Chromatografické metodyChromatografické metody
RNDr. AlenaRNDr. Alena MikuškováMikušková
FN BrnoFN Brno –– Pracoviště dětské medicíny, OKBPracoviště dětské medicíny, OKB
CHROMATOGRAFIECHROMATOGRAFIE
 Separační (dělící) metoda a současně
 Analytická metoda - poskytuje kvalitativní a kvantitativní informaci o vzorku
 Využívá distribuce látek mezi dvě fáze
• Stacionární (nepohyblivou) – pevná látka nebo na povrchu pevné látky fixovaná
kapalina
• Mobilní (pohyblivou) – kapalina nebo plyn
Fáze = homogenní část heterogenního
systému oddělená od okolí fázovým
rozhraním
 ObjevitelObjevitel -- ruský botanikruský botanik CvětCvět
–– přelom 19. a 20. stoletípřelom 19. a 20. století
–– dělení rostlinných pigmentůdělení rostlinných pigmentů
PrvníPrvní chromatografchromatograf
CHROMATOGRAFIECHROMATOGRAFIE
Metoda založená na rozdílné afinitě dělených látek keMetoda založená na rozdílné afinitě dělených látek ke stacionárnístacionární
(nepohyblivé) a(nepohyblivé) a mobilnímobilní (pohyblivé) fázi ((pohyblivé) fázi (SF, MFSF, MF))
Princip:Princip:
 Mobilní fáze proudí přes nosič nebo kolonu, obsahující stacionárMobilní fáze proudí přes nosič nebo kolonu, obsahující stacionární fáziní fázi
 Během pohybu mobilní fáze dochází kBěhem pohybu mobilní fáze dochází k distribuci komponent směsi mezidistribuci komponent směsi mezi
obě fázeobě fáze -- jednotlivé složky směsi procházejí systémem různoujednotlivé složky směsi procházejí systémem různou
rychlostí:rychlostí:
•• látky slátky s vyšší afinitou ke stacionární fázi migrují pomalejivyšší afinitou ke stacionární fázi migrují pomaleji
•• látky slátky s nižší afinitou ke stacionární fázi migrují rychleji (zůstávají pnižší afinitou ke stacionární fázi migrují rychleji (zůstávají přednostněřednostně
vv mobilní fázi)mobilní fázi)
Klasifikace chromatografických metodKlasifikace chromatografických metod
-- Podle uspořádání systémuPodle uspořádání systému
Chromatografie plošná (Chromatografie plošná (planárníplanární))
–– Papírová chromatografiePapírová chromatografie
SF (HSF (H22O nebo polárníO nebo polární
rozpouštědlo) zakotvena narozpouštědlo) zakotvena na
vláknech papíruvláknech papíru
–– Chromatografie na tenké vrstvě, TLCChromatografie na tenké vrstvě, TLC
•• SF (SF (silikagelsilikagel,, aluminaalumina, celulóza,, celulóza,
aj.) rozprostřená na inertníaj.) rozprostřená na inertní
podložce (sklo,podložce (sklo, AluAlu--fólie)fólie)
Chromatografie kolonová (sloupcová)Chromatografie kolonová (sloupcová)
-- SF (SF (silikagelsilikagel, polymer,…) tvoří náplň, polymer,…) tvoří náplň
kolonykolony
-- nebo nanesena nebo chemickynebo nanesena nebo chemicky
navázána na nosné částicenavázána na nosné částice
-- nebo nanesena přímo na vnitřnínebo nanesena přímo na vnitřní
povrch kolonypovrch kolony
-- dle mobilní fázedle mobilní fáze -- LC, GCLC, GC
Klasifikace chromatografických metodKlasifikace chromatografických metod
-- Podle skupenství mobilní fázePodle skupenství mobilní fáze
–– plynováplynová ((gasgas chromatographychromatography, GC), GC) –– plynná MFplynná MF
–– kapalinovákapalinová ((liquidliquid chromatographychromatography, LC), LC) –– kapalná MFkapalná MF
-- Podle složení mobilní fázePodle složení mobilní fáze
–– izokratickéizokratické dělenídělení -- mobilní fáze má po celou dobu dělení konstantnímobilní fáze má po celou dobu dělení konstantní
složenísložení
–– dělení s proměnlivým složením mobilní fázedělení s proměnlivým složením mobilní fáze
