HbA1c_2014
1
Glykovaný hemoglobin A1c
(HbA1c)
Petr Breinek
2
Rutinní a efektivní nástroj sledování
průběhu DM (diabetes mellitus)
• Ukazatel dlouhodobé hodnoty
koncentrace glukózy v krvi (kompenzace
diabetu)
• Diagnostické kritérium DM
• Kontrola terapie
• Včasné odhalení hrozících komplikací
Klinický význam stanovení HbA1c
3
Glykace
Glykace je neenzymové navázání
(adice) cukru na proteiny za vzniku
fruktosaminu.
Glykovaný albumin vzniká navázáním cukru
na albumin
4
Faktory ovlivňující
neenzymovou glykaci proteinů
• Koncentrace sacharidů a proteinů a
jejich kolísání
(koncentrace proteinů v krvi relativně
konstantní, rychlost glykace je úměrná
koncentraci sacharidů)
• Doba expozice
• Biologický poločas daného proteinu
• Teplota
5
Glykace hemoglobinu
- rychlá tvorba labilní Schiffovy báze (aldimin)
-- pomalý Amadoriho přesmyk za vzniku stabilního
ketoaminu (ireversibilní)
-- koncentrace závisí na koncentraci glukózy a
poločasu života erytrocytů
- H2O
Glukosa Aldimin
(Schiffova báze)
Amadoriho
přesmyk
Ketoamin
Hb-N
CH
C
C
C
C
CH2OH
H
OH
OH
H
H
HO
H
2
O
Hb-N
C H
C
C
C
C
CH2OH
OH
H
OH
OH
H
H
H
HO
Hb-NH 2 + O
C H
C
C
C
C
CH2OH
OH
H
OH
OH
H
H
H
HO
6
Názvosloví
 HbA1c
 βN-1-deoxyfruktosyl hemoglobin
 DOF hemoglobin
 Hemoglobin beta chain(Blood)-N-(1deoxyfructos-1-yl)hemoglobin
beta chain
Hemoglobin (Hb)
Složená bílkovina – hemoprotein
• Bílkovina (globin)
• Hem
Tato transportní molekula plynů tvoří 95% objemu
krvinky
N
N
N
N
Fe2+
Složen ze 4 podjednotek:
2 α + 2 ß = Hb A (95%)
2 α + 2  = Hb A2 (2-3%)
2 α + 2  = Hb F (<2%)
8
Hemoglobiny
Hb
HbA0 HbA1
HbA1a HbA1b HbA1c
HbA
(ßß)
HbA2
()
HbF
()
95% <2%2-3%
Normální
Hb u dospělých Fetální Hb
Neglykovaný
Glykovaný
94%
• hlavní glykovaný Hb
• > 20 let využíván pro
kontrolu glykémie
5%
9
HbA0
HbA1c
Val His Leu Thr Pro Glu
Glu Val His Leu Thr Pro Glu
Glu Lys Ser
. . . .
Glu Lys Ser
. . . .
HbA1c vzniká glykací na N-konci ß-řetězce
hemoglobinu
Glykována je
první AK - Val
ß-chain
10
• Není třeba konzervovat krev (větší stabilita)
• Menší intraindividuální variabilita (CV<2%)
• HbA1c není ovlivněn krátkodobou
glykémií
• Nemocný nemusí být lačný
• Využití pro diagnostiku i kontrolu léčby
Výhody proti glykémii
11
Vyjadřování výsledků
 od 1.1. 2012
mmol/mol (např.45 mmolHbA1c/mol Hb)
 %DCCT (převážně v USA)
(Diabetes Control and Complication Trial)
2010, konsensus ADA, IFCC, IFD, EASD, ISPAP
12
Rozhodovací meze
Referenční interval 20 – 42 mmol/mol
Rozhodovací meze
Kompenzovaný diabetes
(dospělí, negravidní)
43 – 60 mmol/mol
14
Preanalytické podmínky
• Krev (B) - odběr do EDTA
• Stabilita: 2d (+20 až +25°C)
1týden (+4 až +8°C)
1rok (<-20°C lépe při -80°C)
Poznámky:
- snížená hodnota doby života erytrocytů
- Hemoglobinopatie, karbamylace (uremičtí pacienti),…..
