Molekulárně-biologické techniky MUDr. Dana Bučková, Ph.D. 297px-DNA_replication_split_svg Molekulární biologie •vědní disciplína zabývající se studiem buněčných biologických procesů na jejich molekulární úrovni •věnuje se popisu biologických makromolekul a jejich vzájemným funkčním vztahům •pozornost je především věnována funkci makromolekul podílejících se na dědičnosti organizmů, tedy DNA, RNA a proteinům: • DNA → RNA → protein •integruje ve svém přístupu hlediska biologická, chemická, fyzikální i genetická Image1 DNA07 Využití molekulárně biologických metod •genetika - detekce dědičných chorob (fenylketonurie, cystická fibróza aj.) •farmakogenetika (glukóza-6-fosfát dehydrogenáza, N-acetyltransferáza) •genetické inženýrství - konstrukce genotypů metodami molekulární biochemie •přímý průkaz patogenních mikroorganizmů (CMV, HBV, HCV, borrelie atd.) •kriminalistika (identifikace pachatelů i obětí) •výzkum (hledání zodpovědných genů) Techniky •izolace DNA (RNA) •hybridizační techniky •mapování a sekvenování genomu •amplifikační techniky (pomocí PCR) •metody identifikace polymorfizmů •genová exprese mRNA •Real-time RT-PCR •reverzní traskripce micropipette-electronique-54750 Izolace DNA (RNA) Dna-split •Fenol-chloroformová extrakce nukleových kyselin •přidána směs fenolu, chloroformu, izoamylalkoholu •fenol sráží proteiny, izoamylalkohol zvyšuje rozpustnost fenolu v chloroformu •vodná fáze obsahuje nukleové kyseliny •potřebujeme-li čistou DNA, musí být RNA odstraněna působením RNázy •Adsorpce na silikát •DNA v přítomnosti tzv. chaotropních solí (např. NaI) adheruje na silikátový (skleněný) povrch •DNA lze pak z povrchu částic snadno uvolnit přidáním vody nebo vhodného pufru Izolace DNA dle Sambrooka (1989) •5ml venózní krve do 0,3 ml 0,5M EDTA, + dest. voda (do 20 ml), zmražení na -20°C min na 48 hod •rozmražení ve vlažné vodě cca 20 min, centrifugace 10 min při 5000(4°C), opak. promytí dest. vodou a fyziolog. roztokem, opět centrifugace 10 min při 5000(4°C), k promytému sedimentu 0,5 ml fyziolog. roztoku, přidá se FASANO (5M NaCl, 0,5M EDTA, 1M TRIS, 10% sodium dodecylsulfát) a 20 µg proteinázy K, inkubace při 37°C do druhého dne, •1,4 ml 5M NaCl a 1,4 ml chloroformu, centrifugace 15 min při 8000(4°C), horní vrstva se odpipetuje a přidá se k ní 4 ml ledového izopropylalkoholu •vysrážená vlákna DNA se namotají na skleněný háček, opláchnou 70% etanolem a osuší 5 min na vzduchu, pak se rozpustí ve 250 µl TE pufru a nechá se 24 hod při pokojové teplotě za občasného míchání •zásobní roztok DNA se uchovává při teplotě -20°C extrakce_DNA untitled34 QuickGene – 810 (FUJIFILM) •systém pro izolaci DNA/RNA •vysoká výtěžnost, reprodukovatelnost a bezkonkurenční čas trvání izolace •vysoká kvalita a čistota, quickgene-810 • vhodná pro PCR a kvantitativní real-time PCR, blotování, SNP, genotypizaci, sekvenování, klonování… ….cena 280.000 bez DPH + kity Izolace Izolace1 MagNA Pure Compact Systém (Roche) •izolace DNA, RNA •1-8 vzorků během 30 min. •cartrige s reagenciemi a magnetickými kuličkami •předistalované protokoly ovládané dotykem •minimalizace záměny a kontaminace •kontrola kvality, archivace magnacompact brand izolace_magnet izolace_magnet1 Hybridizační techniky Bez názvu1 Hybridizační techniky •spojování dvou jednořetězcových molekul nukleových kyselin za tvorby hybridu: • DNA x DNA, DNA x RNA, RNA x RNA •obě vlákna jsou v roztoku nebo je jedna hybridizující složka vázána na nosič •hybridizace NK zakotvených na filtrech (nitrocelulózové a nylonové) se značenou sondou •sondu označujeme molekulu nukleové kyseliny, kterou použijeme k vyhledání určité sekvence ve vzorku testované DNA nebo RNA • Podmínky pro hybridizaci •pouze jednovláknové molekuly •důležitá je teplota a koncentrace iontů •teplota a koncentrace iontů příliš nízká => hybridizace i mezi molekulami, které nejsou přesně komplementární • • •teplota tání – závisí na délce molekuly a na poměru G-C párů (3 H můstky) a A-T párů (2 H