•• stupňovitástupňovitá eluceeluce
•• gradientovágradientová eluceeluce
-- Chromatografie podle účeluChromatografie podle účelu
–– Preparativní chromatografiePreparativní chromatografie -- pro přípravu většího množství čistýchpro přípravu většího množství čistých
láteklátek
–– Analytická chromatografieAnalytická chromatografie -- pro určení identity a koncentrace látek vepro určení identity a koncentrace látek ve
směsisměsi
Klasifikace chromatografických metodKlasifikace chromatografických metod
-- Podle separačního mechanismuPodle separačního mechanismu
■■ IontoměničováIontoměničová chromatografie ((ionexováionexová, ion, ion--exchangeexchange, IEC), IEC)
 výměna iontů elektrostaticky vázaných na nabitém povrchu SF a iovýměna iontů elektrostaticky vázaných na nabitém povrchu SF a iontů vntů v roztokuroztoku
 SFSF -- iontoměničiontoměnič ((ionexionex):): částice gelu (syntetické pryskyřice) sčástice gelu (syntetické pryskyřice) s navázanými nabitýminavázanými nabitými
funkčními skupinami (kyselými nebo bazickými):funkčními skupinami (kyselými nebo bazickými):
•• KatexyKatexy (umožňují výměnu(umožňují výměnu kationtůkationtů))
•• na nosné částici navázány silně nebo slabě kyselé funkční skupinna nosné částici navázány silně nebo slabě kyselé funkční skupinyy
•• AnexyAnexy (umožňující výměnu(umožňující výměnu aniontůaniontů))
•• silně nebo slabě bazické funkční skupinysilně nebo slabě bazické funkční skupiny
 Na těchto skupinách vázán opačně nabitý ion (zachováníNa těchto skupinách vázán opačně nabitý ion (zachování elektroneutralityelektroneutrality))
 Tento ion je na začátku analýzy vyměněn zaTento ion je na začátku analýzy vyměněn za iontyionty analytůanalytů ze vzorkuze vzorku
 Složky dělené směsi jsou zSložky dělené směsi jsou z kolonykolony eluoványeluovány
 postupnou změnoupostupnou změnou pHpH mobilní fázemobilní fáze
 a/nebo změnou iontové síly MFa/nebo změnou iontové síly MF
 IEC umožňuje dělit iontyIEC umožňuje dělit ionty
•• nízkomolekulárnínízkomolekulární -- aminokyseliny, nukleotidy,…aminokyseliny, nukleotidy,…
•• vysokomolekulárnívysokomolekulární -- peptidy, proteiny, nukleovépeptidy, proteiny, nukleové
kyseliny,kyseliny, oligonukleotidyoligonukleotidy,…,…
Klasifikace chromatografických metodKlasifikace chromatografických metod
-- Podle separačního mechanismuPodle separačního mechanismu
RozdělovacíRozdělovací chromatografiechromatografie
Založena na distribuci látek mezi dvě nemísitelné tekutinyZaložena na distribuci látek mezi dvě nemísitelné tekutiny (tj. rozpustnosti v SF, MF)(tj. rozpustnosti v SF, MF)
Stacionární fáze = kapalina, která může býtStacionární fáze = kapalina, která může být
–– naadsorbovánanaadsorbována nebo chemicky navázána na pevném nosičinebo chemicky navázána na pevném nosiči
 např. na vláknech papíru u papírové chromatografie, na nosných čnapř. na vláknech papíru u papírové chromatografie, na nosných částicích u HPLCásticích u HPLC
 nanesena na vnitřním povrchu kapilární kolony (GLC)nanesena na vnitřním povrchu kapilární kolony (GLC)
Mobilní fáze = kapalina nebo plynMobilní fáze = kapalina nebo plyn
–– plynováplynová chromatografie (chromatografie (gasgas--liquidliquid,, GLCGLC, zjednodušeně GC), zjednodušeně GC)
–– kapalinovákapalinová ((liquidliquid--liquidliquid,, LLCLLC, zjednodušeně LC) ve dvou provedeních:, zjednodušeně LC) ve dvou provedeních:
•• LLC sLLC s normální fázínormální fází -- SF polární, MF méně polárníSF polární, MF méně polární