15
Mezilehlá preciznost* CV < 1,0 %
Pravdivost (bias)* b < 1,5 %
Celková chyba* TE < 3,1 %
Metrologická návaznost na referenční
metodu
LC-ESI/MS
Požadavky na analytickou
kvalitu měření
Intraindividuální biologická variabilita 1,9 Preciznost odvozená z biologických variabilit 1,0
Interindividuální biologická variabilita 5,7 Pravdivost odvozená z biologických variabilit 1,5
Celková biologická variabilita Celková chyba odvozená z biologických variabilit
3,1
www.westgard.com
16
Nejistota výsledků měření
Na základě kombinace dílčích nejistot
odpovídajících preciznosti, hodnotě bias a
hodnotě Cvi lze odhadnout výslednou
kombinovanou nejistotu výsledků měření
(Uc) 6 až 9% (95% interval spolehlivosti)
17
Metody stanovení
1. Referenční metody
• Izolace a hemolýza erytrocytů (+ odstranění labilních pre-HbA1c)
• Enzymové štěpení hemoglobinu (endoproteináza Glu-C)
• Analytické měření (detekce glykovaných hexapeptidů)
a) LC/ESI /MS
b) CE/ESI/MS
18
2. Doporučené metody
a) Chromatografické
 HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie)
 LC (nízkotlaká kapalinová chromatografie)
• Afinitní chromatografie (aminofenylboronátová)
• IEC (kapalinová chromatografie s výměnou
iontů)
Tosoh G8 System
Eluční pufry
Hemolyzační a
promývací roztok
Software
Podavač vzorků
Kolona
Statimová pozice
20
Premier Hb 9210
Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel
Hemolyzovaný vzorek je dávkován do kolony v mobilní fázi – pufr A
Glykovaná složka se váže na boronát, neglykovaná složka prochází kolonou na
detektor
Glykovaná složka je eluována pufrem B
LC:Boronátová afinitní chromatografie
G
Hb
G
Hb
Hb
HbHb
Hb
Hb
Hb
Hb
Kolona Detektor
Reagent B:Reagent A:
Dávkování vzorku
Hb
G
Hb
Hemoglobin
Glykovaný hemoglobin
23
 Doba života erytrocytů (120 ± 10 d) !
 Přítomnost vzácnějších typů hemoglobinu
(1165 variant Hb, např. HbS, HbC, HbE, HbD)
 Hemolýza, Ikterus
 Těžké krvácení
 Věk, rasa, terapie,…
Co může ovlivnit hodnocení
vyšetření HbA1c
24
b) Elektroforetické
ELFO (elektroforéza)
IEF (izoelektrická fokusace)
CE a HPCE (kapilární elektroforéza)
25
c) Imunoanalytické
IT (imunoturbidimetrie)
TINIA (Turbidimetric Inhibition Immunoassay)
(Imunoinhibiční turbidimetrie)
IN (imunonefelometrie)
CMIA (chemiluminiscenční imunoanalýza na
mikročásticích)
26
CMIA (např. Abbott Architect i2000 SR)
 Hemolýza erytrocytů, uvolnění HbA1c
 Inkubace s magnetickými mikročásticemi, navázání antigenu
(HbA1c)
 Promytí, odstranění nenavázaného antigenu
 Přidání Anti-HbA1c mab (konjugát) značený akridiniem
 Vazba konjugátu na mikročástice
 Promytí, odstranění nenavázaného konjugátu
 Chemiluminiscence (po změně pH a přidání peroxidu)
27
d) Spektrofotometrické
Enzymové