Dusíkaté látky_2014
1
Dusíkaté látky
nebílkovinné povahy
Petr Breinek
Hlavní nebílkovinné dusíkaté
látky
Analyt Zdroj Klinický význam
Močovina Amoniak  Onemocnění ledvin
 Onemocnění jater
Kreatinin Kreatin  Onemocnění ledvin
Kyselina močová Purinové nukleotidy  Zvýšený rozpad buněk
 Poruchy metabolismu purinů
Amoniak Aminokyseliny  Onemocnění jater
 Onemocnění ledvin
 Dědičné poruchy
urosyntetického cyklu
Aminokyseliny Bílkoviny  Onemocnění jater
 Onemocnění ledvin
 Dědičné poruchy metabolismu
aminokyselin
3
Nejčastěji se jedná o odpadní
látky, vyjímku tvoří aminokyseliny
4
Jaké jsou doporučené metody?
4
Enzym Referenční
metoda
Certifikovaný referenční materiál
Kyselina močová ID-GC/MS
HPLC
SRM 909b NIST
NIST/SRM 913a
Močovina ID-GC/MS
ID-LC/MS
SRM 909b NIST
NIST/SRM 912a
Kreatinin ID-GC/MS
ID-LC/MS
SRM 967
SRM 909b NIST
NIST/SRM 914a
Cystatin C IFCC/IRMM
metoda
5
MOČOVINA (urea)
Je konečným produktem metabolismu
bílkovin (aminokyselin) – detoxikace NH3
Bílkoviny
Aminokyseliny
Močovinový cyklus (játra)
Močovina (krev → moč)
6
Močovina
• Vzniká v játrech (cca 16g/d= 0,5-0,7 mol/d) v
močovinovém cyklu
( metabolizováním 2,9 g bílkovin vzniká 1g
močoviny)
• Vylučuje se glomerulární filtrací močí ( na rozdíl
od kreatininu je zpětně resorbována), malá část je
metabolizována ve střevě.
V proximálním tubulu se zpětně resorbuje 40-50%
profiltrované močoviny, v distálním tubulu závisí
resorpce na tom, zda je vylučována koncentrovaná
nebo zředěná moč (dehydratace organismu se
projevuje vzestupem močoviny).
7
Koncentrace v krvi závisí na:
• vylučování močoviny ledvinami močí
• její tvorbě (zvýšený rozpad bílkovin - horečka,
sepse, hladovění)
• obsah proteinů v dietě
8
Referenční rozmezí:
S-Močovina muži 2,0-8,3 mmol/l
ženy 2,0-6,7 mmol/l
dU-Močovina 167-583 mmol/24h
9
Metody stanovení
1. REFERENČNÍ metody
a) ID-GC/MS ID-LC/MS
standardní přidání značené močoviny (izotopová diluce) do
analyzovaného vzorku a následné stanovení kombinací
plynové nebo kapalinové chromatografie s hmotnostní
spektrometrií
b) HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie
10
2. Doporučená metoda (enzymová)
(ureáza/GMD)
H2N-CO-NH2 + H20 +  CO2 + 2 NH3
močovina ureáza
2 NH4
+
+ 2H+
11
NH4
+ + 2-oxoglutarát + NADH  L-glutamát +NAD++H20
glutamátdehydrogenáza (GMD)
spektrofotometricky - pokles absorbance NADH při 340 nm
12
3. ELEKTROCHEMICKÉ metody (biosenzory)
GEM 4000,IL
13
Kreatinin vzniká ve svalové tkáni jako
konečný produkt přeměny kreatinu
(dehydratace).
