Principy vyšetření hemostázy, preanalýza
Trombóza - Hemostáza - Krvácení
Fyziologie krevního srážení
Základní homeostatický mechanizmus
Spolupůsobení různých systémů včetně regulačních zpětných vazeb
^ Cévní stěny
^ Trombocytů
^ Plazmatické koagulační faktory ^ Plazmatické inhibitory ^ Systém fibrinolytický
Dělení testů
Testy globální
^ postihují celý systém (i více) Testy skupinové (screening)
^ postihují určitou část koagulačního systému
^ umožňují odlišení poruch vnitřní a vnější cesty a přeměny fibrinogenu
Testy speciální ^ vyšetřují jednotlivé složky systémů
Dělení testů dle principu
Koagulační
Fotometrické
Imunochemické
Tlirbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické)
Sledování času rozpuštění koagula Sledování rozpustnosti koagula Jiné
Dělení testů dle principu
Koagulační
^ sledování času srážení
manuálně (kývání, rotace) aktivovaná doba srážení
sledování času vytvoření fibrinového vlákna manuálně (háčkování) koagulometr (poloautomat, automat)
• mechanické
• kuličkové (sledování změn pohybu kuličky)
• háčkové
• optické
• nefelometrie (sledování rozptylu světla)
• turbidimetrie (sledování průchodnosti světla)
Dělení testů dle principu
Fotometrické
^ sledování změn zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu - detekce absorbance (A)
end point" (A) kinetické (AA/min)
^ limitace -hemolytické a ikterické vzorky
Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) ^ sledování změn zakalení
detekce změn transmise (propustnosti T)
detekce změn absorbance ^ limitace- chylózní vzorky
Chromogeny
Chromogenní substrát
^ uměle připravený
velkoobjemová     aminokyselinové bezJ)arvý koncovka      raménko zakončené paranitroanmd
Argininem
n Argininem n
Chromogeny
Princip
^ enzymy štěpí substrát - vzniká žluté zbarvení ^ měříme při 405 nm
[j;jríjfjji;rD5jrjjJjj"j
Kinetické měření
1 min
čas měření (min)
Dělení testů dle principu
Imunochemické
^ sledování reakce antigénu s protilátkou aglutinace
• LIA
• ELISA EID
Aglutinační metody
sledování aglutinace viditelných částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu
odečítání makroskopicky
pozitivní( +, ++, +++)/negativní ^ semikvantitativní metody (udaná mez detekce)
metody
^ latexaglutinační (např. FDP, D-Di) hemaglutinační (např. FM)
Příklad vyšetření D-Dimerů
Mez detekce = 0,5 mg/l	neředěný vzorek	vzorek ředěný 1:6	výsledek
aglutinace			< 0,5 mg/l
aglutinace	+		> 0,5 mg/l a < 3,0 mg/l
aglutinace	+	+	> 3,0 mg/l
Liquid immunoassay - LIA metody
Sledování aglutinace m i kro latexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu
Odečítání optickým systémem koagulometru
Změna zakalení (AA/min) Kvantitativní metody (např. D-Di, vWF:Ag...) Limitace
Chylozita vzorku
^1 Hookův jev (vysycení protilátky antigenem)
LIA testy
Provedení (STA© Liatest© D-Dimer)
50 JJ.I vzorku
100 \i\ pufru
inkubace 240 s
150 ml latexového měříme činidla změnu
absorbance
mezi 12 s-140 s
LIA testy
Kalibrace
Sigmoidní ^ Křivka 3. řádu
^ Minimálně 5 bodů
Platí pro celou šarži
ELISA metody
-^Stanovení antigenu(Ag)pomocí protilátky (Ab) značené enzymem (AbE) - kvantitativní
^ inkubace vzorku v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyš. Ag - vazba Ag na Ab
^ odsátí vzorku + promytí
inkubace AbE v jamkách - vazba na Ag
odsátí AbE a promytí
^ detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag -AbE po přídavku chromogenního substrátu (A)
přímá úměra: enzym, aktivita x množství Ag
Elektroimunodifúze - EID metody
vyšetřovaný antigén reaguje s protilátkou přítomnou v agarózovém gelu při elektroforéze za vzniku precipitačního píku