můstky) hybridizace f3b9f830af_71221171_o2 Southernův blotting •základní princip metody: •štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz •elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky •přenos fragmentů na membránu (nylon, nitrocelulóza) •denaturace DNA •hybridizace se značenou sondou •rtg film, expozice • dobrý Northern_Blot_Scheme DNA26 Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) Fce_polymerazy PCR (polymerase chain reaction) •umožňuje zmnožit (amplifikovat) zvolený úsek DNA teoreticky i z jedné molekuly na měřitelné jednotky (ng a µg) •namnožit úsek DNA můžeme jen tehdy, když známe pořadí nukleotidů na obou koncích tohoto úseku ® primery (20-30 bazí) •byla užita Taq polymeráza, izolovaná z druhu bakterie Thermus aquaticus (teplé prameny v Yellow-stone National Park) a její teplotní optimum je 72 °C, dnes se běžně užívá rekombinantní Taq polymeráza Master mix •umožňuje provádění PCR •musí obsahovat pufr, nukleotidy (dNTP), primery, polymerázu a H2O (pro PCR), Mg2+ •DNA pak doplníme do každé zkumavky zvlášť •mikrozkumavka PCR 0,2 ml s víčkem 853 12691_ms bioplastic-slide Průběh PCR •1. krok: DENATURACE (denaturation) • - při 94-95°C, 15 sec až 1 min •2. krok: VAZBA PRIMERŮ (anealing) • - obvykle 50-55°C, desítky sec až minuta •3. krok: AMPLIFIKACE (extension) • - obvykle 70-74°C, malé 20-45 sec, velké (desítky kb) až 15 min • •Přístroje thermocycler (termocykler, cykler) již od 99.000 bez DPH -174C/G polymorfizmus v IL-6 •9,4 µl H2O pro PCR •1,5 µl Tris-HCl pufru •1,5 µl MgCl2 •0,6 µl od každého primeru (P1, P2) •0,3 µl dNTP •0,1 µl Taq polymerázy •2,0 µl DNA •Celkový objem 16 µl • •denaturace DNA 95°C/2min •35 cyklů: denaturace 94°C/45s, anealing 55°C/25s, extenze 72°C/45s •finální extenze 72°C/5min •chlazení 12691_ms 4310 gradient-thermal-cycler-multigene1 T1Thermocycler_bearbeitet__2006__web 201045 732-1832 PE9600 Image3 Image2 pierce_18_19_large_2 1060 edvocycler-thermal-cycler siteimages%2Ftechne%2FThermal_Cycler_TC_Plus_open_cycler images%5Clisting%5CRoboCycler1 imagessupp_1_645 T3000 28316 26812_a hottop infschem 194_TC-3000G 420x420 220px-Cycler_offen bt0906eppendorfec LightCycler® 2.0 Instrument oid_176035 •slouží k provádění rychlé PCR detekci v reálném čase •ke kvantifikaci cílové NA a dále k následné analýze amplifikované NA pomocí křivky tání •v biologickém výzkumu, při analýze potravin, v soudních a dalších laboratorních disciplínách • GeneON_LightCycler_Kapillaren_LightCycler_Starterset_1_2__1_5__Rotor___5x96_pcs_ lightcycler_schema lightcycler_schema1 hrm-path-utah hrm-temp-shifting-2 Alelicky specifická PCR •detekce bodových mutací, malých delecí •alelicky specifické oligonukleotidy •3 primery, 2 alternativní verze jednoho konce (mutovaná/nemutovaná), druhý konec stabilní •mutace je kryta • primerem • PAI_popis 3743bcebca_71197108_o2 NestedPCR1 Analýza PCR produktu •Hybridizace •Sekvenování •RFLP • (Restriction Fragment Length Polymorphism) •RT-PCR (Real Time RT-PCR) • RNA => cDNA Cobas Amplicor® •provádí amplifikace a detekce v jednom integrovaném systému •výsledky k dispozici během 4 - 6 hodin •HCV, HBV, HIV, CMV, C.trachomatis, N.gonorrhoeae, M.tuberculosis •Interní kontrola eliminuje •falešně negativní výsledky cobas_amplicor_page Kvantitativní PCR v reálném čase •sondy označené fluorescenčním barvivem •hybridizují s templátovou DNA za stejných podmínek jako primery (v oblasti mezi nimi) •DNA-polymeráza má také exonukleázovou aktivitu - odbourává nasedlou sondu •schopnost fluorescence až po uvolnění do roztoku - v průběhu PCR je ozařován vzorek excitačním zářením, které vybudí fluorescenci uvolněného barviva •reverzní transkripce - PCR (Real-time RT PCR) - přesné množství vstupní templátové DNA RT-PCR real-time-koncept Real-time RT PCR untitled Sekvenování 800px-Sanger_sequencing_read_display Sekvenování (sekvenace, sekvencování) •zjišťuje pořadí nukleových bází (A, C, G, T) v sekvencích DNA (jádro, mitochonrie, plazmidy) •od 70. let 