OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Cytogenetické vyšetřovací metody Hanáková M. OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CYTOGENETIKA •Metody klasické cytogenetiky •Metody molekulární cytogenetiky • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY •odběr materiálu •kultivace •zpracování suspenze •pruhování / barvení chromosomů • - metody 1. volby v indikovaných případech - relativně levné metody (ve srovnání s metodami molekulární cytogenetiky) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY •Postnatální stanovení karyotypu a získaných chromosomových aberací •Prenatální stanovení karyotypu •Stanovení karyotypu maligních klonů z kostní dřeně a solidních nádorů u onkologických pacientů • •Postupy se v detailech liší pro jednotlivé typy •vstupních materiálů. OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu • Odběr materiálu pro účely cytogenetického • vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • •do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu (obv. 3 ml) •do heparinu a transportního média – kostní dřeň • (obv. 1-2 ml) •do transportního média – solidní tumory, kůže (obv. 1x1 cm), choriové klky (obv. 20 mg) •bez přídavku média a dalších látek – plodová voda • (obv. 20 ml) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu •Odběr materiálu pro cytogenetickou analýzu a typy buněk, které •jsou v konkrétním materiálu vhodné pro získání metafázních •chromosomů : •periferní krev – ze žíly – T-lymfocyty •fetální krev – z pupečníku pod kontrolou UZ – nezralé • T-lymfocyty •plodová voda – z amniového vaku pod kontrolou UZ - kožní • fibroblasty •choriové klky – z chorionu nebo placenty - buňky choriových • klků nebo placenty •kůže – z potracených plodů, kožní biopsie pacientů – kožní • fibroblasty •kostní dřeň – z prsní kosti, kyčlí – prekurzory krevních buněk •solidní tumory – z nádoru – maligní buňky • • • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu solidní nádor periferní krev dřeň 002 kostní dřeň nádory 003 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu choriové klky odběr plodové vody pod kontrolou ultrazvuku kůže (potracený plod, placenta) kůže, placenta 011 nasazení plodovky 001 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení do kultivačního média •Sterilní práce v laminárním boxu nádory2 001 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (promíchání periferní krve) kultivace21 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno nasazení plodovky 039 METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (centrifugace plodové vody a odstranění supernatantu) sediment (buňky plodu – většinou kožní fibroblasty) – nasadíme supernatant - vzorek na analýzu AFP v radiologické laboratoři, zbytek odstraníme nasazení plodovky 015 rozplňování plodové vody do centrifugačních zkumavek plodová voda po centrifugaci – odstraňování supernatantu sediment OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (centrifugace kostní dřeně a odstranění supernatantu) dřeň stočená 001 dřeň - odstranění supernatantu (cytostatika) 003 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava materiálu na nasazení do média (promytí a rozstříhání kůže potracených plodů) potracený plod a placenta - homogenizace 069 potrac plodu a plac promývání 065 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava materiálu na nasazení do média (homogenizace solidního nádoru) nádory2 006 nádory2 007 nádory2 010 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (promytí, případně rozstříhání choriových klků) klky promývání 030 klky stříhání 046 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu periferní krev kultivace4 Pipetování krve do kultivačního média OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu plodová voda nasazení plodovky - médium k sedimentu 043 nasazení plodovky 054 nasazení plodovky 059 promíchání média se sedimentem nasazení do kultivačních nádobek Kultivační nádobky připravené k inkubaci v termostatu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu kostní dřeň dřeň nasazení sedimentu 002 dřeň nasazení 009 Pipetování kultivačního média Pipetování dřeně do média OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu kůže potracený plod a placenta - nasazení 076 prenatál 004 potrac plod a placenta - nasaz, odstran přebyt média 081 Následná inkubace v termostatu. Médium se přidává až po vycestování buněk kožních fibroblastů (kontrola binokulár). Odsátí přebytečného média (jen ovlhčené dno) Přenesení kůže do kultivační nádobky OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu solidní nádory nádory2 014 nádory2 011 nádory2 022 nádor nasazený 023 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu choriové klky Inkubace v termostatu přes noc v Petriho misce (v indikovaných případech