■Adélka píku je přímo úměrná koncentraci antigénu
kvantitativní metoda
Princip El D
kalibrace      vzorky pacientů
Vyšetření plazmatických proteinů
Vyšetření funkční aktivity koagulační metody fotometrické metody Vyšetření antigénu ^ imunochemické metody
^ umožňují odlišení defektů
kvalitativních kvantitativních
Správnost laboratorních výsledků
Faktory objektivní subjektivní
Faktory ^ preanalytické *i analytické ^ postanalytické
Preanalytické faktory
Příprava pacienta Odběr vzorku Transport vzorku Zpracování vzorku Skladování vzorku
Příprava pacienta
Odběr na lačno nebo po lehké snídani bez tuků * Dostatečný příjem tekutin Uvedení času odběru Uvedení léčby
Uvedení komplikace při odběru
Odběr vzorku
Minimální zatažení paže
->Do plastikových nebo silikonovaných skleněných zkumavek
První 2-3 ml nelze použít
■^Antikoagulační roztok pro nesrážlivou krev-citrát sodný v ředění 1:10
Šetrné promíchání krve s citrátem (5-1 Ox)
Nedostatečné promíchání krve s citrátem
Nebezpečí aktivace a srážení vzorku Koncentrování citrátu u hladiny 5 automaty pipetují těsně pod hladinou naředěnou plazmu s nadbytkem citrátu 5 špatné výsledky
ověření po stažení plazmy a promíchání
Antikoagulancia
Citrát sodný
0,109 mol/l (3,2 %) doporučeno * 1,129 mol/l (3,8%)
-»CTAD zkumavky
^ brání aktivaci trombocytů
doporučeno pro testy PAI-1, heparin, PF4.
Správný odběr vzorku
Vyřadit vzorky
-^Sražené
-^S chybným objemem krve (rozdíl 10%)
Hemolytické, ikterické a chylózní
^ hemolytický a ikterický vzorek
ovlivňuje výrazně fotometrická stanovení
>l chylózní vzorek
ovlivňuje výrazně koagulační stanovení na optických koagulometrech a imunochemická stanovení vyhodnocovaná opticky
Správný odběr vzorku
Množství krve
*Méně
^ prodloužení koagulačních časů
APTT citlivé od 90 % objemu PT citlivé od 80 % objemu
^ zkrácení koagulačních časů??
Správný odběr vzorku
Hematokrit 30 % nebo >60 % upravit objem citrátu
100 - hematokrit
ml citrátu -   ================== x ml plné krve
595 - hematokrit
Transport vzorku
->Čas (max 2 hod) * Teplota (18-25°C) Mechanické vlivy (potrubní pošta)
Zpracování vzorku
Odstranění krevních buněk centrifugací Stažení plazmy
Většina testů do 1 - 4 hod po odběru
* Výjimka EGT, EF (15 - 30 min), heparin, PAI-1, LA, vyšetření fcí trombocytů
Vyšetřovaný materiál
Plazma
5 plazma bohatá na trombocyty
centrifugace 10 minut 150 - 250 g, sedimentace 5 plazma chudá na trombocyty centrifugace 15 minut 2500 g ^ bezdestičková plazma
dvojnásobná centrifugace (ultracentrifugace)
Plná krev Sérum
Centrifugace
Výpočet otáček pro danou centrifugu *g = 1,118 x 105x rx N2
r = poloměr otáčení v cm, N = otáčky/min Příklad:
r = 15 cm, 2500g     3860 otáček/min
Skladování primárních vzorků
* Laboratorní teplota 18 - 25 °C a PT 6 hodin a APTT 4 hodiny
^ APTT (léčba heparinem) 1 hodinu a Ostatní vyšetření: 4 hod
Vyšší teplota ne
Uložení v lednici (aktivace FF VII a XII) ne
Zamrazování vzorků
Plazma chudá na destičky/bezdestičková ^ Objem > 500 ul
Zkumavka se zátkou
Správná velikost zkumavky
Zkumavka naplněná do 3/4
Rychlé zamrazení (-70 °C, -196 °C) ■^Sskladování zamrazených vzorků
krátkodobé -20 °C, dlouhodobé: - 70 °C
Rozmrazování vzorků
*Při 37 °C 15 minut Dobře promíchat
Opakované zamrazení není možné
Analytické faktory
Dodržování metodických postupů
Správné pracovní návyky
Správná funkce a kalibrace přístrojů
Výběr diagnostických setů a reagencií
Správná volba kalibračních a kontrolních materiálů
Správně provedená kalibrace a kontroly kvality
Postanalytické faktory
Rozmezí fyziologických hodnot Terapeutické rozmezí Vyjadřování výsledků Vyhodnocení výsledků Interpretace výsledků