20. století je používána metoda Fredericka Sangera, která využívá dideoxynukleotidů a následné elektroforézy •projekt čtení lidského genomu 800px-Sanger_sequencing_read_display Sangerova metoda •sekvence, primer, DNA polymerázu, dNTP, jeden ze čtyř dideoxynukleotidů •začlení se do replikující se DNA, ale zastaví elongaci řetězce - nemá OH skupinu •každý dideoxynukleotid se vloží do jedné ze čtyř nádob •radioaktivní primer Sanger Sequencing Sanger_sequencing_read_display Maxam-Gilbertova metoda •DNA na 5' konci radioaktivně označena fosforem •vystavena chemikáliím, které specificky štípají sekvenci DNA v místě, kde rozpoznají jistou nukleovou bázi •do polyakrylamidového gelu a spustí se elektroforéza •sekvence DNA je GTCATAGCA (čte se zespodu) GTCATAGCA_in_maxam_gilbert_sequencing Pyrosekvenování •novější metoda, vznikla v roce 1996 •mimo DNA polymerázy ještě ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza, adenosinfosfosulfát a luciferin •postupně vkládány nukleotidy různých typů (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – přidáním se z uvolní světelné záření… uvolnění pyrofosfátu z nukleotidu a spotřeba vzniklého ATP luciferázou k oxidaci luciferinu Bez názvu1 Sekvenace nové generace (NGS – next generation sequencing) •vazba fragmentu nukleové kyseliny na mikrokuličky •na každé kuličce ke klonální amplifikaci •čtení sekvence buď sekvenováním syntézou nebo sekvenováním založeném na ligaci A051011_KUZ_SEKVENATOR_V 130886156199927 Sekvenator - ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer Sanger_sequencing_read_display Detekce mutací vs. polymorfizmů untitled Typy polymorfizmů DNA02 DNA03 DNA04 Přímá analýza mutací v lidském genomu DNA05 Nepřímá analýza mutací v lidském genomu DNA06 DNA01 RFLP (délkový polymorfizmus restrikčních fragmentů) •bakteriálních endonukleázy („restriktázy“), které štěpí DNA, v přesně definované sekvenci nukleotidů, např. bakterie Escherichia coli - enzym s názvem EcoRI 800px-1QPS Stepeni%20EcoRI Restrikční endonukleázy •přirozeně se vyskytují v bakteriích •chrání je před infikujícími bakteriofágy •enzym „rozstříhá“ DNA fága, když vnikne do buňky •bakteriální DNA je chráněna metylací sekvencí, které enzym rozeznává •typicky rozeznávají úseky o 4-6 bp •známe asi 300-400 různých endonukleáz Restrikční analýza -573G/C v IL-6 •PCR produkt 543bp 12 µl •voda 2,7 µl •pufr 2,0 µl •BsrBI 0,3 µl •inkubace při 37°C po dobu 4 hod •výsledné fragmenty: 274 a 269 bp (G alela) • 543 bp (C alela) •ELFO ve 2% agarózovém gelu LDL Elektroforéza fragmentů DNA •vkládací pufry - roztoky o vysoké hustotě usnadní vkládání vzorků DNA do jamek •manipulaci se vzorky umožní barviva - pohyblivost při elfo jako DNA (např. bromofenolová modř) •záporný náboj - pohybují v elektrickém poli od katody k anodě •vizualizace pomocí ethidium bromidu popř. jiných barviv (SYBRGreenu, GelGreen a GelRed) elektroforeza Elfo vana schema1 elfo1 UV transluminátor uv-transiluminatory Gelp Gel CD14 X13 -35 37- 58 dle seznamu C(-159)Tbarva s popisem IL-6MnlQD1,5,7,9,11,14,PH34,39,47,52 1145A-G Bez názvu Vyhledávání neznámých mutací •SSCP (single strand conformation polymorphism, polymorfizmus konformace jednořetězcové DNA) •elektroforéza jednovláknové DNA na polyakrylamidovém gelu při nízké teplotě - rychlost, jakou putuje během elektroforézy, závisí na přesné konformaci •odliší i záměnu jediné báze •elfo při 4°C nebo s glycerolem DNA20 _ + MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) •poprvé publikovaná v roce 2002 •vyhledávání více chromozomálních aberací •hybridizace, navázání oligonukleotidových sond •sonda se skládá ze dvou oligonukleotidů •oligonukleotidy spojeny ligací •spojené sondy jsou po denaturaci amplifikovány pomocí klasické PCR •rozděleny kapilární elektroforézou na základě jejich různé délky MLPA MLPA Duchennova/Beckerova svalová dystrofie • X-recesivně vázané onemocnění • gen pro dystrofin má 79 exonů a . velikost 2,4 Mb Děkuji za pozornost 320950597