Chemiluminiscence, elektrochemiluminiscence, FPIA, MEIA Miroslava Beňovská Imunochemické metody •Založeny na reakci antigenu a specifické protilátky za vzniku imunokomplexu •Reakce antigen - protilátka popsána v r.1934 (J. Marrack) •Antigen tvoří stanovovaný analyt •Jako protilátka využívána reagencie Obr 1: Antigeny – hapten, nosič, determinanty • Markomolekuly přirozeného nebo umělého původu (proteiny, karbohydráty, nukleové kyseliny, lipidy aj. ) • Látky schopné vyvolat v živém organismu tvorbu specifických protilátek • Na reakci antigenu s protilátkou se účastní pouze některé její povrchové skupiny, tzv. determinantní skupiny neboli epitopy • Imunitní odpověď může vyvolat pouze kompletní antigen - imunogen • Nekompletní antigen – hapten (např. léky, nízkomolekulární peptidy, hormony, aj.) – vyvolá tvorbu protilátek pouze tehdy, je-li navázán na bílkovinný nosič skenování0007 Antigeny Protilátky •Bílkoviny vznikající v organizmu jako jeho odpověď na přítomnost antigenů • •Vykazují specifickou vazebnou aktivitu k antigenu, proti kterému byly připraveny • •Jsou to imunoglobuliny - v laboratorní praxi jsou obsaženy v tzv. antisérech • • Specificita a senzitivita imunoanalytických metod jsou ovlivněny používanou protilátkou Protilátky: •Používají se protilátky monoklonální a polyklonální • •Monoklonální protilátky – produkovány hybridony, které se připravují fůzí imunizovaných slezinných buňek s nádorovými • - po vyčištění a selekci produkují jen jedinný typ protilátky • - dosahuje se vyšší specificity, kontinuální produkce • •Polyklonální protilátky – připravují se imunizací zvířete, jsou vždy směsí protilátek, jsou schopny rozeznat i izoformy antigenu • - mají proto vyšší citlivost • - závisí na imunizovaném zvířeti, získání může být neopakovatelné • •Pro výslednou senzitivitu stanovení je podstatný také způsob detekce – dostatečnou citlivost mají např. luminiscenční metody Epitopy (antigenní determinanty): imunologicky aktivní oblasti imunogenu (antigenu) - přístupná místa na povrchu imunogenu velikost epitopů je určena velikostí vazebného místa pro antigen na protilátkové molekule (velikostí paratopu) Vazba protilátky s epitopem zahrnuje slabé nekovalentní interakce • • fungují na krátké vzdálenosti, závisí na komplementaritě epitopu a paratopu, aby se tyto interakce maximalizovaly. Antigeny a vazebná místa protilátek Faktory ovlivňující vazbu antigen-protilátka Afinita •Afinita vyjadřuje intenzitu s jakou se uskutečňuje interakce mezi vazebným místem protilátky a epitopem antigenu •Afinita epitopu a paratopu je dána silou nekovalentních interakcí, tj. vodíkovými můstky, disperzními silami, elektrostatickými silami •Vazba je poměrně slabá, ovlivňovaná ionty přítomnými v reakční směsi, iontovou silou, nebo ději na rozhraní pevné a kapalné fáze (např. odtlačování molekul vody, adsorpce, kapilarita aj.) • Avidita •Antigeny obsahují několik determinantů, proto • se zavádí pojem avidita, který charakterizuje • vazebnou energii mezi komplexním antigenem • a protilátkou • •Avidita je síla se kterou polyvalentní protilátka interaguje s polyvalentním antigenem • •Závislá na afinitě, ale bere v úvahu valenci antigenu a protilátky i nespecifické faktory, které ovlivňují vazby mezi antigenem a protilátkou • •Vzrůstá s afinitou vazebného místa a počtem vazebných míst Imunochemické techniky - rozdělení •Podle uspořádání reakce •a) Kompetitivní (soutěživá) imunoanalýza •b) Nekompetitivní (nesoutěživá, sendvičová) imunoanalýza •Podle prostředí •a) Homogenní imunoanalýza •b) Heterogenní imunoanalýza •Podle techniky použité k měření signálu •a) Luminiscenční imunoanalýza •b) Fluoroimunoanalýza •c) Enzymoimunoanalýza •d) Radioimunoanalýza Imunochemické techniky - rozdělení •Podle použité značky •Typy značek: •Luminofory •Fluorofory •Enzymy •Substráty •Radioizotopy •Bez značení: • Imunoturbidimetrie • Imunonefelometrie • •Podle způsobu provedení •Jednostupňové - dvoustupňové • • Automatizované analýzy - manuální analýzy • Imunoanalytické metody •Homogenní imunoanalýza •U této techniky není potřeba odstraňovat reaktanty - oddělovat nenavázanou protilátku (send.) či imunokomplex (komp.) •Vše mimo komplex je inaktivní, nedává signál •Stanovení a detekce probíhá přímo v reakční směsi •Rychlejší a jednodušší technika • •Heterogenní imunoanalýza •Nepotřebné reaktanty nebo imunokomplexy se z reakční směsi odstraňují (např. magnetickou separací nebo ukotvením na pevném nosiči a promytím) •Separuje se značka volná od značky vázané (obě dávají signál) •Reakce s detekcí proběhne až po této separaci Základní postup při heterogenní imunoanalýze: •Smíchání komponent • Inkubace – vznik kompexu antigen - protilátka • Separace (v případě heterogenní • imunoanalýzy, časté využití magnetu) • Reakce značenky komplexu antigen – protilátka • s chemickou látkou startující reakci • s detekovatelným efektem • Detekce (př. chemiluminiscence) Metody stanovení imunoanalýzy - dle detekční techniky – • Detekce s vysokou citlivostí: • luminometrická (LIA, ILMA, CMIA, ECL) • fluorometrická ( MEIA, FPIA, TRACE, DELFIA) • fotometrická – enzymová (EIA,ELISA, EMIT) • radioaktivní (RIA, IRMA) • • Uplatnění pro analyty s nízkou koncentrac • (nmol/l, pmol/l) • • Luminiscenční •Lumino Immuno Assay (LIA) •Chemiluminescent Magnetic Immuno Assay (CMIA) •Immuno Lumino Metric Assay (ILMA) •ElectroChemiLuminiscence (ECL) • Fluorescenční •Fluorescence Immuno Assay (FIA) •Fluorescence Polarization Immuno Assay (FPIA) •Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoro Immuno Assay (DELFIA) •Time Resolved Aplified Cryptate Emission (TRACE) Enzymové - fotometrický princip •Enzymo Immuno Assay (EIA) •Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) •Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) •Immuno Enzyme Metric Assay (IEMA) Enzymoimunoanalýza • Enzymy: křenová peroxidáza • substrát peroxid vodíku, uvolněný kyslík oxiduje bezbarvý chromogen (o-fenylendiamin) • alkalická fosfatáza substrát p-nitrofenylfosfát glukozooxidáza beta-galaktosidáza Radiometrické •Radio Immuno Assay (RIA) •Immuno Radio Metric Assay (IRMA) •Radio Enzymo Assay (REA) •Radio Receptor Assay (RRA) Citlivosti metod Metoda (g) EMIT 10-6 FIA, FPIA, EIA 10-9 RIA, REA, IRMA 10-12 LIA, ILMA 10-15 Kompetitivní stanovení: •Stanovovaný antigen soutěží se stejným antigenem s navázanou značkou o limitované množství protilátky • •Vzniknou imunokomplexy obsahující značku a imunokomplexy bez značky • •Velikost odezvy je nepřímo závislá na koncentraci stanovovaného analytu • •Kalibrační křivka má hyperbolický tvar • •Metoda je vhodná pro nízkomolekulární analyty s malou molekulou (př. B12, folát, teofylin, fenytoin T3, steroidní hormony) • • S výhodou se u ní používají polyklonální protilátky Sendvičové stanovení: •Stanovovaný antigen ze vzorku reaguje a dvěma protilátkami, které jsou v reakční směsi v přebytku • •Jedna protilátka bývá značená, druhá protilátka umožňuje separaci vznikajícího komplexu • •Velikost měřeného signálu je přímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu • ( parabolický tvar kalibrační křivky) • •Metoda se používá pro molekuly s vyšší molekulovou váhou, které umožňují vazbu protilátek na dvě determinanty – př. TSH, ferritin, nádorové antigeny, PSA, S100, srdeční troponiny, osteomarkery • •Často se používájí monoklonální protilátky sejmout0001 Luminiscence •Jev představující vyzařování přebytečné energie ve formě fotonů - dochází k němu při návratu excitovaných elektronů na základní hladiny •Emise světla vzniká následně po excitaci atomů působením jiného záření, elektronů nebo při chemické reakci apod. a po jejich návratu do základního stavu •Děj, při němž záření o kratší vlnové délce (větší frekvenci) vyvolává v látce určitého