dlouhodobá kultivace s nasazením analogickým jako u solidních nádorů) klky po inkubaci v médiu přes noc 094 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu •délka kultivace • - periferní krev – 72 hodin (stanovení karyotypu) • - 48 hodin (stanovení ZCA) • kratší doba kultivace - podmínkou je zachytit • 1. buněčné dělení, později dochází k reparaci • chromozomů nebo k zániku buněk s aberací • - krev plodu 72 hodin (stanovení karyotypu) • - plodová voda – průměrně 10 dní (stanovení karyotypu) • - choriové klky – přes noc (stanovení karyotypu) • - kostní dřeň – přímé zpracování buněk • ihned po odběru • - 24 hodin (48 hodin spec. případy) • (stanovení karyotypu maligních klonů v KD) • - kůže – variabilní doba růstu (průměrně 2 týdny) • - solidní nádory – 1 – 2 týdny • (stanovení karyotypu maligních klonů v nádorových buňkách) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu • •kultivace buněk • v suspenzi (periferní krev, • fetální krev) • • kultivace buněk • přichycených na dně • kultivační nádobky • (plodová voda, solidní • tumory, kůže) • - po kultivaci pomocí • roztoku trypsinu • odloupneme ode dna, dále • zpracováváme • jako suspenzi buněk • kultivace4 inverzní mikroskop 2 kultivace plodové vody kultivace periferní krve OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace v termostatu 37°C nádory2 024 Termostat s CO2 atmosférou prenatál 007 speciální uzávěr kultivačních nádobek s bakteriálním filtrem – propouští CO2 Kultivace plodové vody, kůže, solidních nádorů Klasický termostat Kultivace periferní krve, fetální krve perif 001 přednáška 074 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace v termostatu 37°C prohlížení nárůstu v průběhu kultivace plodové vody, solidních nádorů a kůže v inverzním mikroskopu inverzní mikroskop OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace T-lymfocytů z periferní krve •kultivace periferní krve v médiu • s přídavkem phytohemaglutininu (PHA) • = výtažek z fazolu obecného (Phaseolus vulgaris) • - T-lymfocyty = zralé diferencované buňky s malou spontánní mitotickou aktivitou • - vlivem PHA se dediferencují (přeměna na nezralé buňky lymfoblasty, které se dělí (tzn. vstupují do mitózy!) • (např. k nezralým buňkám – blastům z kostní dřeně • onkologických pacientů není třeba PHA přidávat, • dělí se samovolně) • - význam kultivace – pomnožení T-lymfocytů • - složení kultivačního média – živné látky, antibiotikum, PHA, • stabilizátor pH • • • • fazole OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY přídavek kolchicinu po kultivaci (platí pro všechny materiály) •aplikace kolchicinu (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) • - zastavení dělení buněk v metafázi mitózy • - kolchicin je mitotický jed, který specificky • inhibuje dělící vřeténko a tím zastavuje dělení • buněk v metafázi mitózy, kdy jsou chromosomy • spiralizovány a vhodné k analýze • • ocún fotky 005 fotky 020 přídavek kolchicinu k nakultivované suspenzi příklad – periferní krev inkubace s kolchicinem v termostatu 37°C OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY příprava ke zpracování (plodová voda, solidní nádory, kůže) plodová voda - nárůst kolonií fibroblastů 015 plodová voda - pipetování trypsinu 012 plodová voda - sundávání nárůstu hokejkou 020 plodová voda - slévání buněk odloupnutých ze dna trypsinem014 Přídavek trypsinu – odloučení buněk ode dna Na dně je vidět nárůst fibroblastů OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze periferní krev, kostní dřeň • • - centrifugace suspenze T- lymfocytů (periferní krev) nebo blastů (kostní dřeň) po inkubaci s kolchicinem • fotky 041 fotky 003 fotky 114 fotky 156 přelití suspenze do centrifugační zkumavky před centrifugací odsátí supernatantu = kultivační médium + kolchicin po centrifugaci sediment krevních buněk připraven k hypotonizaci další 003 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze •hypotonizace • - KCl (periferní, fetální krev, solidní nádory, kostní dřeň) nebo médium zředěné destilovanou vodou (plodová voda), citrát sodný (choriové klky), inkubace v termostatu, centrifugace • = lýza erytrocytů (periferní a fetální krev), zvětšení objemu T-lymfocytů, uvolnění chromosomů od dělícího vřeténka, jejich rozestoupení v buňce fotky 040 fotky 044 fotky 046 přídavek roztoku KCl inkubace hypotonizační směsi v termostatu 37°C centrifugace Příklad – periferní krev, platí analogicky i pro ostatní typy materiálů OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze Při hypotonizaci a dalším zpracování choriových klků pracujeme v Petriho misce bez centrifugace, odsáváme Pasteurovou pipetou klky odsátí hypotonie 103 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze •fixace – získání suspenze (všechny materiály) • - kyselina octová (1) : metanol (3) • - náhlé a trvalé zastavení veškerých životních pochodů buňky, • zlepšení barvitelnosti chromosomů, rozpuštění nečistot • • přednáška 005 přednáška 012 po centrifugaci suspenze po hypotonizaci sediment T- lymfocytů odsátí supernatantu = KCl + lyzované erytrocyty přidání fixativu (3x), po každém přidání následuje centrifugace a odsátí supernatantu = fixativ fotky 163 fotky 190 Příklad – periferní krev OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • vykapání suspenze na mokrá podložní sklíčka přednáška 090 kapání2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • nakapaná sklíčka se po zaschnutí suspenze suší a zapékají v termostatu při 80°C přibližně půl hodiny zapékání 008 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY skladování suspenzí V mrazícím boxu ve zkumavkách schováváme všechny suspenze do doby než budou pacienti zhodnoceni uchování susp všech uchování patologií V mrazícím boxu v mikrozkumavkách uchováváme dlouhodobě suspenze s patologickým nálezem OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno fotky 048 přednáška 038 METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • orientační barvení – zjištění hustoty suspenze pod mikroskopem přednáška 069 barvivo Giemsa - Romanowski sušení sklíček na sušící plotýnce při orientačním barvení jsou chromosomy obarveny po celé délce – nejsou napruhovány DF,G Následně doladíme hustotu suspenze, suspenze je připravena k přípravě preparátu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY vykapání suspenze • vykapání suspenze na mokrá podložní sklíčka (u choriových klků suchá a nahřátá, jiný postup při kapání) přednáška 090 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů • pruhování chromosomů přednáška 022 přednáška 066 přednáška 065 přednáška 069 1 – inkubace preparátu v roztoku trypsinu (dochází k natrávení chromosomových proteinů) 3 – oplach ve vodě (C) A B C 2 – oplach preparátu v Sörensenově fosfátovém pufru (A), barvení barvivem Giemsa- Romanowski (B) 4 – sušení sklíček na sušící plotýnce OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno mitóza METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení / pruhování chromosomů •barvení (analýza ZCA a orientační • barvení chromosomů) – Giemsovým barvivem (bez inkubace v roztoku trypsinu, obarvuje chromosomy po celé délce, viz také kapitola • „Získané chromosomové • aberace”) • • •pruhování chromosomů • (analýza karyotypu, • karyotypu • maligních klonů) • • • •speciální barvení – „C”, „NOR” - dovyšetření nálezů na chromosomech zlomy1 C-čka chromosomy s G - pruhy „C” barvení - vizualizace heterochromatinových oblastí na chromosomech OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení / pruhování chromosomů • •klasická konvenční metoda barvení chromosomů • (chromosomy obarveny po celé délce – lze třídit chromosomy podle • velikosti a polohy centromery) • •pruhovací metody • (proužky na chromosomech, které umožňují individuální rozlišení • jednotlivých chromosomů a chromosomových změn) dlouhý2 zlomy1 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení chromosomů •Příprava preparátů na ZCA se liší od přípravy •preparátů na stanovení karyotypu: • •materiál – periferní krev •kultivace buněk v suspenzi 48 hodin s přidáním PHA •kolchicin, hypotonizace, fixace, vykapání suspenze na sklíčka •BARVENÍ GIEMSOVÝM BARVIVEM bez inkubace v roztoku trypsinu zlomy1 obarvení chromosomů po celé délce OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY morfologie chromosomů •Chromosomové preparáty získané z různých typů vstupních •materiálů se mohou vizuálně lišit dlouhý2 mitoza Periferní krev Kostní dřeň OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY preparáty se složkou pacienta připravené k hodnocení přednáška 031 zabalená sklíčka a složka pacienta sklíčka ve stojáncích OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu •Chromosomy hodnotíme ve světelném mikroskopu při zvětšení •1000x – 1250x za použití imerzních objektivů. kongo4 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop •Základní části mikroskopu: • •Mechanické části: stativ, tubus a pracovní stolek s křížovým posunem, • makro a mikrošroub, revolverový měnič objektivů •Osvětlovací části: zdroj světla, kondenzor, irisová clona •Optické části: objektivy, okuláry • •Objektiv: soustava čoček, která vytváří skutečný, zvětšený • a převrácený obraz •Okuláry: zvětšují obraz vytvořený objektivem, výsledkem je obraz • zdánlivý, zvětšený a přímý OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop •Další příslušenství: •Filtry: rovnoměrně rozptylují bodové světlo žárovky • ke zvýšení kontrastu •Kamera, fotoaparát, počítač • •Údržba mikroskopu: -Ochrana před prachem (kryt) -Čištění od imerze (každý den - éter) -Pravidelné čištění optiky (servis) -Ochrana před