Lucie Kovářová OKH, FN Brno (ä) Babak Research Institute ^—/ Masarvk University E FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO Průtokový cytometr S flow cytometrie (flow+cyto+metrie) S specializovanější varianta fluorescenčního mikroskopu v kombinaci s krevním analyzátorem S měření fyzikálních, chemických a biologických vlastností až 106 buněk v suspenzi FACSCantoll (Becton-Dickinson) Cytomics FC500 (Beckman Coulter) Složení průtokového cytometru Světlo vs. buňka Forward Scatter detektor - rozptyl světla v malém úhlu - velikost buňky detektor Side Scatter - rozptyl světla pod úhlem 90° - komplexita buňky detektor ^^^m: —- Fluorescence - přítomnost fluorochromu Fluorochromy > excitace UV/violet diodě (fialový laser) - 405 nm - DAPI, Hoechst/Pacific Blue (452), AmCyan (491), BD Horizon 450 a 500 > excitace Ar-iontovým laserem (modrý) - 488 nm FITC - fluorescein isothiokyanát (530 nm) Alexa Fluor 488 (519 nm) PE, RDI - phycoerythrin (580 nm) ECD - tandem, konjugát PE-texaská červeň (620 nm) PerCP - perridin chlorophyl (678 nm) PerCPCy5.5 - tandem, konjugát PerCP-Cy5.5 (696 nm) PC5 - tandem PE-cyanine 5 (620 nm) PC7 - tandem PE-cyanine 7 (778 nm) Pl - propidium jodid, široký peak okolo 620 nm > excitace He-Ne laserem/red diodě (červený) - 633 nm APC - allophycocyanin (670 nm) APC-Cy7 - tandem APC-cyanine 7 (778 nm) Analýza a zobrazení FS - forward scatter - velikost buněk SS - side scatter - granularita/komplexita 1-parametrová analýza > Histogram s osa x - intenzita fluorescence, osa y - počet buněk s hodnocení - odečet % pozitivních buněk ■ neg. peak = autofluorescence, izotypová kontrola ■ poz. peak - různá intenzita exprese o low (+/-) < dim (+) < high, bright (++) < very high (+++) ■ porovnávání intenzity exprese Intenzita fluorescence (lineární nb logaritmická stupnice) 2-parametrová analýza > Dot plot s dva parametry proti sobě - FLx vs. FLy, FLx vs. FS či SS s procentuální hodnocení - nejčastěji kvadrantová analýza I. kvadrant - FITCPE* II. kvadrant - FITC+PE+ III. kvadrant - FITCPE" IV. kvadrant - FITC+PE- Sortování subpopulací Bezprostředně po analýze dochází piezoelektricky k „trhání" proudu vzorku na kapky - obsahující jednu buňku - přičemž požadova ným buňkám = kapkám je udílen el. náboj. Tyto jsou pak v el. poli vychylovány a odseparovány. udělení náboje a separace gateovaných bb Imunofenotypizace - CD znaky Stanovení povrchových a intracelulárních markerů exprimovaných jednotlivými hodnocenými buňkami S vznik CD klasifikace v r. 1982, využívá k identifikaci buněk tzv. CD markerů - Cluster of Differenciation, def. cca 300 znaků (antigénu Ag) a není uzavřeno S historicky označeny nejprve leukocytární markery, později zahrnutí dalších znaků (megakaryocyty, trombocyty, erytrocyty...) S různá fce - buněčné enzymy, receptory mikrobiálních Ag, transportní proteiny, prezentace Ag, Fc receptory, komplementové receptory, regulační signalizační receptory a jejich ligandy, adhezivní proteiny... Identifikace subpopulací S pomocí MoAb proti znakům přítomným na povrchu nebo v cytoplazmě buňky ^ na základě exprese CD markerů rozlišení subpopulací buněk, jejich stádia vývoje a zralosti, patologie... T lymfocyty B lymfocyty NK buňky kmenové buňky trombocyty erytrocyty leukocyty monocyty dendritické bb CDla - CD3, CD4, CD5 - CD8... CD19, CD20 - CD24, CD79 - CD84.. CD16, CD55, CD56, CD57, CD244... CD34, CD117... CD36, CD41, CD42a, CD42b, CD61 Gly-A (CD235a)... CD45... CD14... CD83, HLA-DR, ILT3... Princip IFT monoklonalni protilátka (AAoAb) konjugovana s fluorochromem (fluorescenční molekulou) suspenze buněk s určitými povrchovými či intracelulárními antigeny (Ag) vizualizace specifické vazby MoAb-Ag možnost kombinace několika AAoAb ■=> vizualizace mnoha znaků najednou Zpracování a analýza vzorku Imunofenotypizace S typ vzorku - buněčná suspenze - nesrážlivá periferní krev či kostní dřeň (EDTA, Heparin), BAL, kultivované buňky, desintegrovaná lymfatická uzlina... S Inkubace - se specifickou monoklonální protilátkou proti požadovaným znakům (T, B, NK buňky...) S lyzace erytrocytu - pokud jsou obsaženy v suspenzi O osmoticky, enzymaticky či chemicky S fixace - 0,5% paraformaldehydem S proplach - vymytí nadbytečné protilátky pomocí PBS S analýza - získání listmode a vyhodnocení histogramů Vazba MoAb - Ag Klinické