Lipidy_2014
1
Lipidy
Lipoproteiny
Apolipoproteiny
Petr Breinek
2
Lipidy
Lipos = tuk
Význam lipidů v organismu
1) Zdroj energie (tukové buňky) + zdroj esenciálních
mastných kyselin
2) Strukturní funkce (součást buněčných membrán)
3) Vitamin D, kortikoidy, pohlavní hormony, …
4) Ochranná funkce (tepelná izolace- tuková tkáň;
neurony- myelinová pochva)
 Stanovení koncentrace lipidů v krvi: nyní bez
významu (referenční rozmezí 4,0 - 8,0 g/l)
3
Transport lipidů
I. Krev a lymfatický systém
• Vazba na specifické proteiny
(mastné kyseliny na albumin)
• Tvorba makromolekulárních komplexů
lipidy + apolipoproteiny = lipoproteiny
II. Zásobní lipidy a v buněčných
membránách
Obecná struktura lipoproteinu
Fosfolipidy
Cholesterol
Apoproteiny
Apoproteiny
TAG
Estery
cholesterolu
jádro
vnější vrstva
Lipoproteiny jsou transportní formou
nepolárních lipidů v krvi
5
Odběr krve
• pacient lačný 9-12h
• 2-3 dny má být vynechán alkohol,
• Krev odebrána bez dlouhé venostázy,
• Pacient má dodržovat alespoň 2 týdny stávající
životní styl
• Vyšetření z krevního séra a plazmy je
rovnocenné
Diagnostické rozhodnutí o přítomnosti zvýšeného
rizika je možné pouze na podkladě průměru
dvou následných měření z dvou odběrů u
jednoho pacienta, provedených v intervalu 1-8
týdnů, nejlépe v téže sérii měření.
6
Jaký je stav standardizace metod?
7
Referenční metody
Cholesterol ID-GC/MS, ID-LC/MS
(Cholesterol 13C2)
Triacylglyceroly ID-GC/MS (Tripalmitin 13C3)
HDL cholesterol UC a kvantifikace (CDC)
LDL cholesterol UC a kvantifikace (CDC)
8
Referenční metody
ApoAI není definována
(návrh HPLC/MS)
ApoB není definována
Lp(a) není definována
9
Ultracentrifugace Chylomikrony LDL IDL VLDL HDL
ELFO Chylomikrony beta-LP široké beta-LP prebeta-LP alfa-LP
Hustota (kg/l) < 0,94 1,063 1,019 1,006 >1,21
Velikost (nm) 10 000 220 315 500 85
Obsah CHOL(%) 3 59 41 17 40
Obsah TG(%) 88 7 32 56 6
Obsah proteinů(%) 1 25 18 10 50
Rozdělení lipoproteinů
Lp(a)
10
Chylomikrony (CM)
• vznikají v absorpčních buňkách střevní sliznice
• nesou TG, CH a lipofilní vitaminy přijaté potravou
• obsahují apo-B48, stopy apoA (jiné neumí střevní
buňka syntetizovat)
• syntéza apo-B 48 limituje tvorbu CM
• pronikají do lymfy
• prostřednictví lymfatických cév jsou transportovány
do krve
11
Jaký je osud chylomikronů v krvi ?
• do krve vstupují 1-2 h po jídle
• z HDL jsou na CM přenášeny Apo E a Apo CII
• v krevních kapilárách na CM působí lipoproteinová
lipáza
12
VLDL
• vznikají v hepatocytech
• nesou cholesterol převážně přijatý potravou a
triacylglyceroly syntetizované v játrech
• obsahují ApoB100, malá množství ApoA a
ApoC-I a ApoE
13
• V krevních kapilárách působí na VLDL
lipoproteinová lipasa
• Triacylglyceroly jsou štěpeny na mastné
kyseliny a glycerol
• Z HDL jsou na VLDL přenášeny Apo E a Apo CII
• VLDL se mění na IDL
• IDL jsou vychytány játry nebo přeměněny na LDL
Jaké jsou další změny VLDL?