•• LLC sLLC s obrácenou fázíobrácenou fází -- SF nepolární, MF polární (častěji používané provedení)SF nepolární, MF polární (častěji používané provedení)
O pohyblivosti jednotlivých složek dělené směsiO pohyblivosti jednotlivých složek dělené směsi
rozhodujerozhoduje rozdělovací koeficientrozdělovací koeficient dělených látek mezidělených látek mezi
oběma fázemi (oběma fázemi (KK):):
K =K = ccorgorg // ccvodvod
c org ... koncentrace rozpuštěné látky v organické fázi
c vod ... koncentrace rozpuštěné látky ve vodné fázi
Klasifikace chromatografických metodKlasifikace chromatografických metod
-- Podle separačního mechanismuPodle separačního mechanismu
Adsorpční chromatografieAdsorpční chromatografie
Dělení založeno na rozdílech vDělení založeno na rozdílech v adsorpci a desorpci látek na pevný povrchadsorpci a desorpci látek na pevný povrch sorbentusorbentu
–– (elektrostatickými silami, vodíkovými můstky nebo disperzními s(elektrostatickými silami, vodíkovými můstky nebo disperzními silami)ilami)
Adsorpci popisuje tzv.Adsorpci popisuje tzv. LangmuirovaLangmuirova adsorpční izotermaadsorpční izoterma = závislost množství= závislost množství analytuanalytu
ve stacionární fázi (ve stacionární fázi (sorbentusorbentu) na koncentraci v) na koncentraci v mobilní fázimobilní fázi
CCSS = w . z . C= w . z . CMM / (1 + w . C/ (1 + w . CMM))
 w … adsorpční koeficient pro danýw … adsorpční koeficient pro daný analytanalyt
 z … počet volných interakčních míst na povrchuz … počet volných interakčních míst na povrchu
 CCSS, C, CMM… koncentrace… koncentrace analytuanalytu vv obou fázíchobou fázích
 Při nízkých koncentracíchPři nízkých koncentracích analytuanalytu vv MF je závislost CMF je závislost CSS na Cna CMM lineární, při vysokýchlineární, při vysokých
koncentracích Ckoncentracích CMM dojde kdojde k vysycenívysycení interakčních místinterakčních míst sorbentusorbentu, závislost se zakřivuje, závislost se zakřivuje
Klasifikace chromatografických metodKlasifikace chromatografických metod
-- Podle separačního mechanismuPodle separačního mechanismu
GelováGelová permeačnípermeační chromatografiechromatografie
 umožňuje dělit molekuly podle jejich velikosti a tvaruumožňuje dělit molekuly podle jejich velikosti a tvaru
 SF =SF = gelovégelové částice kulovitého tvaru (na bázi polysacharidů nebočástice kulovitého tvaru (na bázi polysacharidů nebo polyakrylamidupolyakrylamidu) s) s
póry definovaných rozměrůpóry definovaných rozměrů
 Molekuly, jejichž průměr je menší než průměr pórů, difusním pohyMolekuly, jejichž průměr je menší než průměr pórů, difusním pohybem vnikají dobem vnikají do
vnitřních prostorvnitřních prostor gelovýchgelových částic, čímž jsou na koloně zadržoványčástic, čímž jsou na koloně zadržovány
 velké molekuly, které se nedostanou do pórů, jsou unášeny proudevelké molekuly, které se nedostanou do pórů, jsou unášeny proudem MF a vytékajím MF a vytékají
zz kolony dřívekolony dříve
Klasifikace chromatografických metodKlasifikace chromatografických metod
-- Podle separačního mechanismuPodle separačního mechanismu
Afinitní chromatografieAfinitní chromatografie
využívávyužívá specifické interakcespecifické interakce molekul:molekul:
 interakce biologické povahyinterakce biologické povahy
•• enzymenzym -- substrátsubstrát
•• enzymenzym -- inhibitorinhibitor
•• antigenantigen -- protilátkaprotilátka
•• receptorreceptor -- hormon apod.hormon apod.