využití FC > Rutinní vyšetření a výzkumné analýzy s imunologie s hemato-onkologie s transplantologie s transfuziologie s hematologie Imunologie ^Analýza imunokompetentních buněk (IFT) ■ subpopulace T, B, NK buněk ■ dif. dg. imunodeficiencí apod. ^Analýza autoprotilátek ■ proti leukocytom, erytrocytům či trombocytům ^Analýza funkce neutrofilů ■ oxidatívni vzplanutí fagocytóza Základní populace lymfocytů T Ivmfocvtv - cytotoxic ké: CD3+CD8+ - pomocné: CD3+CD4+ B Ivmfocvť - B2: CD19+CD20+ - Bl: CD5+CD19+CD20dim+ NKbuňk - CD3CD16+CD56+ - NK-T: CD3+CD56+ 10z 101 10° P1 DO - - .22.4% p4 103 102 U a o „ 10°- "i'o°i'o1'i''o2' 1W CD8-fitc p1 p2 0.0% 20.9, p4 "i'o°i'oiib2 ' 10^ CD3-fitc 102 O 101 U 10" K1 ^^^^^^^^^ ■■"^■■?!^Dí^"c ■ 103 ■ to m 3io1-+ to 5io°- ji j3 "i'o°i'o1W 1 io* CD4-pe j2 j4.: i'o°i'oil'o2' ' 10'* CD3-fitc Absolutní počty buněk Využití firemního roztoku s přesně definovaným počtem částic na (llI a fluorescencí ve všech kanálech S zadáván jako kalibrátor S shodný objem vzorku a kalibrátoru HIV+ pacienti - stanovení abs, počtu CD4+ helperT lymfocytů Transplantologie Zjištění zastoupení hematopoetických kmenových buněk ■ CD34+ leukocyty ■ v rámci transplantace kmenových buněk S monitorování PK po stimulaci G-CSF, v transplantátu... ■ analýza pupečníkové krve... Hemato-(onkologie) s Analýza povrchových a intracelulárních markerů - imunofenotypizace ■ dif. dg. leukémií, lymfomů apod. ■ analýza stavu onemocnění (remise, relaps...) ■ stanovení minimální reziduálni nemoci S DNA analýza ■ ploidita a proliferace buněk s Analýza apoptózy a nekrózy... Diferenciální diagnostika hematologických malignit Vychází ze znalostí exprese povrchových a intracelulárních molekul v průběhu diferenciace krevních bb ■ přítomnost patologických buněk s odlišným fenotypem ■ liniová příslušnost (lymfoidní, myeloidní, monocytární aj.) ■ diferenciační stupeň hematologických malignit ■ analýza smíšeného fenotypu u leukémií ■ detekce aberantně exprimovaných markerů Kdy provádět IFT? S cytopenie (zejména bicytopenie a pancytopenie) S leukocytózy (lymfocytózy, monocytózy a eozinofilie) S nález atypických buněk či blastů v PK, KD či jiných TT S zvýšený počet plazmocytů, monoklonální gamapatie S organomegalie či nález tkáňové masy * neutrofilie ze zralých buněk * polyklonální hypergamaglobulinémie * polycytémie, trombózy a bazofílie B -CLL Patologické BI (CD5+CD19+) lymfocyty přítomny v PK - vesměs charakteristický fenotyp CD20dim+CD23+ - bez exprese povrchových kappa/lambda lehkých řetězců lg 102- u CL á 101 Ta u 10° !pi p2 : 3.9% 18.6% p3 . 1 19.5% 5,i% CD5-FITC CD5+CD19+ 103 h- 102- o Q. ■ < *10° K1 I 13v9% ' " 22.5% k3 WÉĚL k4 ......ioDi'o1W ' W CD20-PE CD20dim 103 102- o Q. é> 101 Ta o 10u N1 N2 21.8% n3 0.2% n4 0.0% ......io°10'102 ' 103 CD23-PE 103 102 u FC umožňuje simultánní analýzu mnoha biologických vlastností na vysokém počtu destiček (PLT) v poměrně krátké době > analýza všech dostupných subpopulací ■ „giant" PLT ■ mikropartikule odvozené z PLT Ä JfLJ'-<4t ■ agregáty s leukocyty \Ě X * ^ > > možnost analýzy dle potřeby :% % 'A ■ plná krev , "^Éjj ■ plazma bohatá na PLT pl_. ■ X^- r r ^ ■ izolované PLT v arteficiálním médiu Trombocytární glykoproteiny > přítomny na povrchu trombocytů či v membráně granulí > zprostředkovávají adhezi a agregaci destiček ✓ CD31 - GPIIa (PECAM) - adheze k endoteliím s CD36 - GPIV - adherence ke trombospondinu ✓ CD41/CD61 - GPIIb/GPIIIa - ligandy jsou fibrinogen a vWF, komplex zprostředkovává agregaci ✓ CD42a/CD42b - GPIX/GPIb - tvoří receptor pro vWF, komplex zprostředkovává adhezi k subendoteliu s CD62P - GMP-140 (P-selektin) - přítomen na a-granulích s CD63 - GP53 - přítomen na lyzozomálních/denzních granulích Nejčastější aplikace u PLT I. S Diagnostika dědičných či získaných defektů ■ Glanzmanova trombocytopenie (GPiib/nia - cd4i/cdói) ■ Syndrom Bernard Soulier (GPib/ix - CD42b/CD42a) ■ Syndrom šedých destiček (P-seiektin - cdó2P).... S Aktivace PLT in vivo ■ analýza na aktivaci závislých Ag (CD62P) ■ analýza PLT-PLT agregátů, případně agregátů s Leu (CD62P iniciuje interakci s PSGL-1 na leukocytech) ■ destičkové mikropartikule Defekty PLT GP Glcmzmcmova trombastenie O) r- í ov CO c - 98.7% - - II - ......i'o°i CD36-FITC CD61 CD61-PE CD41 l'OO1'0110= 1 ibi CD41-PC7 Krvácivý stav r*. ACD36 T-T- l 59.8