Imunohematologie MUDr. Alena Pejchalová TTO FN Brno Obecná imunohematologie • •Nauka o antigenech, protilátkách, imunitních reakcích v souvislosti s přípravou a podáním transfuze a u některých jiných klinických stavů •Imunologie aplikovaná na krevní buňky (erytrocyty, granulocyty, lymfocyty, trombocyty) •Řeší specifickou imunohematologickou problematiku (hemolytické onemocnění novorozence, hemolytické anemie, transplantace, potransfuzní reakce) Imunita • •Obecná definice: odolnost proti nemocem, antigenům •Zajišťuje ji systém buněk, tkání a molekul, tzv. imunitní systém •Dva typy: imunita přirozená (iniciální protekce proti antigenům) a získaná (pomalejší, ale specifická a více efektivní obrana) Přirozená/ nespecifická/ naivní •Stále přítomná u hostitele, okamžitá a uniformní reakce, brání vstupu antigenů do organizmu a rychle je eliminuje • –Neporušený epitel, jeho enzymy a nepatogenní kožní flora –Humorální složky plazmatické = komplement, cytokiny, interferony –Buňky fagocyty, NK lymfocyty –Tyto mechanizmy reagují s mikroby, ale ne s neinfekčními cizími substancemi Získaná/ specifická/ adaptivní •Stimulují ji antigeny, které pronikly do tkání • –Buňky (lymfocyty) s receptory, kterými rozpoznávají specifické substance antigenů –Startuje rozpoznáním antigenu v lymfatických orgánech –Má dvě specializované funkce •Humorální složku = protilátky tvořené B lymfocyty, eliminují mikroby z extracelulárních tekutin •Buněčnou složku = T lymfocyty, CD4+ a CD8+ eliminují mikroby z buněk Specifická imunita/ lymfocyty •Naivní lymfocyty rozpoznávají antigeny •Efektorové reagují s antigeny, žijí krátce •Paměťové přežívají v klidu, po dalším kontaktu s původním antigenem navodí sekundární (anamnestickou) imunitní odpověď •Exprimují specifické receptory pro antigeny •Rozlišují se pomocí povrchových proteinů (CD znaky) • •Vzájemná interakce mezi lymfocyty: • •Aktivované Th stimulují B lymfocyty pomocí cytokinů → různé třídy protilátek •Změny Treg lymfocytů → dysbalance T x B lymfocytů • • Imunohematologie = protilátkový typ specifické imunitní odpovědi • •Protilátky /imunoglobuliny/ sekreční Ig • •glykoproteiny tvořené B lymfocyty •na membráně B bb. jako antigenní receptory (BCR) nebo jako sekreční proteiny rozpuštěné v plazmě a v mukózních tekutinách •neutralizují a eliminují antigeny z krve a z orgánů, brání jejich kolonizaci v organizmu •působí pouze extracelulárně •rozeznávají jen určité typy antigenních molekul (sacharidy, složité chemické struktury s lipidy a proteiny) • • • • Funkce Ig: rozpoznání Ag + sekrece •4 polypeptidové řetězce protilátky H2L2 •Každý obsahuje dva identické H a identické L řetězce •Tvoří tvar písmene Y, vzájemně spojené •Dva fragmenty Fab + jeden fragment Fc, mezi nimi flexibilní otočná oblast •Variabilní část pro vazbu antigenu • (epitopy, determinanty antigenu) •Konstatní oblast pro jinou vazbu (komplement, fagocytoza) •Lehké řetězce: kappa, lambda •Těžké řetězce: rozlišení na • izotypy IgM,IgD,IgG,IgA,IgE • • • • Funkce Ig • •IgG,IgD,IgE monomery = 2 vazebná místa pro Ag •Sekreční IgA dimer = čyři místa pro Ag •IgM pentamer (hexamer) = 10 (12) míst pro Ag •Protilátka tak může vázat 2-10 epitopů antigenu •Vznik imunních komplexů Ab+Ag •Protilátková odpověď na antigeny: T-independentní nebo T-dependentní podle účasti Th buněk • • •Afinita: síla reakce mezi 1 antigenní determinantou a 1 vazebným místem protilátky •Avidita: síla vazby mezi multivalentními protilátkami a antigeny s více determinantami •Specifita: schopnost protilátky reagovat jen s určitou antigenní determinantou •Cross-reakce: schopnost protilátky reagovat s více antigenními determinantami •Klinický význam protilátek (hemolýza) pro HTR, HON, HA –AB0,Rh,Kell,Duffy,Kidd,Ss,Vel – vždy významné/ antigen-negativní transfuze –M,N,P1,Le,A1,Lutheran- důležité při reaktivitě při 37°C/ kompatibilní transfuze • •O vlastnostech a významu protilátky rozhodne: specificita, Ag:Ab • ratio, avidita, reakční teplota, lytická kapacita, typ Ig, • dále vlastnosti monocytů, solubilní antigeny u příjemce • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Typy protilátek • •Polyklonální: odvozené z různých buněčných linií •Monoklonální: identické protilátky produkované jedním typem B bb., všechny klony mají jednu společnou buňku, rozeznávají jeden určitý epitop, stejný alotyp, idiotyp •Použití diagnostické (v imunohematologii při sérologickém vyšetření krevních skupin) i léčebné • • Antigeny • •Cizí substance navozující imunitní odpověď •Cizí oblasti = antigenní determinanty (epitopy) •Jeden antigen může mít více různých epitopů •Ne všechny oblasti antigenu jsou imunodominantní • •Antigeny v imunohematologii = krevní skupiny a histokompatibilní antigeny (transplantační) na různých krevních buňkách • Antigeny • •Různé buněčné funkce •Antigeny krevních skupin erytrocytů – - zajišťují transport vody, urey, iontů – - jsou receptory pro mikroorganizmy – - mají adhezivní funkce – - jsou enzymaticky aktivní – - udržují morfologické a strukturální vlastnosti erytrocytů Antigeny •Obvykle velké molekuly a složené sloučeniny (proteiny, polysacharidy, lipidy) •Větší molekuly a jejich komplexy = lepší imunogeny •Imunogenicita závisí na stupni cizorodosti, strukturální stabilitě molekuly, dostatečném počtu Ag determinant, době expozice Ag, způsobu podání •Hapten = malá molekula neimunogenní, spojuje se s větším nosičem (plazmatické proteiny) Komplement •Aktivace komplementu při vazbě mikrobů nebo protilátek na buňky •3 aktivační cesty: klasická • lektinová • alternativní •Odlišné mechanizmy a průběh aktivace •Při aktivaci protilátkami: 1molekula IgM stačí pro vazbu C1q, ale pro stejnou vazbu musí být 2 molekuly IgG • • Působení komplementu na erytrocyty •Velké množství = intravaskulární typ hemolýzy (destrukce při vzniku MAC+ vazoaktivních peptidů a/nebo při nedostačujícím fagocytárním systému): lýza erytrocytů •Malé množství = hemolýza extravaskulárně (destrukce přes Fc komplementový receptor makrofágů): fagocytóza erytrocytů • • •např. akutní HTR, CAD……..i.v.lýza •např. pozdní HTR, HON, WAIHA …..fagocytóza Hemolýza •Zkrácené přežívání erys na méně než 100-120 dní •Kompenzovaná x manifestní HA •Vrozené x získané HA • •Intravaskulární hemolýza –Destrukce erys v intravaskulárním prostoru –Uvolnění volného Hb do krve –Hemoglobinemie, hemoglobinurie –Pokles sérového haploglobinu –Vyšší LD • • • • Hemolýza •Extravaskulární hemolýza –Destrukce v buňkách RES –Vyšší sérový bilirubin /nepřímý –Degradační produkty bilirubiny v moči a stolici –Vyšší LD – •Klinický význam rozlišení typu hemolýzy: upřesnění typu HA (PCH, WAIHA), terapeutický Komplementové inhibiční mechanizmy • •Regulace na úrovni: • •C1q …………………..C1 INH •C3konvertáza………..DAF, C4BP, CR1 •C5 konvertáza……….CR1, H •MAC…………………..CD59 • •Komplement v imunohematologii: • •Souvisí s krevními skupinami Chido/Rodgers (C4), Cromer (CD55-DAF) •Destrukce transfundovaných erytrocytů •Destrukce erytrocytů při HON •Destrukce erytrocytů při HA •Imunní komplexy cév, plaků u revmatických aj. autoimunitních onemocnění • Autoimunita •Reakce imunitních buněk s vlastními antigeny při selhání fyziologické regulace •Vznik autoprotilátek nebo cytotoxická aktivace T bb. včetně cytokinové aktivace B bb. vede k poškození tkání •Dědičná dispozice (MHC geny i non-HLA geny) + spouštěcí faktory z okolí (infekce, záněty) •U 1-2% jedinců manifestní porucha autoimunity •V imunohematologii nálezy u AIHA, po transplantacích, po lécích apod. Imunohematologická vyšetření Cíl: detekce imunních komplexů Ag+Ab • •Hemaglutinační reakce = aglutinace (antigen = partikule ery, trc, leu) •Vzácně jiné metody ( ELISA, imunofluorescence, FCM, dnes častěji chipy, PCR...) •Rutinní použití pro