 biologickou interakci napodobujícíbiologickou interakci napodobující
•• bílkovinabílkovina -- triazinovétriazinové barvivobarvivo
•• bílkovinabílkovina -- kovové ionty apodkovové ionty apod..
Jeden z partnerů (tzv.Jeden z partnerů (tzv. ligandligand)) -- pevně navázán na nosič, kterým je naplněnapevně navázán na nosič, kterým je naplněna
chromatografická kolonachromatografická kolona
VV dělené směsi (mobilní fázi) je přítomna řada molekul, z nichž jedělené směsi (mobilní fázi) je přítomna řada molekul, z nichž jen některé majín některé mají
afinitu kafinitu k liganduligandu →→ navážou se na něj a ostatní složky směsi se znavážou se na něj a ostatní složky směsi se z kolony vymyjíkolony vymyjí
změna složení mobilní fáze tak, aby se oslabila interakcezměna složení mobilní fáze tak, aby se oslabila interakce ligandligand –– navázanánavázaná
molekula, ta se z kolony uvolní a získá se v relativně čisté podmolekula, ta se z kolony uvolní a získá se v relativně čisté podoběobě
bioafinitníbioafinitní chromatografii lze použít kchromatografii lze použít k separaci, izolaci a kseparaci, izolaci a k čistění složek vzorkučistění složek vzorku
Přehled chromatografických technikPřehled chromatografických technik
ChromatografieChromatografie
■■ planárníplanární
 papírová rozdělovacípapírová rozdělovací
 tenkovrstvátenkovrstvá TLCTLC
•• tenkovrstvátenkovrstvá rozdělovací (SF kapalina)rozdělovací (SF kapalina)
•• tenkovrstvátenkovrstvá adsorpční (SF pevná látka)adsorpční (SF pevná látka)
■■ kolonovákolonová
 plynová GCplynová GC
•• plynová rozdělovací GLC (SF kapalina)plynová rozdělovací GLC (SF kapalina)
•• plynová adsorpční GSC (SF pevná látka)plynová adsorpční GSC (SF pevná látka)
 kapalinová LCkapalinová LC
•• kapalinová rozdělovací LLC (SF kapalina)kapalinová rozdělovací LLC (SF kapalina)
•• kapalinová adsorpční LSC (SF pevná látka)kapalinová adsorpční LSC (SF pevná látka)
 gelovágelová permeačnípermeační GPCGPC
 iontově výměnná IECiontově výměnná IEC
 afinitní (a další)afinitní (a další)
SF…SF…stacstac.fáze.fáze
PlanárníPlanární
chromatografiechromatografie
 NaneseníNanesení chromatogramuchromatogramu -- vzorky na startovní pozici blízko okraje plošného nosičevzorky na startovní pozici blízko okraje plošného nosiče
(papíru, tenké vrstvy) ve formě malých kapek nebo tenkých čar(papíru, tenké vrstvy) ve formě malých kapek nebo tenkých čar
 VyvíjeníVyvíjení chromatogramuchromatogramu –– v chromatografické vaně:v chromatografické vaně:
 spodní konec nosiče ponořen do MF pod úrovní startovací liniespodní konec nosiče ponořen do MF pod úrovní startovací linie
 MF vMF v důsledku kapilárních sil migruje přes SF, unáší s sebou složky sdůsledku kapilárních sil migruje přes SF, unáší s sebou složky směsi vměsi v závislostizávislosti
na jejich afinitě ke SFna jejich afinitě ke SF
•• papírová chromatografie umožňuje i sestupné uspořádánípapírová chromatografie umožňuje i sestupné uspořádání -- dle směru pohybu MFdle směru pohybu MF
 Vizualizace skvrnVizualizace skvrn -- usušenýusušený chromatogramchromatogram lzelze vizualizovatvizualizovat
•• barvotvornýmbarvotvorným činidlemčinidlem