(Kreatin vzniká v játrech, pankreatu a ledvinách,
podílí se na tvorbě energie potřebné ke kontrakci
svalů)
kreatin + ATP  kreatinfosfát + ADP (CK)
kreatinfosfát  kreatin  kreatinin + H20
KREATININ
14
Koncentrace v krvi závisí na:
• vylučování kreatininu ledvinami močí
• syntéze kreatinu (svalové hmotě)
15
Referenční rozmezí: pro věk 18 až 64 let
S-Kreatinin muži 60 (64)-100(104) μmol/l
ženy 50(49)- 90 μmol/l
dU-Kreatinin 8,8-15,0 mmol/24h
16
1. Referenční metoda
ID-GC/MS a ID-LC/MS
standardní přidání značeného kreatininu (izotopová diluce) do
analyzovaného vzorku a následném stanovení kombinací
plynové nebo kapalinové chromatografie s hmotnostní
spektrometrií
• Certifikovaný referenční materiál
SRM-NIST 967
17
2. Kreatinin enzymaticky
1.Stanovení kreatinu vzniklého z kreatininu
• Kreatininasa/kreatinasa/SOX/POD
• Kreatininasa/CK/PK/LD
2. stanovení amoniaku vzniklého z kreatininu
• Kreatininiminohydrolasa//GlDH
18
kreatinin + H20  kreatin
kreatininasa
kreatin + H20  sarkosin + močovina
kreatinasa
sarkosin + H20 +O2 glycin +formaldehyd + H2O2
sarkosinoxidasa
H2O2 +AAP+fenol  chinonmonoiminové barvivo + H20
peroxidasa (oxidační kopulace)
19
Princip a postup měření
1. vzorek + R1
KREATIN + H20  SARKOSIN + MOČOVINA (kreatinasa)
SARKOSIN + H20 +O2 GLYCIN + HCHO + H2O2 (SOX)
H2O2 + AAP + ESPMT  barevný komplex + H20 (POD)
• Odstranění endogenního kreatinu,
H2O2 (katalasa), kyseliny askorbové (AOX)
2. + R2
KREATININ + H20  KREATIN (kreatininasa)
20
kreatinin + H2O  1-methylhydantoin + NH3
kreatininiminohydrolasa
NH4
++2-oxoglutarát+ NADH  L-glutamát + NAD++ H20
glutamátdehydrogenasa (GMD)
Spektrofotometricky, pokles absorbance NADH při
340nm
21
kreatinin + H20  kreatin
kreatininasa
kreatin + ATP  kreatinfosfát + ADP
kreatinkinasa (CK)
ADP + fosfoenolpyruvát  pyruvát + ATP
pyruvátkinasa (PK)
pyruvát + NADH + H+  laktát + NAD+
laktátdehydrogenasa (LD)
Spektrofotometricky, pokles absorbance NADH při
340nm
Jiný princip enzymového stanovení
22
3. Metody využívající Jaffého reakci
• Nespecifičnost měření
• Reagují: proteiny, ketony, bilirubin, některé léky,…
kreatinin +
kyselina pikrová
komplex kreatininkyselina
pikrová
alkalický roztok
23
Metody využívající Jaffeho reakci
Minimální požadavek pro používání:
Metrologická návaznost (SRM-NIST 967)
Návaznost na referenční metodu (ID-GC/MS)
Matematická korekce
(odečet pseudokreatininových chromogenů)
Jaffého metody v pediatrii jsou pro výpočet
eGFR nevhodné
Pro stanovení kreatinu v moči lze považovat
metody enzymatické a Jaffého za rovnocenné
24
4. Jiné metody:
a) elektrochemické metody (biosenzory)
b) HPLC
c) CE
POCT
25
U člověka je konečným produktem metabolismu
purinů.
Puriny jsou součástí nukleových kyselin (DNA), do krve se
dostávají z potravy nebo při rozpadu a obnově buněk těla.
Je málo rozpustná a cirkuluje v krvi v hladinách blízkých
hodnotě, při které již není rozpustná.
Sodná sůl je rozpustnější (uráty).
U lidí a primátů chybí enzym urikáza, která umožňuje
přeměnu kyseliny močové na lépe rozpustný allantoin.
Kyselina močová (2,6,8-trioxypurin)
26
Je vylučována z 1/3 zažívacím traktem a ze 2/3
ledvinami. Není to jen látka odpadní, má význačný
antioxidační účinek.
Zvýšenou koncentraci v krvi (hyperurikemie)
způsobuje:
• její zvýšená produkce (maso, zvýšená degradace
buněk-leukémie)
• její snížené vylučování
27
Referenční rozmezí:
S-Kyselina močová muži 200-420 μmol/l
ženy 140-340 μmol/l
dU-Kyselina močová 0,5-6,0 mmol/24h
28
Metody stanovení
1. Referenční metody
ID-GC-MS a HPLC
standardní přidání značené 1,3-15N kyseliny močové
(izotopová diluce) do analyzovaného vzorku a následné
stanovení plynovou chromatografií s hmotnostní
spektrometrií
nebo stanovení kyseliny močové vysokoúčinou kapalinovou
chromatografií (HPLC)
29
2. Doporučená rutinní metoda
(enzymové stanovení,urikáza/peroxidáza)
kyselina močová +2 H20 +O2 allantoin + H2 O2+ CO2
urikáza
30
kyselina močová +2 H20 +O2 allantoin + H2 O2+ CO2
urikáza
H2O2 +AAP+fenol  chinonmonoiminové barvivo + H20
peroxidáza (oxidační kopulace)
31
3. Jiný princip enzymového stanovení
(urikasa/kataláza)
kyselina močová +2 H20 + O2  allantoin + H2 O2 + CO2
urikáza
H2O2 + methanol  formaldehyd + 2 H20
kataláza
32
kyselina močová +2 H20 + O2  allantoin + H2 O2 + CO2
urikáza
H2O2 + methanol  formaldehyd + 2 H20
kataláza
formaldehyd +2 acetylaceton+ NH4+ 3,5-diacetyl-
1,4-dihydrolutidin+ 3 H20
HANTZSCHOVA kondenzační reakce (A 405nm)
33
4. ENZYMOVÉ stanovení (urikasa/UV)
282-293 nm
34
5. Chemické metody
založené na redukčních vlastnostech kyseliny
močové (oxidace)
např. redukce kyseliny fosfowolframové v alkalickém
prostředí za vzniku wolframové modře
35
Vzniká při degradaci bílkovin (aminokyselin) ve
všech tkáních, především v játrech (také v
ledvinách a svalech).