14
• vznikají z VLDL a IDL
LDL
15
• IDL i LDL částice mohou být obohacovány estery
cholesterolu z HDL
• IDL částice jsou vychytávány játry pomocí Apo-E
receptoru
• LDL jsou vychytávány periferními tkáněmi a játry
receptorově zprostředkovanou endocytozou (ApoB
100)
Jaký je osud IDL a LDL?
16
Uvolnění cholesterolu z LDL do buňky
Vychytávání LDL pomocí
specifických receptorů
LDL
Buněčná membrána
Recyklace receptoru
Fůze s
lyzosomem
LDL
receptor
Specifická
interakce mezi
Apo-B100 a
receptorem
17
HDL
• vznikají v hepatocytech (částečně i v enterocytech)
• HDL přijímají cholesterol z periferních tkání a
zprostředkují jeho transport do jater
• pro jejich funkci je důležitý enzym LCAT
lecitincholesterolacyltransferáza – esterifikace cholesterolu
• existuje několik typů HDL (HDL1 – HDL3), které se liší
velikostí a obsahem lipidů
18
Lp(a)
• Lipoprotein o nízké hustotě
• Kromě Apo B100 má navíc Apo(a)
• Apo(a) je podobný plasminogenu
• Polymorfismus (hustotní a délkový)
• Koncentrace Lp(a) v krvi dána geneticky
Problémy s kvantitativním
stanovením Lp(a)
• Neexistuje primární referenční materiál
• Sekundární kalibrátor (2003 IFCC SRM 2B)
• Výsledky v nmol/l místo g/l (?)
• Nejednotnost protilátek
• Problémy v preanalytické fázi
21
MEZI LIPOPROTEINY PROBÍHÁ
VÝMĚNA LIPIDŮ I PROTEINŮ
22
Stanovení lipoproteinů
1) ULTRACENTRIFUGACE
23
2) ELEKTROFORÉZA
24
3) SELEKTIVNÍ PRECIPITACE
25
4) IMUNOSEPARACE
26
Apolipoproteiny
• PROTEINOVÁ SLOŽKA LIPOPROTEINŮ
• FUNKCE:
AKTIVÁTORY A INHIBITORY ENZYMŮ
interakce s RECEPTORY
tvorba buněčných STRUKTUR
účast na přenosu nebo výměně lipidových
částic
27
ApoAI
apolipoprotein v HDL
ApoB-100
apolipoprotein v LDL a VLDL
ApoB-48
apolipoprotein v chylomikronech
Apo(a)
apolipoprotein v Lp(a)
28
Význam stanovení ApoB-100
Informace o počtu LDL částic
 1 částice LDL obsahuje 1 částici Apo-B100 a
různé množství cholesterolu a triacylglycerolů
 Při stejné hodnotě LDL cholesterolu vyšší
hodnota Apo-B100 svědčí o větším počtu LDL
částic (převaha malých hustších částic)
 Posouzení rizika kardiovaskulárních následků
aterosklerózy
29
Stanovení ApoAI a ApoB
1) IMUNOTURBIDIMETRIE
2) IMUNONEFELOMETRIE
• Referenční metody nejsou definovány
• CRM: WHO SP1-01 a WHO SP3-07
Apo AI Dmax (SEKK) 21 %
TMU teor. 9,1%
Apo B Dmax (SEKK) 21 %
TMU teor. 11,6 %
30
Cholesterol
bílá krystalická látka
31
Cholesterol celkový =
Cholesterol +Cholesterol esterifikovaný
32
Cholesterol
2. Enzymové stanovení (CHOD-PAP)
• Hydrolýza esterů cholesterolu
(CHE, cholesterolesterasa)
• Oxidace cholesterolu
(CHOD, cholesteroloxidasa)
• Barevná reakce (oxidační kopulace)
(POD, peroxidasa + chromogen, Trinderova reakce)
Dmax (SEKK) 8,5%
TMU teor. 8,5%
33
estery cholesterolu + H2O  cholesterol + mastné kyseliny (CHE)