•• osvícením UV světlemosvícením UV světlem
•• fluorescenčněfluorescenčně
 Charakteristikou látky jeCharakteristikou látky je retenční faktorretenční faktor RRff
 hodnotahodnota RRff je pro dané uspořádání experimentu stáláje pro dané uspořádání experimentu stálá
RRff = A / B= A / B
A…vzdálenost startA…vzdálenost start –– střed skvrnystřed skvrny
B…vzdálenost startB…vzdálenost start –– čelo rozpouštědlačelo rozpouštědla
PlanárníPlanární chromatografiechromatografie
 Dvourozměrná TLCDvourozměrná TLC
•• VyvíjeníVyvíjení chromatogramuchromatogramu prvníprvní
mobilní fázímobilní fází
•• otočení usušené destičky o 90 st.otočení usušené destičky o 90 st.
•• vyvíjení druhou mobilní fázívyvíjení druhou mobilní fází
•• dokonalejší separacedokonalejší separace
 HPTLCHPTLC ((highhigh perfomanceperfomance thinthin layerlayer
chromatographychromatography)) -- tenká vrstva sestává ztenká vrstva sestává z částicčástic
o malém průměru (4,5o malém průměru (4,5 μmμm))
 PlanárníPlanární technikytechniky -- metodymetody kvalitativní nebokvalitativní nebo
semikvantitativnísemikvantitativní ss vizuálním hodnocenímvizuálním hodnocením --
srovnáním se skvrnami standardůsrovnáním se skvrnami standardů
chromatografovanýchchromatografovaných na témže nosičina témže nosiči
Kolonová chromatografieKolonová chromatografie
ChromatogramChromatogram
 grafický záznam odezvy detektoru jako funkcegrafický záznam odezvy detektoru jako funkce
času, případně objemu:času, případně objemu:
•• Při postupu vzorku kolonou se jednotlivéPři postupu vzorku kolonou se jednotlivé
složky vzorku separují, tj. dospějí dosložky vzorku separují, tj. dospějí do
detektoru vdetektoru v různých retenčních časechrůzných retenčních časech
•• eluovanéeluované analytyanalyty graficky znázorněny jakograficky znázorněny jako
série vrcholů (série vrcholů (píkůpíků))
 data reprezentovanádata reprezentovaná chromatogramemchromatogramem sloužíslouží
kk identifikaci a kvantifikaciidentifikaci a kvantifikaci analytůanalytů::
-- retenční časretenční čas ttRR –– kvalitativní charakteristikakvalitativní charakteristika analytuanalytu
-- plocha chromatografického vrcholuplocha chromatografického vrcholu –– kvantitativníkvantitativní
charakteristikacharakteristika
-- koncentracekoncentrace analytuanalytu vypočítána na základě porovnánívypočítána na základě porovnání
plochy píkuplochy píku analytuanalytu s plochou píku standardus plochou píku standardu
-- plochu píku lze vypočítat jako: výška x poloviční šířkaplochu píku lze vypočítat jako: výška x poloviční šířka
(h x w(h x w1/21/2))
Kolonová chromatografieKolonová chromatografie
Základní pojmyZákladní pojmy –– popis chromatografického píku:popis chromatografického píku:
•• ttRR (min)…retenční čas(min)…retenční čas analytuanalytu (doba od nástřiku vzorku na kolonu do průchodu(doba od nástřiku vzorku na kolonu do průchodu
izolovanéhoizolovaného analytuanalytu detektorem)detektorem)
•• ttMM (min)…mrtvý čas kolony (retenční čas(min)…mrtvý čas kolony (retenční čas analytuanalytu, který není v, který není v koloně zadržován, tj.koloně zadržován, tj.