stanovení antigenů, vyšetření protilátek, předtransfuzní testy •Různé provedení metody - testy sklíčkové, zkumavkové, pevná fáze, sloupcová aglutinace v gelu •Testy při teplotě 20-23°C (PT), 4°C, 37°C dle cíle vyšetření • pasivní aglutinace titr Přímá aglutinace Titr / prozona - aglutinace kvantitativní Reakce-spojení Ag x Ab • Slabé non-kovalentní vazby • Reverzibilní za určitých podmínek • • •Typy chemických vazeb –Hydrofobní (proteinové Ag) –Vodíkové (sacharidové Ag) –Elektrostatické-polarizované –Van der Waalsovy síly Aglutinace přímá/ solný test •1.fáze senzibilizační •2. fáze aglutinační • •1. fáze Vytvoření slabé vazby mezi Ag a Ab • –Hlavně pro IgM –Podle typu Ig závisí na teplotě (klinický význam 37°C, při vyšší teplotě disociace molekul Ab z vazby, při nižší teplotě prodloužení inkubace) –Iontová síla prostředí (obsah iontů Na a Cl = izotonický roztok PBS, neutralizující efekt. Při použití LISS rychlejší vznik imunních komplexů) –pH prostředí (přijatelné cca 7. Pro některé Ab individuální. PBS zajišťuje alkalizaci. V nižším pH disociace Ab) –Počet antigenních míst/densita ( nadbytek Ag x nadbytek Ab), poměr sérum/erys (snížení vede k vyšší senzitivě testu) • agregáty ery •2.fáze Aglutinace •Vytvoření pevného spojení mezi Ag a Ab –Vznik pevných vazeb mezi senzibilizovanými – erys (navázané protilátky přemostí a vzájemně spojí erytrocyty) – –Při: změně vzdálenosti mezi erys (zeta potenciál) pomocí centrifugace, proteolytických fermentů, koloidů, polymerů, additiv testů, chemických úprav – diagnostických protilátek • – Aglutinace nepřímá • •Zásadní význam v imunohematologii •Hlavně pro IgG, nereagující přímou aglutinací •Detekuje i jiné typy protilátek podle použitého AGH • • •Nepřímá aglutinace v situaci, kdy je nutné vizualizovat vzniklé imunní komplexy (u senzibilizující protilátky): –úprava erytrocytů pomocí enzymů –použití testu s AGH (antiglobulin human) – – – – – • • Nepřímá aglutinace •Enzymové testy: •Bromelin, ficin, papain, trypsin •štěpí chemické vazby některých sloučenin na membráně erytrocytů (deriváty kyseliny neuraminové) – snižují elektronegativní pole kolem erys •odkrývá antigenní místa a membránové antigeny se tak stávají dostupnější pro protilátky •vzájemně erytrocyty přibližují, umožňují tím navázání protilátky •v prostředí s enzymem získává protilátka spontánně vyšší schopnost aglutinovat erys (autoaglutinace) •nevýhoda: mohou se demaskovat nežádoucí antigeny • (kryptantigeny + nespecické reakce), obtížná standardizace ezymových testů • –Jednofázový test (přidání enzymu do reakce) x dvoufázový test (enzymované erys) – • Nepřímá aglutinace •AGH testy/povinné vyšetření: – –Pro vyšetření protilátek v séru i navázaných na erys, zkoušku kompatibility, vyšetření některých krevních skupin –Používá protilátku proti lidským proteinům (AGH) –Detekce cca 150 molekul Ab u vysoce senzitivních technik –Různé techniky provedení, modifikace testů se zkrácením doby inkubace v LISS, užití PEG – AGH Antiglobulinum humanum •Detekuje lidské proteiny, protilátky a komplement •AGH aglutinuje erytrocyty senzibilizované protilátkou •Erytrocyty bez protilátky s AGH nereagují • • NAT AGH reagencie/séra • •Polyspecifické AGH (-IgG, -C3d): •Zásadní důležitost: detekuje IgG protilátky a chladové protilátky (aktivující komplement) •Detekuje všechny klinicky významné protilátky • •Monospecifická AGH: •Anti-IgG AGH: nemá antikomplementární aktivitu •Protilátka proti gamma těžkému řetezci Ig •Někdy preferovaná před polyspecifickým AGH • • • • •Anti-C sérum (anti-C 3b,c,d): •Chybí aktivita proti lidské protilátce •Reaguje s C3 složkou komplementu na erytrocytech •Detekce některých chladových a tepelných protilátek • •Dva typy AGH testů: • 1.Přímý AGH test (PAT) pro detekci protilátek na erys při in vivo senzibilizaci 2.Nepřímý AGH test (NAT) pro detekci protilátek v séru po in