otřesy -Ochrana před škodlivými výpary • • • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop mikroskop 004 Irisová clona – regulace množství světla, které přichází do mikroskopu Filtr (rozptýlení světla) Makro a mikrošroub Zdroj světla – halogenová žárovka, zapojeno na síť přes samostatný transformátor (osvětlení je zamontováno ve stativu) Objektivy (suchý a imerzní) Křížový posun Okuláry Kondenzor (pod stolkem), soustava čoček, která soustřeďuje paprsky do středu zorného pole Stolek s preparátem, opatřen měřítky k určení souřadnic na preparátu Revolverový měnič objektivů Hlavní vypínač Binokulárový tubus – slouží ke spojení objektivu a okuláru Aperturní clona – regulace množství světla, které prochází preparátem Šrouby k vycentrování zorného pole OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop mikroskop 007 mikroskop 008 Suchý objektiv – malé zvětšení (obvykle 10x) Imerzní objektiv – větší zvětšení (100x) Zvětšení objektivu Numerická apertura Mezi čočkou objektivu a sklíčkem je vzduch Mezi čočkou objektivu a sklíčkem je imerzní olej OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop Numerická apertura – číslo, které charakterizuje rozlišovací schopnost objektivu (vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako 2 samostatné body) Imerzní olej – předejde ztrátám světla, do objektivu dopadne větší množství paprsků, obraz obsahuje více detailů - do imerze lze namáčet pouze imerzní objektiv (nikoli suchý) Zvětšení mikroskopu je násobkem zvětšení objektivu a okuláru (např. 100 (zvětšení objektivu) x 12,5 (zvětšení okuláru) = 1250x zvětšení mikroskopu) Maximální užitečné zvětšení mikroskopu – u každého objektivu lze stupňovat celkové zvětšení mikroskopu použitím silnějších okulárů jen po určitou mez, nad tuto mez již objektiv nezobrazí více detailů (prázdné zvětšení). Užitečné zvětšení se odvozuje od hodnoty numerické apertury. OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu • •zvětšení 100 - 200x • vyhledávání mitóz • zvětšení přibližně 1000x hodnocení dlouhý2 sklíčko2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno přednáška 059 METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu •světelný mikroskop •s CCD kamerou •napojený na počítač přednáška 054 přednáška 056 ke třídění chromosomů a sestavení karyotypu lze využít počítačového programu Lucia. OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu norm mužský •karyotyp setříděný a upravený pomocí počítačového programu Lucia OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení získaných chromosomových aberací •počítáme % aberantních buněk ze 100 zhodnocených mitóz •aberantní buňka = buňka, jejíž jádro obsahuje minimálně 1 aberantní chromosom, nezáleží na tom, o kterou aberaci konkrétně se jedná (kromě gapů, které nezapočítáváme do výsledného %) •hranice patologie = 5% při opakovaném nálezu zlomy1 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odmaštění zhodnocených sklíček přednáška 001 odmaštění sklíček v xylenu – následně ve dvou kyvetách po 10 minutách PRÁCE V DIGESTOŘI kyveta 1 kyveta 2 zhodnocená sklíčka jsou popsána číslem pacienta, značkou pracovníka, který je hodnotil a pořadovým číslem (pokud je pacient zhodnocen více než z 1 skla) přednáška 028 sušení odmaštěných sklíček OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY krátkodobé skladování sklíček v průběhu roku uchování zhodn sklíček uchování zhodn OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY balení a archivace sklíček minimálně 5 let přednáška 049 přednáška 051 přednáška 050 archivace 001 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zápis výsledků - do knihy pacientů - do laboratorní elektronické databáze - na papírové kartičky, které se zakládají do kartotéky - do nemocniční databáze pacientů AMIS - přednáška 036 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Metody molekulární cytogenetiky, příklady využití v klinické cytogenetice OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY •Vyšetřujeme chromosomy a interfázní jádra ze všech typů vstupních materiálů (periferní krev, plodová voda, kostní dřeň, solidní nádory a další) • • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY •molekulární cytogenetika aplikuje metody molekulární biologie • na cytogenetické úrovni, vizualizuje a lokalizuje genetický materiál • v buňkách •pracuje s metafázními chromosomy nebo interfázními jádry •potvrzuje a upřesňuje nálezy klasické cytogenetiky (translokací, delecí, inzercí, duplikací…) •řeší problémy klasické cytogenetiky • – záchyt velmi malých chromosomových změn (jsou pod rozlišovací • schopností (citlivostí) metod klasické cytogenetiky – např. mikrodelece, • translokace velmi malých úseků chromosomů) • - analýza složitých chromosomových přestaveb • - identifikace nebalancovaného materiálu neznámého původu • - analýza buněk v interfázi (chromatin není spiralizován do podoby • chromosomů, je rozprostřen v celém objemu buněčného jádra) – • zrychluje analýzu (bez kultivace) – výsledek do 24 hodin, řeší problémy • klasické cytogenetiky – nedostatečný počet mitóz na sklíčku, špatná • kvalita chromosomů •začátek rozvoje – přelom 60.