizačních technik, cílem je vždy vytvořit nabitou
částici, která je následně analyzována
Použitá ionizační technika záleží na tom, na jakou separační metodu je
MS napojen (GC/MS, LC/MS, bez napojení na separační techniku)
GC/MS: LC/MS, CE/MS,GC/MS: LC/MS, CE/MS,
-- Elektronová ionizaceElektronová ionizace EIEI MS s přímým nástřikemMS s přímým nástřikem
-- Chemická ionizaceChemická ionizace CICI -- ElektrosprayElektrospray ESIESI MALDI (SELDI)MALDI (SELDI)
Elektronová ionizace, EIElektronová ionizace, EI
VV iontovém zdroji dochází kiontovém zdroji dochází k ionizaciionizaci
molekulmolekul analytuanalytu v plynném stavu pomocív plynném stavu pomocí
proudu elektronů:proudu elektronů:
-- Z molekuly je při srážce s paprskemZ molekuly je při srážce s paprskem
elektronů odtržen elektron (molekulaelektronů odtržen elektron (molekula
získává kladný náboj)získává kladný náboj)
-- Následné dochází k fragmentaciNásledné dochází k fragmentaci
(rozpadu) molekuly přebytkem energie(rozpadu) molekuly přebytkem energie
EI - tvrdá ionizační technika (fragmentace)(fragmentace)
 fragmenty jsou rozděleny vfragmenty jsou rozděleny v další částidalší části
analyzátoru podle hodnoty m/z aanalyzátoru podle hodnoty m/z a
detegoványdetegovány (separace magnetickým(separace magnetickým
analyzátorem,analyzátorem, kvadrupólemkvadrupólem))
 Pouze pro teplotně stáléPouze pro teplotně stálé
nízkomolekulární látkynízkomolekulární látky
Chemická ionizace CI
„Měkčí“ varianta elektronové ionizace
Do iontového zdroje je přiváděn ionizační plyn (př.metan). Proud elektronů
ionizuje nejdříve molekuly tohoto plynu a tyto teprve předávají energii
molekule analytu – šetrnější, nedochází k tak rozsáhlé fragmentaci
Srovnání hmotnostníhoSrovnání hmotnostního
spektra s elektronovouspektra s elektronovou
ionizací a chemickouionizací a chemickou
ionizacíionizací
Elektrospray ionizace, ESI
 Eluát prochází kapilárou, na niž je
vloženo vysoké napětívysoké napětí – vytváří se sprej
vysoce nabitých kapiček. Následným
postupným odpařením rozpouštědla
vznikají ionty (i vícenásobně nabité), jsou
dále separovány (kvadrupól, TOF)
 Měkká ionizační technika (bez
fragmentace)
 Vhodný pro nízkomolekulární i
vysokomolekulární látky (peptidy,
sacharidy, proteiny, nukleové kyseliny,...)
MALDIMALDI -- MMatrixatrix--AAssistedssisted LLaseraser DDesorptionesorption IIonizationonization
Vzorek je vVzorek je v roztoku smíchán sroztoku smíchán s matricímatricí -- deriváty nízkomolekulárníchderiváty nízkomolekulárních
aromatických kyselin, které mohou absorbovat energii laserovéhoaromatických kyselin, které mohou absorbovat energii laserového záření vezáření ve
viditelné nebo blízké ultrafialové oblasti. Roztok je nakápnut aviditelné nebo blízké ultrafialové oblasti. Roztok je nakápnut a vysušenvysušen
(vykrystalizován) na MALDI destičce.(vykrystalizován) na MALDI destičce.