vitro inkubaci séra obsahujícího protilátku s erys AGH diagnostika • 15krvinky5 16krvinky6 17krvinky7 18krvinky8 Co ovlivní AGH test? • •Teplota prostředí •Iontová síla prostředí •Poměr séra/erytrocytů •Doba inkubace •Variabilní senzitivita testu (slabý test při cca 200 molekulách navázané protilátky) • • • • Nevýhody AGH testů souvisí s promýváním erytrocytů • • •Výsledky falešně pozitivní • Spontánní aglutinace, • autoprotilátky, kryptantigeny, • hypercentrifugace, silikonové • zkumavky, volumexpandery, • kontaminovaný materiál aj. • • • • • • • • •Výsledky falešně negativní • Chyba promytí s neutralizací • přidaného AGH volnými • protilátkami, časové prodlení, • nedodržení teploty, kvalita AGH, podcentrifugování, prozona, technické chyby • • • Povinná kontrola negativního výsledku AGH testu přidáním erytrocytů s navázanou slabou protilátkou - vznikne aglutinace Jiné metodiky v imunohematologii •Precipitace •Reakce solubilního Ag + solubilní Ab = nerozpustné •komplexy (zkumavky, agarový gel) •Hemolýza •Porušení membrány ery + uvolnění Hb z buňky (vyžaduje •komplement) •Inhibice aglutinace •Průkaz solubilního Ag nebo Ab inhibicí proběhlé aglutinace •(vylučovatelství ABH substancí ve slinách, inaktivace AHG •séra balastními Ig) • • •Flowcytometrie •Měření imunofluorescence buněčné suspenze •Individuálně prováděné vyšetření •Určení slabě exprimovaných antigenů •Odlišení dvojí populace erytrocytů • • •Molekulárně genetické metody •Určení polymorfizmů krevních skupin při genotypizaci •dárce/pacienta/plodu, pacienta po transfuzi apod. •BloodChip •DNA microarray. Analýza signálů scannerem a automatická interpretace genotypů a fenotypů •Stanovení genotypů: 33 AB0, 87 RhD, 9 RHCE, 8 KEL, 4 JK, •4 Fy, 9 MNS, 2 DI, 2 DO, 2 CO • • •Funkční testy • •Buněčné testy pro predikci klinického významu protilátek proti •erytrocytům. In vitro reakce senzibilizovaných erytrocytů s monocyty. •Význam pro HTR, HON Speciální testy v imunohematologii •Eluční testy k disociaci protilátky z vazby na erys (eluce teplem, slabou kyselinou, mrazením-rozmrazením, chloroformem, UZV, eterem) •Adsorpční testy k průkazu protilátky/autoprotilátky, k separaci protilátky ze směsi, k průkazu imunních komplexů a léků na erys, k potvrzení slabých antigenů •Určení tříd Ig k disociaci aglutinátů tvořených IgM protilátkami •Neutralizace (inhibice) protilátky překrývající jinou protilátku, solubilní substance Le,P1, Chido •Stanovení ABH Lewis substancí ve slinách •Diluční techniky pro titraci •Kombinace technik Krevní skupiny erytrocytů Krevní skupiny erytrocytů Krevní skupiny/skupinové systémy • •Krevní polymorfizmy odlišující jedince •Membránové/povrchové antigeny erytrocytů •Produkty jednoho genu nebo komplexu vzájemně souvisejících genů •Bialelické systémy (alela mateřská a otcovská) •Podléhají pravidlům mendeliánské dědičnosti •Dnes cca 33 skupinových systémů s 360 antigeny • • • • •Syntetizované většinou na erytrocytech, ale také • naadsorbované z plazmy na buňky •Zastoupení nejen na erys, ale i na buňkách jiných tkáních •AB0 histokompatibilní antigeny •Antigeny proteinové nebo sacharidové • (oligosacharidy-glykoproteiny-glykosfingolipidy- • glykolipidy) s biologickými funkcemi •Imunogeny/cizorodé = vznikají proti nim aloprotilátky • Rozdělení krevních skupin podle funkce 1. 1.Strukturální skupiny –Integrální membránové proteiny (traverzují x-krát membránou nebo mají intracelulární N-nebo C-zakončení) 2. 