Nezanedbatelným zdrojem amoniaku je také rozklad
bílkovin bakteriálními enzymy ve střevě.
Je toxický, v játrech je přeměňován na močovinu
a glutamin.
V mozku a jiných tkáních, které nemají schopnost tvořit
močovinu, se amoniak detoxikuje transaminační reakcí s
2-oxoglutarátem, za vzniku glutamátu.
AMONIAK (NH3),amonný kation NH4
+
• dehydrogenační deaminace glutamátu
v buňkách většiny tkání
• bakteriální fermentace proteinů v tlustém
střevě amoniak difuzí přechází do portální krve
 portální krev má relativně vysokou
koncentraci NH3  odstraněn játry
Dva hlavní zdroje amoniaku v organismu
37
Zvýšená koncentrace v plazmě:
• Závažné jaterní onemocnění
• Snížení průtoku krve játry
• Při vrozených poruchách enzymů v močovinovém
cyklu
• Reyeův syndrom (vzácné poškození krve, jater a mozku, většina
případů je vyvolána virovou infekcí)
• Selhání ledvin
Preanalytika:
Krev se musí po odběru ihned zchladit a zpracovat
co nejdříve (30min), neboť hrozí falešně zvýšené
hodnoty.
38
Referenční rozmezí:
P-Amoniak muži 15 - 55 μmol/l
ženy 11 - 48 μmol/l
18 - 72 μmol/l
39
Metody stanovení:
1. Referenční metoda: není k dispozici
2. Rutinní metody
a) enzymové metody (GMD/UV)
NH4
++ 2-oxoglutarát + NADH L-glutamát+ NAD++ H20
glutamátdehydrogenáza
spektrofotometricky
pokles absorbance NADH při 340 nm
40
3. Elektrochemické metody (biosenzory, POCT)
- přímá potenciometrie
- konduktometrie
4. Jiné možnosti stanovení
- chemické metody
- mikrodifuzní metody
41
Význam stanovení:
 diagnostika dědičných poruch metabolismu AK
(screening )
 monitorování výživy u nemocných v těžkém
stavu
Aminokyseliny
42
Metody stanovení:
1. Referenční metoda: neuvádí se
2. Chromatografie: GC, HPLC, TLC (automatické
analyzátory)
3. Elektroforéza
4. Jednoduché chemické reakce
5. Imunoanalytické metody (např. homocystein)
6. Techniky DNA
43
Homocystein
• neesenciální sirná aminokyselina
• není součástí tělesných bílkovin
• vzniká v organismu při přeměně methioninu
(Met) na cystein(Cys)
jako degradační produkt S-adenosylmethioninu
(donor merhylenové skupiny)
• nezávislý rizikový faktor
44
Nezávislý rizikový faktor
kardiovaskulární onemocnění
periferní vaskulární onemocnění (arteriální i
žilní trombóza)
cerebrovaskulární onemocnění
opakované ztráty plodu
Rizikový faktor je přibližně stejný jako u
hyperlipidémie a kouření.
45
Referenční rozmezí:
P-Homocystein 5-15 μmol/l
46
Metody stanovení:
1. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)
• (deproteinace)
• redukce
• derivatizace
• analýza
• detekce (fluorometrická)
Referenční materiál: NIST SRM 1955
47
2. Imunochemické metody
• Redukce oxidovaných forem(např.1,4-dithio-D,L-
threitol)
• Enzymatická přeměna homocysteinu na
S-adenosylhomocystein
• Kompetitivní imunochemická reakce se specifickou
monoklonální protilátkou
• Detekce
ELISA,imunoturbidimetrie, chemiluminiscence,…
48
3a. Enzymová metoda („cyklická“):
Hcy + L-serin Cystathionin
CBS (cystathion β-syntáza)
Cystathionin Pyruvát +Amoniak+Hcy
BBL (cystathion β-lyáza)
Pyruvát + NADH L-Laktát +NAD+
LD (laktátdehydrogenáza)
SPEKTROFOTOMETRICKY
(pokles absorbance při 340 nm)
49
3b. Enzymová metoda („cyklická“) - Roche:
Nejdříve je oxidovaná forma Hcy redukována na volný Hcy
Hcy + SAM SAH + Met
HMTasa (homocystein-S-methyltransferáza)
SAH Hcy +Adenosin
SAHasa (SAH hydroláza)
Adenosin Inosin +NH3
ADA (adenosindeamináza)
NH3 + NADH + 2-oxoglutarát glutamát + NAD+ + H2O
GlDH
Spektrofotometricky (pokles absorbance při 340 nm)
SAM (S-adenosylmethionin), SAH (S-adenosyl-homocystein), Hcy (Homocystein),
Met (Methionin), GlDH (Glutamátdehydrogenáza),
50
4. Kombinace plynové chromatografie s hmotovou
spektrometrií (GC-MS)