DELFIA •Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay • * Fluoroimunoanalytická metoda –velmi citlivá metoda –specifická metoda * Stanovení analytů –nízkomolekulárních –vysokomolekulárních –finská firma Wallac Oy * využívá časově modulované měření fluorescence chelátu lanthanidů –Europium –Terbium –Samarium –Dysprosium delfiaassayprinciple periodická tabulka2 DELFIA - princip * Protilátka nebo antigen označeny fluorescenční sondou – chelátem lanthanidu –nejčastěji Europium * Po proběhlé imunochemické reakci: –přidání „zesilovacího“ roztoku ke vzniklému komplexu •odtržení Eu z komplexu •přeměna Eu na nový intenzivně fluoreskující chelát •Cheláty §komplexní (koordinační) sloučeniny centrálního atomu a dvoj- nebo vícevazných ligandů §ligandy tvoří s centrálním atomem cyklická uspořádání •chelátový efekt - významné zvýšení stability komplexů ve srovnání s jednovaznými ligandy delfiaassayprinciple chelát DELFIA •Fluoreskující chelát (s novým - luminogenním - ligandem): §Fluorescence s velkým Stokesovým posunem fluorescenčního spektra (rozdíl mezi vlnovou délkou excitace a fluorescence) •Vzorek pulzně excitován zářením o vlnové délce 340 nm •Fluorescence měřena v dlouhovlnné části viditelného spektra (Eu - 620 nm) –eliminace pozadí (případná fluorescence matrice se projevuje pouze v krátkovlnnější oblasti) Fluo2 DELFIA - Time-resolved fluorometry (TRF) §fluorescence je dlouhodobá •doba emise delší než u běžných fluoroforů - řádově stovky mikrosekund •Fluorescenční záření se začne měřit se zpožděním stovek mikrosekund (začíná v době, kdy už vyhasla fluorescence pozadí, která je podstatně kratší – nanosekundy) a samotné měření trvá také 400 mikrosekund. •Cyklus (pulsní excitace - prodleva - měření) trvá 1 milisekundu, během měření vzorku (1 sekunda) se tedy 1000x opakuje • a2 a1a DELFIA •- Vysoká citlivost a specifičnost delphia DELFIA • Uspořádání imunochemické reakce: • • •- kompetitivní: • - fluorescenční sondou značený antigen • - intenzita fluorescence nepřímo úměrná • koncentraci analytu ve vzorku • • •- nekompetitivní (sendvičové): • - fluorescenční sondou značená • protilátka • - intenzita fluorescence přímo • úměrná koncentraci analytu ve vzorku a4 DELFIA - současné stanovení více analytů •Fluorescence lanthanidů: §Úzké emisní píky při různých vlnových délkách (Eu 613 nm, Sm 643 nm) §Různá doba trvání fluorescence Eu, Sm • - Při měření se nepřekrývají vlnové délky ani časy odečtu fluorescence Eu a Sm - umožňuje současné stanovení dvou analytů a2 Simultánní analýza2 DELFIA - využití •DELFIA lze použít pro široké spektrum analytů (v principu lze lanthanidem označit každou stabilní sloučeninu obsahující aminoskupinu): • •Proteiny •Peptidy •Oligonukleotidy •Malé organické molekuly (steroidy, aminokyseliny, léky,…) • • •Novorozenecký screening (stanovení ze suché krevní skvrny): • •TSH (kongenitální hypotyreóza) •17-hydroxy-progesteron (kongenitální adrenální hyperplázie) •Imunoreaktivní trypsinogen IRT (cystická fibróza) DELFIA praktické provedení ØPracuje se v mikrotitračních destičkách v uspořádání 8x12 jamek se specifickou protilátkou (obvykle monoklonální) vázanou na pevné fázi • mikrotitr destičky postup DELFIA (suchá krevní skvrna) •1 Vyrážení terčíků (razička) 2 Dávkování činidel 3 Inkubace, třepání • • • • • • • • •4 Odstranění terčíků z jamek 5 Promytí destičky 6 Měření na fluorometru po • (vakuová odsávačka) (promývačka) přidání zesilovacího roztoku • DELFIA disc remover DELFIA dispenser Shaker DELFIA Platewash DELFIA puncher DELFIA fluorometr DELFIA – suchá krevní skvrna • Diagnostický set obsahuje mikrotitrační destičky, roztoky, kalibrátory a kontroly (ve formě suché krevní skvrny) • • Umístění kalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků na destičce kalibrátor kontrola pacient • • Softwarově zpracovaná kalibrační křivka: • kompetitivní uspořádání sendvičové uspořádání destička na monitoru kalibračka kompetice kalibračka sendvič Perkin set DELFIA x AutoDELFIA • „Manuální“ linka DELFIA Analyzátor AutoDELFIA • • • • • • •Metodu DELFIA lze plně automatizovat při • práci s kapalným materiálem (plasma, sérum) •Při práci se suchou krevní skvrnou není dosud • běžná automatizace prvního kroku (vyrážení • terčíků) Delfia linka AutoDELFIA