2.Funkční skupiny –Udržují integritu buňky –Transportéry –Aktivní enzymy –Receptory pro ligandy, adhezivní funkce • Terminologie •ISBT terminologie od r.1980, kontinuální up-date. • •Numerické označení: •Šestimístné číslo pro antigen (005001 Lua) •První trojčíslí pro systém (005 Lutheran) •Druhé trojčíslí identifikuje antigen (001Lua) • •Alternativní označení (prakticky používané): •LU:-1,2 odpovídá fenotyp Lu(a-b+) • • Dědičnost krevních skupin •Dominantní, recesivní, kodominantní alela •Homozygotní jedinec: zdědil stejné alely v lokusu chromozomu (A/A , B/B, 0/0, K/K) •Heterozygotní jedinec: zdědil různé alely v lokusu (A/0, B/0, A/B, K/k) •Genotyp: genetická charakteristika jedince, určuje, jaké vzniknou antigeny •Fenotyp: manifestní znaky, vyšetřené antigeny krevních skupin (dominantní znaky), nemusí souhlasit s genotypem Matka/ otec 00 0 AA,A0 A BB,B0 B AB AB 00 0 00 A0,00 B0,00 A0,B0 AA,A0 A A0,00 AA,A0, 00 AB,A0, B0,00 AA,AB, A0,B0 BB,B0 B B0,00 AB,A0, B0,00 BB,B0, 00 AB,BB, A0,B0 AB AB A0,B0 AA,AB, A0,B0 AB,A0, BB,B0 AA,AB, BB AB0 systém - dědičnost Molekulární biologie krevních skupin •Určuje chemickou podstatu antigenů (bb. biochemie) •Určuje genetickou podstatu antigenů, detekci alel • 1.Cukry glykosylující proteiny a lipidy např. AB0 Le P H I Globo 2. 2.(Glyko) Proteiny • např. Lu Fy Rh Jk Di Co Kell Do JMH • • • AB0 systém • •nejvýznamnější systém krevních skupin •histokompatibilní antigeny •poznání od r.1900 •alela A a B (vyžaduje gen H) •dva antigeny: A, B •4 fenotypy A = 6 genotypů A/A, A/0 • B = B/B, B/0 • AB = A/B • 0 = 0/0 Základ všech AB0 skupin: H antigen • •Dva geny: FUT1(gen H) + FUT2 (gen Se) •FUT1 na erytrocytech •FUT2 v sekrečních epiteliálních buňkách •FUT geny kódují H-transferázu, která připojuje fukózu k prekurzorové substanci na erytrocytu nebo k prekurzoru v sekretech a vzniká antigen H (0) A,B antigeny •0 alela = neaktivní gen •Neprobíhá substituce oligosacharidů, exprimuje původní H antigen s fukózou • • •A alela = A transferáza = transfer GalNAc •B alela = B transferáza = transfer Gal •Připojením molekuly galaktozaminu nebo galaktózy •k H antigenu vznikne skupinově specifický (A nebo B) •antigen • • •polymorfismy genů = různá aktivita transferáz = různě silné antigeny při vyšetření krevní skupiny ABH Ag AB0 sekretorství / vylučovatelství •ABH antigeny v solubilní formě v tělních tekutinách •gen FUT2 (Se) •80% osob jsou sekretoři: podle AB0 skupiny na erys jsou v sekretech A, B nebo H antigen •20% osob nonsekretoři: v sekretech žádné ABH antigeny •stanovení sekretorství: detekce ABH substancí ve slinách (inhibiční test) Podskupiny A1 a A2: odlišnosti •Kvantitativní rozdíly •A1 nejčastější podskupina •A1(A1B) silná skupina, silná exprese A antigenu (více aktivní enzym) •A2 (A2B) slabá skupina, slabá exprese A antigenu – •Kvalitativní rozdíly •A1 erytrocyty: antigen A + A1 •A2 erytrocyty: antigen A •Vznik nepravidelných protilátek v rámci A podskupiny Ostatní slabé A podskupiny •změny-zeslabení A a B antigenu na erytrocytech •také změny antigenů v sekretech •příčina: genové mutace provázené změnou fenotypu • např. A3,Ax,Am, Ael, Aend / B3, Bx, Bm, Bel •příčina: vzácné alely •problémy při určení AB0 antigenů skupiny •nález nepravidelných AB0 protilátek (anti-A1, anti-H) • Získané změny antigenů •Získaný antigen B u osob skupiny A •slabší reakce získaného antigenu B • •Zeslabení antigenů (obvykle A antigenu) •leukemie, malignity • •Chimérické antigeny (B/0) •potransfuzní, potransplantační, • F-M krvácení, genetická chiméra • • The name of referred object is jkms-22-553-g001.jpg H - deficitní fenotypy •homozygotní forma inaktivního genu FUT1 (h/h) •nevzniká H transferáza a H antigen, i přes funkční A a B transferázy chybí prekurzor pro A a B antigeny •chybí reakce s anti-H dg.sérem •fenotypově skupina 0 (ale nesoulad přední x zadní řady) –nonsekretoři/ typ Bombay mají v séru kromě anti-A a anti-B tepelnou a klinicky významnou anti-H –sekretoři/ dříve paraBombay •velký problém se zajištěním transfuze (rodina, autotransfuze, registry dárců krve) AB0 protilátky •odlišují AB0 systém od všech ostatních skupin •pravidelné protilátky odpovídají AB0 atigenům •přirozené protilátky následkem „imunizace“ A,B substancemi z okolí •dvě protilátky: anti-A a anti-B, u