pohybuje se stejnou rychlostí jako MF)pohybuje se stejnou rychlostí jako MF)
•• WW1/21/2 …šířka píku…šířka píku analytuanalytu v polovině výškyv polovině výšky
•• WW …šířka píku…šířka píku analytuanalytu u základnyu základny
•• t’t’RR (min)…redukovaný retenční čas(min)…redukovaný retenční čas analytuanalytu (čas, který příslušný(čas, který příslušný analytanalyt stráví vestráví ve
stacionární fázi)stacionární fázi)
t’t’RR == ttRR –– ttMM
•• Obdobně:Obdobně:
-- retenční objemretenční objem VVRR
-- mrtvý objemmrtvý objem VVMM
-- redukovaný retenční objemredukovaný retenční objem V‘V‘RR
V’V’RR = V= VRR –– VVMM
Kolonová chromatografieKolonová chromatografie
 Pro dobré rozdělení dvou sousedníchPro dobré rozdělení dvou sousedních analytůanalytů je nutné, abyje nutné, aby analytyanalyty měly:měly:
 dostatečně rozdílné retenční časydostatečně rozdílné retenční časy
→→ Vhodná volba SF a MFVhodná volba SF a MF
 dostatečně úzké zónydostatečně úzké zóny analytůanalytů
→→ Dostatečná účinnost kolonyDostatečná účinnost kolony
 Účinnost kolonyÚčinnost kolony –– charakterizuje, jak moc se zónycharakterizuje, jak moc se zóny
separovaných látek rozšiřují vlivem difůzeseparovaných látek rozšiřují vlivem difůze
-- Mírou účinnosti kolony jeMírou účinnosti kolony je početpočet
teoretických pater kolonyteoretických pater kolony
-- Teoretické patroTeoretické patro –– taková část kolony, na kterétaková část kolony, na které
proběhne jedno ustavení rovnováhy MFproběhne jedno ustavení rovnováhy MF –– SFSF
-- čím větší počet pater, tím užší zóny látekčím větší počet pater, tím užší zóny látek
-- počet pater dané kolony závisí na rychlostipočet pater dané kolony závisí na rychlosti
průtoku MFprůtoku MF
Plynová chromatografie, GCPlynová chromatografie, GC
 Mobilní fázeMobilní fáze -- nosný plyn (nejčastěji inertní plynnosný plyn (nejčastěji inertní plyn -- dusík, helium, argon)dusík, helium, argon)
 Separace u GC je založenaSeparace u GC je založena
 na rozdílech tlaku parna rozdílech tlaku par analytůanalytů
 interakcích se stacionární fázíinterakcích se stacionární fází
-- těkavějšítěkavější analytyanalyty se tedy pohybují kolonou rychleji nežse tedy pohybují kolonou rychleji než analytyanalyty méně těkavé a navícméně těkavé a navíc analytyanalyty
interagujícíinteragující se stacionární fází procházejí kolonou pomaleji nežse stacionární fází procházejí kolonou pomaleji než analytyanalyty se slabší interakcíse slabší interakcí
 GSCGSC -- separace na základěseparace na základě adsorpceadsorpce analytůanalytů na pevný povrch náplně kolonyna pevný povrch náplně kolony
 GLCGLC -- separace na základěseparace na základě rozdělenírozdělení mezi plynnou MF a kapalnou SF (netěkavámezi plynnou MF a kapalnou SF (netěkavá