PoPo pulsnímpulsním ozáření směsných krystalů zábleskem laseru se látky prudceozáření směsných krystalů zábleskem laseru se látky prudce
odpaří do vakuaodpaří do vakua -- ionizovaná matrice strhne sebou molekuluionizovaná matrice strhne sebou molekulu analytuanalytu aa
ionizuje ji, ionty studovaných látek se pak již pohybují samostaionizuje ji, ionty studovaných látek se pak již pohybují samostatně,tně,
urychleny stejnosměrným elektrickým polem do TOF analyzátoruurychleny stejnosměrným elektrickým polem do TOF analyzátoru
MALDIMALDI -- MMatrixatrix--AAssistedssisted LLaseraser DDesorptionesorption IIonizationonization
 Velmi měkká, šetrná technikaVelmi měkká, šetrná technika
–– i pro vysokomolekulární látkyi pro vysokomolekulární látky
(proteiny, peptidy,(proteiny, peptidy, oligosacharidyoligosacharidy,,
nukleotidy)nukleotidy)
 Ionty jsou dále separoványIonty jsou dále separovány
analyzátorem TOFanalyzátorem TOF
MatriceMatrice
SpotovacíSpotovací destičkadestička SpotovacíSpotovací destička na monitorudestička na monitoru
MS – separace iontů
•• Iontový separátor:Iontový separátor: rozdělení iontů různých hmotnostírozdělení iontů různých hmotností -- ion je urychlenion je urychlen
a z charakteru jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poa z charakteru jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poměrměr
jeho hmotnosti a náboje m/zjeho hmotnosti a náboje m/z
KvadrupólKvadrupól
Magnetický sektorový analyzátorMagnetický sektorový analyzátor
TOFTOF
Magnetický sektorový analyzátorMagnetický sektorový analyzátor
 Nejdéle používaný a nejlépe prozkoumaný, stále se vyvíjí
 Klasický typ detektoru, využívá skutečnosti, že dráha nabité částice se v
magnetickém poli zakřivuje tím více, čím má vyšší náboj a nižší hmotnost.
 Malé molekuly – pouze GC/MS (EI)
 Velmi přesný, ve své moderní verzi velmi nákladný (v klin. biochemii není
běžně používaný)
Kvadrupol
 Konstrukčně se jedná o 4 kovové tyče připojené ke zdrojům stelnosměrného
a střídavého napětí. Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, začnou
oscilovat
 Při vhodné kombinaci obou složek napětí projdou kvadrupolem pouze ionty o
určitém poměru m/z (změnou vkládaných napětí je možné nechat projít
kvadrupolem postupně ionty v celém rozsahu m/z)
 Lze použít pro GC/MS i LC/MS (v kombinaci s EI, CI, ESI,…), pro LC/MS
však pouze pro menší molekuly
TOF –– analyzátor „Time of Flight“ (průletový)
 DetegujeDeteguje hmotnosti ionizovaných molekul na základě doby jejich letuhmotnosti ionizovaných molekul na základě doby jejich letu
evakuovanou trubicíevakuovanou trubicí -- rychlosti letu závisí na hodnotách efektivní hmotnostirychlosti letu závisí na hodnotách efektivní hmotnosti
m/zm/z –– lehčí molekula letí rychlejilehčí molekula letí rychleji
 Lineární neboLineární nebo reflektronovýreflektronový mód (mód (reflektronreflektron -- vyšší rozlišovací schopnost)vyšší rozlišovací schopnost)
TOF –– analyzátor „Time of Flight“ (průletový)
TOF má teoreticky neomezený rozsah hmotností, pro které se dá poTOF má teoreticky neomezený rozsah hmotností, pro které se dá používat,užívat,
v praxi se mu však dává přednost pouze pro velké molekulyv praxi se mu však dává přednost pouze pro velké molekuly
V kombinaci s MALDI (SELDI), ESIV kombinaci s MALDI (SELDI), ESI
Detektor
detekce iontů po jejich separaci podle hodnoty m/zdetekce iontů po jejich separaci podle hodnoty m/z
a určení relativní intenzity (četnosti) jednotlivých iontůa určení relativní intenzity (četnosti) jednotlivých iontů
 Fotonásobič
Před vlastním fotonásobičem je umístěna
fosforová destička. Na ni dopadají částice
z konverzní dynody a dochází k emisi
fotonů. Ty dopadají na fotokatodu, kde
fotoelektrickým jevem dojde k emisi
elektronů. Ty jsou dále zmnoženy stejně
jako v elektronovém násobiči.
 Elektronový násobič obsahuje sérii dynod se vzrůstajícím
potenciálem. Ion narazí na povrch první dynody, dojde
k emisi elektronu. Po jeho dopadu na další dynodu dojde
k vícenásobné emisi. Kaskádovitým efektem vznikne velké
množství elektronů, které jsou detekovány.
Tandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MSTandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MS
 Při MS/MS jsou ionty podrobeny dvěma hmotnostním analýzám (zPři MS/MS jsou ionty podrobeny dvěma hmotnostním analýzám (zapojení dvou
či více iontových separátorů v tandemu)
 MS/MS umožňuje rychlou analýzu bez použití separačních metod (GC, LC) ve
složité matrici, velice citlivá metoda
Standardně např. trojitý kvadrupól QqQ:
• První kvadrupól vybírá prekursorový ion
• Ve druhé části - kolizní cele - probíhá fragmentace prekursorového iontu
(srážkou iontu s atomy inertního plynu)
• Poslední kvadrupól analyzuje fragmenty
Pozn.: QqQ v kombinaci s ESI
(přímý nástřik) se používá pro
novorozenecký screening
- Obdobně TOF-TOF analyzátor
- Hybridní Q-TOF analyzátor
(kvadrupól – TOF)
Příklady použití – GC/MS
 Pro analýzu neznámých složekPro analýzu neznámých složek
směsi: pro každou složku směsi sesměsi: pro každou složku směsi se
získá hmotnostní spektrum, které sezíská hmotnostní spektrum, které se
porovná s databází spekter v počítačiporovná s databází spekter v počítači
a takto se daná složka identifikujea takto se daná složka identifikuje
 Potvrzení či vyloučení metabolitů,Potvrzení či vyloučení metabolitů,
které svědčí pro určité metabolickékteré svědčí pro určité metabolické
onemocněníonemocnění
 Kvantifikace určitých metabolitůKvantifikace určitých metabolitů
 ToxikologieToxikologie –– léky, drogy, alkoholléky, drogy, alkohol
UkázkaUkázka –– organické kyseliny v močiorganické kyseliny v moči
Příklady použití - LC/MS, LC/MS/MS
 Toxikologické analýzyToxikologické analýzy
 FarmakokinetickéFarmakokinetické studie, stanovení lékůstudie, stanovení léků
 ProteomikaProteomika // metabolomikametabolomika
Stanovení léků LC/MS/MSStanovení léků LC/MS/MS
Příklady použití – MS/MS
- MS/MS analýza bez použití separační metody (GC, LC)
- uspořádání ESI – trojitý kvadrupol:
Novorozenecký screening dědičných poruch metabolismu
- Stanovení koncentrací aminokyselin
a acylkarnitinů v suché krevní kapce
(10 různých metabolických poruch,
např. fenylketonurie)
MALDI - TOF - TOF
Analýza neznámého proteinu:Analýza neznámého proteinu:
 Protein (Protein (vyseparovanývyseparovaný ze směsi např. dvourozměrnou ELFO) se rozštěpíze směsi např. dvourozměrnou ELFO) se rozštěpí
enzymem (např. trypsinem) na směs peptidů.enzymem (např. trypsinem) na směs peptidů.
 Směs peptidů se nechá vykrystalizovat s matricí na MALDI destičcSměs peptidů se nechá vykrystalizovat s matricí na MALDI destičcee
 První TOF analyzátor vybíráPrvní TOF analyzátor vybírá
prekursorovýprekursorový ion, který vstupuje doion, který vstupuje do
kolizní cely. V kolizní cele dojde kkolizní cely. V kolizní cele dojde k
fragmentaci iontufragmentaci iontu -- peptidu napeptidu na
jednotlivé aminokyselinyjednotlivé aminokyseliny (srážkou
iontu s atomy inertního plynu) aa
spektrum fragmentů je měřenospektrum fragmentů je měřeno
druhým TOF analyzátorem.druhým TOF analyzátorem.
SELDISELDI –– SSurfaceurface EEnhancednhanced LLaseraser DDesorptionesorption IIonizationonization
Analýza proteinů pomocí vazby na předpřipravený povrch pevné fáze
proteinového čipu
 Povrch čipu může být tvořený protilátkou, receptorem, ligandem, může být
chemickým způsobem upravený
 Po nanesení vzorku se proteiny navážou k povrchu adsorbcí, elektrostatickou
interakcí, na afinitním principu,…
 Promytím mikročipu se odstraní nenavázané složky
 Analýza – viz MALDI - TOF
 Vzorek komplexníVzorek komplexní
směsi proteinů můžesměsi proteinů může
být analyzovánbýt analyzován
současně na několikasoučasně na několika
různýchrůzných sorbentechsorbentech,,
aby byly navázány aaby byly navázány a
analyzovány veškeréanalyzovány veškeré
proteiny ve vzorkuproteiny ve vzorku
 Čipy mohou býtČipy mohou být
vyrobeny dlevyrobeny dle
požadavku zákazníkapožadavku zákazníka
Děkuji za pozornost ……