- 70. let 20. století OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY •využití: - analýza chromosomů z periferní krve – pouze VCA, • ZCA se při rutinní analýze nevyšetřují molekulárně • cytogeneticky! • - analýza chromosomů z ostatních materiálů (plodová • voda, krev plodu, kostní dřeň, solidní tumory….) • •molekulárně cytogenetickými technikami nelze nahradit klasické karyotypování • (před použitím metod molekulární cytogenetiky je třeba vědět, co chceme hledat – vysoká cena molekulárně cytogenetických metod, některé změny lze zjistit pouze klasickým karyotypováním) •oblasti uplatnění FISH – klinická cytogenetika (postnatální vyšetření u sterilních párů, • postižených dětí a dospělých s podezřením na genetickou příčinu, • genetická analýza pro účely umělého oplodnění, prenatální diagnostika • karyotypu plodu) • - nádorová cytogenetika • - výzkum (evoluční studie karyotypu, mapování • genomu ...) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – ISH (in situ hybridizace) - FISH (fluorescenční in situ hybridizace) • • •technika, která se využívá k detekci a lokalizaci specifické DNA sekvence na chromosomech (cílová sekvence nukleotidů na metafázních chromosomech nebo interfázních jádrech) • • •SONDA (PRÓBA) – uměle nasyntetizovaná sekvence, úsek DNA dlouhý několik set bazí, komplementární k cílové sekvenci na chromosomu (v chromatinu) • - sonda je značená – radioaktivně • - fluorescenčně • (fluorochromy) - FISH • - enzymem • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) •denaturace sondy a cílové sekvence (působení zvýšené teploty) – získání jednořetězcového vlákna DNA (je schopno vytvořit novou vazbu cílová DNA – DNA sonda, před denaturací vazba na komplementární řetězec DNA) – týká se sondy i cílové DNA •hybridizace sondy na cílovou DNA (chromosomy nebo interfázní jádra na podložním sklíčku) – dochází ke specifické vazbě sondy na cílové místo (chromosom, gen) • • obr1 sonda cílová DNA Jednořetězcová DNA po denaturaci OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) •vyhodnocení a zpracování signálu – FISH - fluorescenční mikroskop napojený na počítač – vizualizace a kvantifikace (signál září v tmavém poli) – modrá barvička (DAPI) obarvuje všechny chromosomy, červený signál = fluorescenčně značená sonda • 515-04 851-02C FISH na metafázních chromosomech FISH na interfázních jádrech detekce genu SRY na chromosomu Y OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) POSTUP Viz samostatná prezentace OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – fluorescenční mikroskop Světelný zdroj poskytující světlo o vysokém podílu krátkovlnného světla (rtuťová výbojka) Karusel s filtry – selekční filtry (excitační) – selektují ze světla rtuťové výbojky krátkovlnné světlo, které, když dopadá na preparát, na kterém je navázána fluorescenčně značená sonda, vyvolává fluorescenci - ochranné filtry – odstraňují krátkovlnné světlo (excitační) a propouští pouze světlo dlouhovlnné (emisní) - dichroické zrcátko – odráží a propouští světlo procházející mikroskopem (součást optiky mikroskopu) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY princip fluorescence Jev, při němž záření o kratší vlnové délce vyvolává v látce určitého složení vznik záření o delší vlnové délce, nazýváme luminiscence. Pokud k luminiscenci dochází po osvětlení zářením, hovoříme o fluorescenci nebo fosforescenci. Záření, které luminiscenci vyvolává, se nazývá excitační, záření vysílané látkou se nazývá emisní. Zatímco u fluorescence trvá vyzařování emisního světla krátkou dobu a po zhasnutí excitačního záření téměř okamžitě emise zhasíná (asi za 10-8 sekundy), u fosforescence může k emisi docházet i dlouhou dobu po zhasnutí excitačního záření. Látka schopná fluorescence se nazývá fluorochrom. V molekulární cytogenetice využíváme jevu fluorescence. Fluorescenční značky sond řadíme mezi fluorochromy. Fyzikální podstata fluorescence a fosforescence spočívá ve vlastnostech elektronového obalu atomů v molekulách fluorochromu. Elektrony těchto látek jsou schopny absorbovat foton excitačního světla, čímž se zvýší jejich energie. Část této nově nabyté energie však elektron po chvíli vyzáří jako foton s nižší energií a tedy delší vlnovou délkou. Protože došlo ke ztrátě energie, je vlnová délka emisního světla vždy delší než vlnová délka světla excitačního (Stokesovo pravidlo). Jelikož vlnová délka udává barvu světla, pozorujeme u emitovaného světla