složení vznik záření o delší vlnové délce (nižší frekvenci) •Část energie se vyzáří ve formě tepla (nesvítivé deexcitační procesy) Druhy luminiscence Luminiscence vzniká po dodání energie v různé podobě •Fotoluminiscence – luminiscence je vyvolána elektromagnetickým zářením (zářivky) - do této kategorie patří fluorescence a fosforescence •Chemiluminiscence – luminiscence je vyvolána chemickou reakcíí (sem patří také bioluminiscence, kdy je emise světelného záření vytvořena živými organizmy – světlušky, medúzy) •Elektroluminiscence – luminiscence je vyvolána elektrickým polem (reklamní panely, nouzové osvětlení) •Katodoluminiscence – luminiscence je vyvolána dopadajícími elektrony (stínítko televizní obrazovky). •Termoluminiscence – luminiscence je vyvolána vzrůstem teploty po předchozím dodání energie •Radioluminiscence – luminiscence je vyvolána působením radioaktivního záření •Triboluminiscence – luminiscence je vyvolána působením tlaku (při deformaci tělesa) •Sonoluminiscence - vyvolána dopadem ultrazvuku Fotoluminiscence •Podle délky trvání } fluorescence • } fosforescence •Dochází k ní vlivem absorpce energie dopadajícího světelného záření • •Pokud po odstranění zdroje ozařování rychle vymizí } fluorescence • •Pokud přetrvává (doznívá) i po odstranění zdroje ozařování } fosforescence Fotoluminiscence •X + hv ---- } X* + hν´ • X a X* je základní a excitovaný stav molekuly • hν a hν´ dopadající a emitovaná světelná energie •Emitovaná energie záření je nižší než energie dopadajícího (primárního) záření •Emitované (sekundární) záření má nižší frekvenci a delší vlnovou délku než světelné záření primární •Rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního a emitujícího záření - Stokesův posun Fluorescence •Přechod mezi tzv. povolenými stavy atomu •K vyzáření fotonů dojde již za pár nanosekund (krátkodobé světélkování - 10-8 až 10-5 s). •Představuje sekundární záření po absorpci elektromagnetického záření Absorpční a fluorescenční spektrum • Posunuto k delším vlnovým délkám než původní absorpční spektrum (Stokesův posun) • Zaujímá zrcadlovou pozici Fluorimetr •Zdroj světelného záření (xenonová nebo xenonová-rtuťová oblouková výbojka) •Monochromátor pro výběr excitačního záření •Kyveta (křemenné)/vzorek •Monochromátor pro sekundární (emisní) záření •Detektor (fotonásobič) · ☼ Mexctt Vzorek Memis D Fosforescence •Přechod tzv. zakázaný. • •Při fosforescenci se fotony vyzáří, ale trvá to až několik minut (dlouhodobé světélkování 10-2s až několik dní) • •Nemá v klinické laboratoři praktické využití Chemiluminiscence •Je luminiscence vyvolaná energií chemické reakce •Vzniká vyzářením fotonu z molekuly luminoforu po jeho chemické oxidaci působením oxidantů (H2O2, O2,…) •Dochází k produkci světelného záření exitovanými molekulami v průběhu chemické reakce •Chemiluminiscence v živých organismech - bioluminiscence •A + B à X* à P + hν • A a B jsou reaktanty, X* je excitovaný meziprodukt, P je produkt v základním stavu a hν je energie emitovaného světelného záření Luminometr •Skládá se z měrné komůrky a detektoru (fotonásobiče) •Měrná komůrka (cela) se vzorkem a ostatními reaktanty obsahuje systém zrcadel – soustřeďují světelné záření na detektor •Vznik záblesků světla - fotony •Počet fotonů zachycuje citlivý fotonásobič Fluorofory, luminofory •Fluoreskující látky obsahují konjugované dvojné vazby • •Spontánně fluoreskuje málo biologických molekul - tryptofan a porfyriny • •Luminofory produkují záření při chemických reakcích • •V imunoanalýze jsou fluorofory a luminofory navázány jako značka na protilátky či antigeny nebo tvoří substrát, eventuelně vznikají až po jeho rozštěpení • Fluorofory, luminofory •Příklady: • Akridin a jeho estery • Adamantyl dioxetan • Methylumbelliferon (MU) • Cheláty platinových kovů (ruténium) • Cheláty lanthanidů (europium) • Luminol, isoluminol • Fluorescein •