cholesterol + O2  Δ4-cholesten-3-on + H2 O2 (CHOD)
H2 O2 + chromogen  H2 O2 + barvivo (POD)
H2 O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu  chinoniminové barvivo + 4 H2O
34
Mezilehlá preciznost* CV < 2,7 %
Pravdivost (bias)* b < 4,0 %
Celková chyba* TE < 8,5 %
Metrologická návaznost na referenční
metodu
Požadavky na analytickou
kvalitu měření
Intraindividuální biologická
variabilita
5,4 Preciznost odvozená z biologických
variabilit
2,7
Interindividuální biologická
variabilita
15,2 Pravdivost odvozená z biologických
variabilit
4,0
Celková biologická variabilita Celková chyba odvozená z biologických
variabilit
8,5
www.westgard.com
35
HDL cholesterol
2. HOMOGENNÍ (přímé) metody
a) Imunoseparace (Wako)
(protilátky proti lidským ß-lipoproteinům
b) Maskování (Daiichi)
(polyanionové polymery)
c) Modifikované enzymy a maskování (Kyowa)
(enzymy modifikované PEGem + sulfáty
cyklodextrinu)
Dmax (SEKK) 15 %
TMU teor. 11,1 %
37
LDL cholesterol
2. HOMOGENNÍ(přímé) metody
a) metody s maskováním non-LDL částic
• maskování VLDL a chylomikronů
cyklodextrinsulfátem
• oddělení HDL od LDL detergentem
• stanovení cholesterolu v LDL
• detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení
Dmax (SEKK) 15 %
TMU teor. 13,6 %
38
b) metody s odstraněním non-LDL částic
• Přidání činidla 1
LDL + ochranné činidlo → „chráněné“ LDL
HDL, VLDL, chylomikrony → cholestenon + H2O2
(CHO, CHE)
H2O2 → H2O
(kataláza)
• Přidání činidla 2
LDL + uvolňovací činidlo → LDL
LDL → cholestenon + H2O2
(CHO, CHE)
H2O2 + chromogen → H2O + zbarvení
(peroxidáza)
40
Triacylglyceroly
Triacylglyceroly = estery glycerolu
Problémy při stanovení:
volný glycerol
diacylglyceroly
monoacylglyceroly
Odběr krve musí být nalačno (12 až 14h)
41
Triacylglyceroly
2. Enzymové stanovení
• Hydrolýza (vznik glycerolu)
• Fosforylace (vznik glycerol-3-fosfátu)
a) Oxidace glycerol-3-fosfátu
barevná reakce
b) Stanovení ADP
stanovení pyruvátu (optický test)
Dmax (SEKK) 15 %
TMU teor. 28 %
42
triacylglyceroly + 3H2O  glycerol + 3 mastné kyseliny
LIPASA
glycerol + ATP  glycerol-3-fosfát + ADP
GLYCEROLKINASA (GK)
glycerol-3-fosfát + O2  dihydroxyacetonfosfát +H2O2
GLYCEROLFOSFÁTOXIDASA (GPO)
2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu  chinoniminové
barvivo + 4 H2O
PEROXIDASA (POD)
43
glycerol + ATP  glycerol-3-fosfát + ADP
GLYCEROLKINASA (GK)
ADP + fosfoenolpyruvát  ATP + pyruvát
PYRUVÁTKINASA (PK)
pyruvát + NADH +H+  laktát + NAD +
LAKTÁTDEHYDROGENASA (LD)
45
Doporučené hodnotící meze
Analyt Muži Ženy
Cholesterol (mmol/l) 2,90 5,00 2,90 5,00
LDL cholesterol (mmol/l) 1,20 3,00 1,20 3,00
HDL cholesterol (mmol/l) 1,00 2,10 1,20 2,70
Apo A1 (g/l)* 1,00 1,70 1,10 1,90
Apo B (g/l)* 0,50 1,00 0,50 1,00
Klinická biochemie a metabolismus, 1 (2010) 45-46