posun k červené části spektra. Excitační a bariérový filtr Abychom mohli dobře pozorovat emisní záření jehož intenzita je vždy mnohem nižší než intenzita excitačního záření, používáme dvojici filtrů. Excitační filtr propouští z barevného spektra pouze část potřebnou pro excitaci fluorescence (krátkovlnné záření) a zabraňuje průchodu světla o stejné či podobné vlnové délce jako světlo emisní, které by vytvářelo pozadí. Bariérový filtr propouští pouze emisní část spektra (delší vlnová délka) a zabraňuje průchodu excitačnímu světlu. Excitační světlo se od emisního sice liší barvou, ale je mnohem intenzivnější, takže by v něm emisní světlo nebylo lidským okem dobře vidět. filtry Excitační a bariérový filtr. OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY princip fluorescence - Stokesův posuv Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii Stokesův posuv l OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) •1992 •odhaluje nebalancovaný genetický materiál (chybění – nadbytek DNA), rozlišovací schopnost CGH • je 5 – 10 Mb •není schopna analyzovat balancované přestavby •princip analýzy • – DNA pacienta je izolována, rozštěpena na krátké fragmenty, naznačena zeleným fluorochromem • = celogenomová sonda zelená • - DNA kontrolní (ověřeno, že se jedná o balancovaný genetický materiál) obdobně zpracována • a naznačena červeným fluorochromem = celogenomová sonda červená • - hybridizace obou sond na kontrolní metafázní chromosomy na sklíčku (genetický materiál • chromosomů na sklíčku je balancovaný) – DNA/DNA hybridizace • - systém fluorescenční mikroskop – kamera – počítač, analyzační software měří poměr • fluorescence při vlnových délkách odpovídajících červenému a zelenému fluorochromu • • - balancovaný karyotyp – smíšená fluorescence (červený a zelený fluorochrom zastoupeny • přibližně stejně na daném úseku chromosomu) • - zisk DNA (duplikace) u pacienta – převažuje zelená fluorescence na daném úseku • chromosomu • - ztráta DNA (delece) u pacienta – červená fluorescence na daném úseku chromosomu • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) •zeleně označeny úseky na chromosomech, které jsou v karyotypu maligního klonu zmnoženy, •červeně označeny chybějící úseky chromosomů (obrázky převzaty z internetu) převaha červené fluorescence – křivka vychýlena za hranice intervalu spolehlivosti doleva (delece), převaha zelené fluorescence – křivka vychýlena doprava (nadbytek materiálu) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) •modifikace metody CGH : • - HR–CGH (high resolution CGH) – CGH s vysokým rozlišením, odhalí chybění • či nadbytek menších úseků DNA než CGH, metodika se od CGH liší počítačovým • zpracováním – rozlišovací schopnost metody přibližně 4 Mb • - ARRAY-CGH – na microarraye (skleněné mikroskopické destičky) jsou navázány • úseky DNA, jejichž delece či amplifikace nás u konkrétního • pacienta zajímá (destičky s DNA sekvencemi (mikročipy) • lze zakoupit), připravíme celogenomové sondy stejným • způsobem jako u CGH, nahybridizujeme na destičku, • analyzační software měří intenzity fluorescence • v jednotlivých bodech na destičce (v místech vazby • konkrétních sekvencí) • - význam ARRAY-CGH – mapování s vyšším rozlišením než • HR-CGH , rozlišovací schopnost závisí na množství DNA, • které se nachází v jednotlivých bodech na destičce (kratší •¨ – delší sekvence) – až 35 kb • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) •1996 •umožňuje vizualizaci všech lidských metafázních chromosomů při jednorázové hybridizaci – 5 fluorochromy značená směs chromosomově specifických sond, jedinečná kombinace sond na každém chromosomu, každý chromosomový pár má jinou barvu •SKY a M-FISH se liší jen systémem filtrů, který se používá při vizualizaci chromosomů fluorescenčním mikroskopem (SKY – 1 filtr, M- FISH – 5 filtrů, zvlášť pro každý fluorochrom) – mikroskop je napojen na kameru a počítač – snímání a zpracování obrazu •význam – vyjasnění složitých přestavech (komplexních aberací) • - identifikace kryptických (skrytých) přestaveb • - identifikace původu markerů a ring chromosomů – obtížně • určitelné klasickými metodami i samostatnými sondami •limity – nelze detekovat nebalancovaný materiál (nadbytek-chybění DNA), • inverze OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) •SKY – mitóza po hybridizaci •se směsí fluorochromů SKY – seřazené chromosomy po úpravě obrazu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – m-BAND (mnohobarevné pruhování) •1999 •mnohobarevná pruhovací technika s vysokým rozlišením, pomocí které lze analyzovat intrachromosomové přestavby (inverze, inzerce, delece) a mapovat místa zlomů na chromosomech mband_karyo obrázek převzat z internetu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CESH (comparative expressed