kapalina zakotvená na částicích náplně nebo přímo na vnitřním pkapalina zakotvená na částicích náplně nebo přímo na vnitřním povrchuovrchu
kapilární kolony)kapilární kolony)
 PlynovýPlynový chromatografchromatograf
•• zdroj mobilní fáze a zařízení pro kontrolu průtokuzdroj mobilní fáze a zařízení pro kontrolu průtoku
nosného plynu systémemnosného plynu systémem
•• dávkovač pro nanesenídávkovač pro nanesení analytuanalytu na kolonuna kolonu
•• chromatografická kolona pro separacichromatografická kolona pro separaci analytůanalytů
•• termostat (pec) pro regulaci teploty kolonytermostat (pec) pro regulaci teploty kolony
•• onon--line detektor pro detekci separovanýchline detektor pro detekci separovaných analytůanalytů
vycházejících z kolonyvycházejících z kolony
•• PC pro kontrolu systému a vyhodnocení datPC pro kontrolu systému a vyhodnocení dat
Plynová chromatografie, GCPlynová chromatografie, GC -- kolonykolony
NáplňovéNáplňové kolonykolony -- starší typ, již málo používanéstarší typ, již málo používané
–– trubice (vnitřní průměr řádově mm, délka 1 m a více, sklotrubice (vnitřní průměr řádově mm, délka 1 m a více, sklo
nebo nerez ocel) naplněné nosnými částiceminebo nerez ocel) naplněné nosnými částicemi
–– částice náplně jsou samy o sobě stacionární fází (částice náplně jsou samy o sobě stacionární fází (GSCGSC ––
sorbentysorbenty: modifikovaný: modifikovaný silikagelsilikagel, aktivní uhlí,, aktivní uhlí, aluminaalumina,,
molekulové síto,…)molekulové síto,…)
–– částice jsou stacionární fází potaženy (částice jsou stacionární fází potaženy (GLCGLC))
 užší kolonyužší kolony
•• vyšší účinnost x menší kapacita pro vzorekvyšší účinnost x menší kapacita pro vzorek
 delší kolonydelší kolony
•• vyšší účinnost x nutné zvýšené tlaky MFvyšší účinnost x nutné zvýšené tlaky MF
KapilárníKapilární kolonykolony -- WCOTWCOT ((wwallall--ccoatedoated oopenpen ttubularubular columncolumn))
–– kapiláry z křemenného skla (vnitřní průměr 0,1kapiláry z křemenného skla (vnitřní průměr 0,1 -- 0,5 mm,0,5 mm,
délka 10délka 10 -- 150 m)150 m)
–– na povrchu potaženyna povrchu potaženy polyimidempolyimidem (pevnost a pružnost)(pevnost a pružnost)
–– vnitřní povrch potažen tenkým filmem SFvnitřní povrch potažen tenkým filmem SF
–– velmi účinnévelmi účinné
–– malá kapacita pro vzorekmalá kapacita pro vzorek
Plynová chromatografie, GCPlynová chromatografie, GC -- kolonykolony
Stacionární fáze pro GLCStacionární fáze pro GLC
 netěkavé chemicky inertní kapaliny:netěkavé chemicky inertní kapaliny: methylsilikonovémethylsilikonové polymery, substituovanépolymery, substituované
silikonové polymery,silikonové polymery, polyethylenglykolypolyethylenglykoly apod.apod.