osob 0 také anti-A,B •vzácně jiný nález: novorozenci, slabé skupiny, nemoci •od 4. měsíce věku dostatečný titr Abs, stacionární během života, změny při imunizujících stavech v těhotenství, po transfuzích •AB0 protilátky IgM, ale i IgG nebo IgA C:\Users\8260\Desktop\Obrázek1.png Laboratorní vyšetření: AB0 antigeny na erytrocytech • •dg.sérum anti-A, anti-B (anti-A,B) •monoklonální séra pro solný test/teplota laboratoře •polyklonální séra (-A,-B,-AB) •metoda zkumavková, sloupcová aglutinace, pevná fáze, sklíčková •rostlinné lektiny (monoklonální séra) pro odlišení A1 podskupiny •rutinně prováděná kontroly kvality reagencií (s ery A1,B) Laboratorní vyšetření - pravidelné AB0 protilátky v séru •detekce pomocí dg.erytrocytů A1,B (ery 0 nebo autoctl.) •solný test pro přímou aglutinaci/ teplota laboratoře s inkubací •zřetelné aglutinace •do 4. měsíce věku se nevyšetřují (chybí, mateřské Ig) • • • • 0 (anti-A,B v séru) A (anti-B v séru) B (anti-A v séru) AB(žádné protilátky) Dg.ery 0 0 0 0 0 Dg.ery A1 + 0 + 0 Dg.ery B + + 0 0 AB0 diskrepance • •Jsou při vyšetření antigenů nebo protilátek •Diskrepance je nutné vyřešit před uzavřením výsledku –Opakovat vyšetření, provést vyšetření z nového vzorku, použít jiné reagencie spolu s kontrolami, jiné reakční teploty, promytí erytrocytů, eluční techniky apod. dle typu problému •Pokud není stanovena skupina – univerzální režim: podávat 0 erytrocyty, AB plazmu •Princip sérologického vyšetření ostatních krevních skupin je stejný: Antigeny na vyšetřovaných erytrocytch detekujeme pomocí specifických diagnostických protilátek (dg. sér) v testu a technikou, které umožňují jejich průkaz. Je to naprosto dostačující pro běžné diagnostikování. •Kromě AB0 nejsou v jiné skupině pravidelné protilátky (proto dvojí potvrzení antigenu). •Genetické vyšetření umožní precizní diagnostikování skupinových antigenů, je zvláště přínosné u variantních antigenů, u transplantovaných a transfundovaných jedinců. Rh systém •dva související geny RHCE a RHD •RHD gen kóduje RhD protein ( D+, negativní fenotyp D-) •RHCE gen kóduje RhCcEe protein (kombinace antigenů Ce,ce,cE,CE) •RHAG gen je nutný pro Rh aktivitu: tetramerické komplexy Rh glykoproteinu s Rh proteiny •každý gen 10 exonů, charakteristické uspořádání • •D antigen chybí při –deleci celého genu (naše populace) –hybridním genu –inaktivním RHD pseudogenu •mutace genu, rekombinace mezi genovými oblastmi vedou ke vzniku vzácných D alel •změn v genu se manifestují jako změny ve fenotypu • (variantní D antigeny) • • a5 Rh antigeny • •antigeny D,C,c,E,e •lokalizované na RhD a RhCE proteinu •výskyt dle typu populace (D+ cca u 85% Evropanů, 90% Afričanů) •vysoce imunogenní proteiny (složité molekuly) •několik desítek tisíc kopií na erytrocytu dle genotypu • • •sérologické rozeznání pomocí dg. sér anti-D,-C,-c,-E,-e •3 páry alel umožňují vznik 8 haplotypů a 36 genotypů •zygocii D/D a D/d nelze sérologicky odlišit • • • • • Antigeny D+C+c-E-e+ Fenotyp DCe/DCe R1R1 Genotyp DCe/DCe R1R1 DCe/dCe R1r´ D+C-c+E+e+ DcE/dce R2r DcE/dce R2r DcE/Dce R2R0 Dce/dcE R0r´´ Rh nomenklatura •Písmenová: D,C,E,c,e, f,Cw,Cx,Hro,Hr,Har,hrS… •Fisherova + Wienerova: DCe = R1 • DcE = R2 • Dce = Ro • DCE = Rz • dce = r • dCe = r´ • dcE = r´´ • dCE = rY Abnormální typy Rh antigenů •u cca 1 % osob •D-- : chybí antigeny RhCcEe proteinu •Rhnull: chybí všechny Rh antigeny •Rhmod: změna exprese, zeslabené Rh antigeny •Variantní D antigeny: –Weak D: kvantitativní změna antigenu –Parciální D: kvalitativní změna v mozaice antigenu • Weak D, Dw • •Původní terminologie „Du“, slabě exprimovaný antigen •Všechny D epitopy, žádná změna AMK v extramembranozní části RhD proteinu, mutace postihují intramembranozní a intracelulární část proteinu •Nebývá riziko imunizace D antigenem •Příjemci: RhD+ transfuze •Těhotné: anti-D profylaxe ne • • • Parciální (variantní) D, Dvar • •Chybí jedna nebo více částí/epitopů D antigenu • (změna v extramembranózní části RhD proteinu) –některé epitopy chybí, zbývající slabě vyjádřené –antigen je složený z jiných epitopů = nový tvar proteinu •Problém: vznik alo-anti-D po transfuzi nezmáného D epitopu •Příjemci: RhD- transfuze •Těhotné: anti-D profylaxe ano • Vyšetření RhD • •rutinní vyšetření D antigenu v rámci krevní skupiny •dříve polyklonální IgG protilátky, dnes převažují monoklonální protilátky •různé typy diagnostik anti-D: IgM, blend IgM/IgG, IgG •duplicitně provedené vyšetření dvěma dg. séry s odlišnými klony (detekce jiných epitopů ) •validace testu - použití kontrolního séra (Rh ctl) pro odlišení falešně pozitivních výsledků u některých stavů • •Dárce krve/event. novorozenec: •zachytit všechny typy D antigenu •2 různá séra pro aglutinační test •došetření slabých antigenů pomocí dg. sér v NAT • •Příjemce/těhotná: •ideální, ale nereálné: parciální D=RhD neg, weak D= RhD poz •2 dg.séra bez detekce DVI varianty •nedošetřovat slabé antigeny • •Sledovat diskrepance při použití různých diagnostik •Došetření sérologické, molekulárně genetickými metodami. • Cíl vyšetření D antigenu: C,c,E,e antigeny • •produkty alely RHCE •frekvence: C 68%, c 81%, E 29%, e 98% •substituce aminokyselin v RhCcEe proteinu vede ke vzniku slabých a variantních antigenů •složené antigeny ce, Ce, CE, cE, antigen G •antigeny méně časté Cw, Cx Rh protilátky •klinicky významné, imunní - vedou k destrukci erys •IgG •neaktivují komplement, vedou k extravaskulární hemolýze •placenta pro ně má receptory •klinické souvislosti: HON, HTR •anti-D, -E, -c, -C, -e, -Cw •anti-Rh tepelné autoprotilátky u AIHA •profylaktické použití anti-D u HON •průkaz v testech při 37°C •zvýšená reaktivita v enzymovém testu, efekt dávky • Ostatní krevní skupiny Ii • • • •antigen i je prekurzorem antigenu I •i fenotyp dominuje u novorzenců •I fenotyp u dospělých •antigeny podobné systému AB0 jsou přítomné na erys i v sekretech •protilátka anti-I u CAD (průkaz pomocí erys cord) • Lewis /Le • •souvisí s AB0 a H/h systémem •spolupůsobením genu Le a Se vzniká antigen Lea •další vliv Le genu na antigen Lea = antigen Leb •glykolipidy, syntéza neprobíhá na erytrocytech, na erys se navazují z plazmy, jsou obsaženy v sekretech •základní antigeny Lea, Leb •fenotypy •Le(a+b-) u ABH nonsekretorů •Le(a-b+) u ABH sekretorů •Le(a-b-) homozygot pro gen Lewis nesyntetizuje antigeny Lewis - protilátky • •přirozené protilátky, bez imunizačního podnětu u jedinců Le(a-b-) •anti-Lea, anti-Leb •IgM izotypy – lab. průkaz v chladových testech •nebývají aktivní při 37°C ( vzácně hemolýza) •asociace s orgánovými transplantacemi • • • Kell. Kel, Cellano • •glykoproteinové antigeny •silné imunogeny •přibližně 25 antigenů v systému •antitetické alely K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb •časté numerické označení antigenů (K1,K2..) •90% jedinců nemá K (Kel), 1% nemá antigen k (Cellano) •vzácný fenotyp Ko nemá žádané antigeny Kell systému • • Kell - protilátky • •imunní protilátky •IgG typ •klinicky významné •v etiologii HON (navíc suprese erytropoezy), HTR •častá anti-K, vzácně anti-k •unikátní anti-Ku reaguje se všemi erytrocyty s výjimkou Ko fenotypu • Kidd /Jk •glykoproteinové antigeny •alely JKA, JKB , ostatní vzácné •nulový fenotyp Jk(a-b-) u Polynézanů • •Funkce: •transport urey •udržení osmotické stability a deformovatelnosti ery • • • Kidd - protilátky •málo časté •nebezpečné, podléhají rychlé fagocytoze - přehlédnutelné - rychlá sekundární anamnestická odpověď, akutní potransfuzní reakce typu HTR •imunní IgG typ, hemolyzující účinek při aktivaci komplementu •efekt dávky u homozygotní exprese •zesílené reakce v enzymových testech •vzácně u HON Duffy /Fy •glykoproteinové antigeny •alely Fya, Fyb, alela Fy u Afričanů • •Funkce •receptor pro Plasmodium knowlesi = úloha v zánětu a při malarické infekci •fenotyp Fy(a-b-) protektivní pro malarii • •destruovatelné proteolytickými enzymy – pozor v laboratorních testech při použití enzymů Duffy - protilátky • •relativně častá anti-Fya •méně častá anti-Fyb •anti-Fy3 pravidelně u null formy •imunní IgG typ •HON vzácně, někdy HTR • • Lutheran /Lu • •glykoproteinové antigeny •Gen LU •přes 20 alel, většina vysokofrekventních •po narození slabé Ag, postupně zesilují (nebývá HON) • •Funkce: buněčná adhese, erytropoeza • Lutheran - protilátky • •málo časté •většinou IgM, v chladových testech •někdy IgG v testech při 37°C •často v kombinaci s HLA protilátkami •efekt dávky u homozygotní exprese •považované za klinicky nerelevantní MNS • •Glykoforiny transmembránové •GPA gen = MN antigeny •GPB gen = Ss antigeny •antigeny obsahují kyselinu sialovou- tvoří negativní povrchový náboj erytrocytů • •Funkce: •receptor pro komplement, cytokiny,bct, viry MNS - protilátky • •většinou přirozené protilátky •-M,-N bez klinického významu •efekt dávky u homozygotní exprese •-S,-s vzácně HON a HTR při aktivitě v NAT •anti-N-like u dialyzovaných pacientů •raritní anti-U u jedinců S-s-U- • • • • P systém • •oligosacharidové antigeny •P1, P a Pk •raritní fenotyp p • • Funkce: •P antigen je buněčný receptor pro bakterie (na erys pro parvovirus B19) P systém protilátky •častá anti-P1 jako přirozená chladová protilátka •nebývá HON, HTR •anti-P,-Pk,-p jsou vzácné •anti-PP1Pk u raritního fenotypu p •anti-P jako IgG autoprotilátka u dětského typu AIHA (Paroxysmální chladová hemoglobinurie) má charakter bifázického hemolyzinu •výskyt v komplexu s jinými protilátkami (-IP1,-IP) Chido/Rodgers • •nejsou pravé antigeny •dvě formy jsou součástí C4A a C4B složky komplementu •přítomné v plazmě, odtud se navazují na erytrocyty a makrofágy •Funkce proteinů •patří ke klasické aktivaci C •protilátky imunního typu, alergické potransfuzní reakce • Colton /Co •gen AQP •AQP1 a AQP3 exprimované na erytrocytech. •11 antigenů, časté antigeny Coa, Cob •Funkce •zajišťují transport molekul vody membránou erys podle osmotického gradientu •Tkáňová distribuce •většina tkání včetně erys •Protilátky IgG imunní, HTR, HON • Cromer /Cr • •součást DAF(CD55) = komplementregulační protein •Funkce •regulace komplementu, chrání tkáně inhibicí C3 a C5 aktivovaných složek komplementu •deficientní DAF u PNH Diego /Di •hlavní integrální protein membrány •absence je spojena se sferocytozou a hemolýzou •nese AB0 antigeny •Funkce •udržuje strukturu a stabilitu buňky •účast při vzniku senescentních Ag na starých erys •adheze parazitů (malárie) na erys •zajištění flexibility a tvaru buňky, transportu iontů •Protilátky imunní, IgG, HTR • Dombrock /Do • •glykoproteinové antigeny •neznámá funkce, ztráta antigenu u PNH • •Protilátky: •obvykle ve směsi jiných protilátek •imunní IgG, neaktivují komplement • • • • Gerbich /Ge •Glykoproteinové antigeny •Funkce •udržují integritu buňkyn a negativní povrchový náboj erys •Asociace s nemocemi •udržují tvar erys a zajišťují deformovatelnost erys, absence může vést k eliptocytoze nebo abnormálnímu tvaru erys •Protilátky imunní, také autoprotilátky v rámci AIHA • Ostatní skupiny •Vysokofrekventní antigeny •Incidence více než 99% • •Vel, Lan, JMH, Sda, Ata •Obtížně identifikovatelné / referenční pracoviště •Téměř nelze najít kompatibilní erytrocyty pro imunizované •Nízkofrekventní antigeny •méně než 1% • • •Chra, By, Bi, JONES, HJK,SARA •Vzácně imunizace transfuzemi, většina dárců antigen nemá HLA I. třídy na erytrocytech • •Bg antigeny na zralých erytrocytech •Bga = HLA-B7 •Bgb = HLA-B17 •Bgc = HLA-A28 (cross A2) •Exprese jen u malé části populace •Protilátky proti nim vzácně vedou k HTR Registry dárců krve •Národní registr dárců vzácných krevních skupin •Mezinárodní registry dárců vzácných krevních skupin • •Referenční laboratoře