sequence hybridization) •2001 •analýza exprese genů ve tkáních (expresní profil) • - rozdílná exprese genů v normální a nádorové tkáni – genetické změny • spjaté s maligní transformací a vývojem nádoru mohou postihnout expresi • a funkci klíčových genů • - využití při studiu vývojových anomálií a diferenciačních procesů •produkt exprese genu = RNA, ze které lze molekulárně genetickými metodami získat DNA, kterou fluorescenčně naznačíme a získáme sondu pro hybridizaci s normálními metafázními chromosomy, srovnáváme intenzitu fluorescence sond získaných z RNA kontrolního vzorku a vyšetřovaného pacienta OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CESH (comparative expressed sequence hybridization) obrázek převzat z internetu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY –MLPA • 2002 • rychlá, jednoduchá, relativně levná metoda • dokáže detekovat změny počtu kopií až 46 specifických sekvencí v 1 reakci • 20 ng DNA MLPA profily 1 (MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MLPA •založena na molekulárně – genetické metodě PCR • (prolínání metod molekulární cytogenetiky • a molekulární genetiky) FISH a mravenečník 010 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MLPA Separace a vyhodnocení pomocí kapilární elektroforézy Pacient Kontrola OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI • dvouchromatidový metafázní chromosom • schema chromosomu Chromosom s G- pruhy 12-8 zlomy1 img001 Chromosom obarvený po celé délce q dl ram text p kr ram text centrom text sest chromatidy text telomerická oblast telomerická oblast OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery •metacentrické chromosomy • centromera téměř nebo úplně uprostřed, • tedy krátká a dlouhá raménka jsou • (téměř) stejně dlouhá • •submetacentrické chromosomy • centromera mimo střed chromosomu, p a • q raménka jsou jasně délkově odlišena • 1-ka 3-ka 20-ka jiná 2-ka 8-ka 16-ka submetacentr 1 3 20 metacentr 2 8 16 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery •akrocentrické chromosomy • centromera je umístěna velmi blízko jednomu konci; • od krátkých ramének jsou odškrceny satelity (malé výrazné části konstitutivního • heterochromatinu; • místo odškrcení = sekundární konstrikce (tenké stopky); • (sekundární konstrikce obsahuje kopie genů kódujících rRNA = organizátor jadérka) • 13-ka (1) 22-ka akrocentr 13 22 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů do skupin podle velikosti a pozice centromery normální mužský karyotyp 46, XY norm mužský A text B text C text C text D text E text F text G text G text OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno mitóza METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení / pruhování chromosomů •barvení Giemsovým barvivem (bez inkubace v roztoku trypsinu, obarvuje chromosomy po celé délce) - analýza ZCA - viz také kapitola „Získané chromosomové • aberace” • • •pruhování chromosomů • (analýza karyotypu, • karyotypu • maligních klonů) • • • •speciální barvení – „C”, „NOR” - dovyšetření nálezů na chromosomech zlomy1 C-čka chromosomy s G - pruhy „C” barvení - vizualizace heterochromatinových oblastí na chromosomech OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení chromosomů •Příprava preparátů na ZCA (získané chromosomové •aberace) se liší od přípravy preparátů na stanovení •karyotypu (VCA – vrozené chromosomové aberace): • •materiál – periferní krev •kultivace buněk v suspenzi 48 hodin s přidáním PHA •kolchicin, hypotonizace, fixace, vykapání suspenze na sklíčka •BARVENÍ GIEMSOVÝM BARVIVEM bez inkubace v roztoku trypsinu – OBARVENÍ CHROMOSOMŮ PO CELÉ DÉLCE • (bez pruhů) DF,G OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů G – pruhování •nejčastěji rutinně užívaná metoda •chromosomy jsou vystaveny účinkům trypsinu (proteolytický enzym), který natráví chromosomové proteiny •chromosomy obarvíme Giemsovým barvivem (směs barviv) •výsledek – každý chromosom se specificky obarví (střídavé tmavé a světlé proužky různé tloušťky, tmavé proužky jsou bohaté na adenin a thymin, světlé na cytozin a guanin) •získané pruhy jsou specifické pro každý chromosomový pár •lze snadno rozpoznat strukturní a numerické abnormality •1 pruh na chromosomu obsahuje 50 i více genů OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G – pruhování chromosomů normální mužský karyotyp 46,XY norm muž OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY C – barvení chromosomů •vizualizace konstitutivního • heterochromatinu •(konstitutivní heterochromatin •v oblasti centromer a na •dlouhých raméncích některých •chromosomů – 1q, 9q, 16q, •Yq) • - metoda založena na • denaturaci DNA působením různých • agens (HCl, Ba(OH)2) a následné • reasociaci v teplém pufru • C v karyotypu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů •navázání zrn stříbra na aktivní oblast organizátoru jadérka (sekundární konstrikce akrocentrických chromosomů) • •stříbro se vyloučí z AgNO3 • za vyšší teploty a v kyselém • prostředí •zjišťujeme, jestli jsou satelity • schopny aktivity (jestli na nich • není navázán euchromatin, • který by aktivitě bránil a mohl • by být nebalancovaným • materiálem v karyotypu) •každý akrocentrický chromosom • nemusí být aktivní ve všech • buňkách nor2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno JADÉRKO •difuzní struktura v jádře, která není ohraničena membránou •dochází v ní k syntéze podjednotek ribosomů (ribosomy – bílkovinné struktury, které se účastní syntézy bílkovin v cytoplazmě) – geny pro syntézu lokalizovány v oblasti sekundární konstrikce akrocentrických chromosomů •je přítomno v interfázním jádře, mizí v mitóze img010 img014 norm mužský jaderná membrána jadérko OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno JADÉRKO • přítomnost jadérka v interfázním jádře a jeho nepřítomnost v mitóze • souvisí se spiralizací a despiralizací akrocentrických chromosomů img011 nor2 jadérko 10 dekondenzovaných akrocentrických chromosomů v interfázi, jejich chromatinové smyčky, které obsahují geny pro rRNA (sekundární konstrikce) se shlukují a tvoří základ jadérka jaderná membrána interfázní jádro mitóza spiralizované akrocentrické chromosomy, každý má spiralizovanou svou chromatinovou smyčku, která tvoří sekundární konstrikci OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) vyšetření z periferní krve • •rychlejší stárnutí organismu •vznik degenerativních onemocnění •možné maligní zvrhnutí • • Přítomnost aberací v somatických buňkách Přítomnost aberací v gametách •zvýšené riziko narození postiženého dítěte Konvenční barvení chromosomů Stanovení % aberantních buněk – buněk s poškozeným chromosomem zlomy1 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno •vyšetření provádíme na chromosomech obarvených po celé délce • • • •délka kultivace buněk kratší (48 hodin), nutné zachytit 1. buněčné dělení, později dochází k reparaci vyšetřovaných aberací • •hraniční patologie – opakovaný nález 5% aberantních buněk (v různých buňkách nacházíme různé aberace, není podstatné jakou chromosomovou abnormalitu v mitóze nalezneme – aberace přítomna (alespoň 1) / aberace nepřítomna) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) zlomy1 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku • působení - fyzikálních faktorů • (ionizující záření) • - chemických látek • (cytostatika, imunosupresiva, oxidační, • alkylační činidla ad. látky používané • v průmyslu) • - biologických faktorů • (virové infekce – pravé neštovice, spalničky, • zarděnky ad.) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace označení cht •jednochromatidové gapy (mezery) • (G´nebo chtg – chromatid gap)- příčně slabě se barvící část chromatidy achromatické léze), také úplné přerušení chromatidy nepřesahující její šířku • G světlý sejmout000r OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace označení cht • •jednochromatidové zlomy (Z´nebo chtb – chromatid brake), oddělení samostatného fragmentu (F) – úplné přerušení chromatidy, pravděpodobně koncová delece (fragmenty mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) • sejmout000k Z Z2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace označení cht •výměny (V nebo chte – chromatid exchange)- výměny části chromatid v rámci jednoho nebo více chromosomů • sejmout000z OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace - výměny V V1 V2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromosomové aberace označení chr • •chromosomové zlomy (Z´´nebo chrb – chromosome break), oddělení párových fragmentů (DF)- úplné přerušení obou chromatid, pravděpodobně koncová delece (fragment obvykle leží paralelně, mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) • sejmout000i DF tmavý OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromosomové aberace označení chr •chromosomové gapy (mezery) (G´´nebo chrg – chromosome gap)- příčně slabě se barvící část chromosomu (achromatické léze), také úplné přerušení chromosomu nepřesahující šířku chromatidy • sejmout000e G OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromosomové aberace označení chr •acentrické ringy, kruhové chromosomy- uzavřené struktury, vznik dvou zlomů na jednom chromosomu, dojde ke spojení – acentrické ringy jsou bez centromery, kruhové chromosomy zahrnují centromeru • • • sejmout000hh R R OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromosomové aberace označení chr • •chromosomy zahrnující více než 1 centromeru- • dicentrické, tricentrické chromosomy… • sejmout000dse sejmout000ggg DIC TIC,DF OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Děkuji za pozornost