 naneseny nebo chemicky navázány přímo na vnitřním povrchu kapilánaneseny nebo chemicky navázány přímo na vnitřním povrchu kapilární kolonyrní kolony
 Dostupné i GCDostupné i GC mikrokolonymikrokolony na bázi silikonového čipuna bázi silikonového čipu
PlynovýPlynový chromatografchromatograf
Zdroj nosného plynu a systém kontroly průtokuZdroj nosného plynu a systém kontroly průtoku
 nosný plynnosný plyn -- např.např. HeHe, Ar, N, Ar, N22, H, H22 (dle typu kolony a(dle typu kolony a
detektoru)detektoru)
 nosný plyn musí být velmi čistý a suchýnosný plyn musí být velmi čistý a suchý
•• trubice s molekulovým sítem odstraňují Htrubice s molekulovým sítem odstraňují H22O, uhlovodíky, OO, uhlovodíky, O22
 nutná řízená rychlost průtoku nosného plynu (pro získánínutná řízená rychlost průtoku nosného plynu (pro získání
reprodukovatelných retenčních časů)reprodukovatelných retenčních časů)
•• programovatelné elektronické regulační systémyprogramovatelné elektronické regulační systémy
–– náplňové kolony: průtok 10náplňové kolony: průtok 10 -- 60 ml/min60 ml/min
–– kapilární kolony: 1kapilární kolony: 1 -- 2 ml/min, velké nároky na stabilitu2 ml/min, velké nároky na stabilitu
DávkovačDávkovač
 vnášívnáší alikvotalikvot vzorku (µl) do kolonyvzorku (µl) do kolony
 vzorky rozpuštěné v organickém rozpouštědle dávkovány injekční jvzorky rozpuštěné v organickém rozpouštědle dávkovány injekční jehlou přes tzv.ehlou přes tzv.
septum do vyhřívaného prostoruseptum do vyhřívaného prostoru
–– analytyanalyty i rozpouštědlo ihned převedeny do plynné fáze a vneseny do koloi rozpouštědlo ihned převedeny do plynné fáze a vneseny do kolony nosným plynemny nosným plynem
 splitsplit -- splitlesssplitless technika dávkovánítechnika dávkování vzorku na kolonu:vzorku na kolonu:
–– splitsplit módmód -- do kolony vstupuje pouze malá část zplyněného vzorkudo kolony vstupuje pouze malá část zplyněného vzorku
•• nedochází k zahlcení kapilární kolonynedochází k zahlcení kapilární kolony
–– splitlesssplitless módmód -- do kolony vstupuje většina vzorkudo kolony vstupuje většina vzorku
PlynovýPlynový chromatografchromatograf -- detektorydetektory
 Univerzální detektoryUniverzální detektory -- detegujídetegují většinuvětšinu analytůanalytů
 Selektivní detektorySelektivní detektory
Plamenově ionizační detektorPlamenově ionizační detektor ((flameflame ionizationionization detectordetector, FID), FID)
–– univerzální detektore pro GCuniverzální detektore pro GC
–– efluentefluent z kolonyz kolony smísensmísen s Hs H22 a vzduchema vzduchem →→ analytyanalyty spáleny v plamenispáleny v plameni
–– v plameni dochází k ionizaci a vzniklé ionty zvyšují vodivost plv plameni dochází k ionizaci a vzniklé ionty zvyšují vodivost plameneamene
NPD (NPD (nitrogennitrogen –– phosphorusphosphorus detectordetector)) modifikace FIDmodifikace FID
–– nad plamen umístěna vyhřívaná kulička soli alkalického kovu (nad plamen umístěna vyhřívaná kulička soli alkalického kovu (RbRb,, CsCs))
–– přítomnost iontů alkalického kovu vpřítomnost iontů alkalického kovu v plameni zvyšuje signál proplameni zvyšuje signál pro analytyanalyty
obsahující dusík a fosforobsahující dusík a fosfor
FotoionizačníFotoionizační detektordetektor ((photoionizationphotoionization detectordetector, PID), PID)
–– ionizace intenzivním UV zářenímionizace intenzivním UV zářením
–– selektivní pro UV absorbující látkyselektivní pro UV absorbující látky
TermovodivostníTermovodivostní detektordetektor
((thermalthermal conductivityconductivity, TCD), TCD)
–– vv přítomnostipřítomnosti analytuanalytu vv nosném plynunosném plynu
se zvyšuje tepelná vodivost plynuse zvyšuje tepelná vodivost plynu
–– univerzální, jednoduchý,univerzální, jednoduchý, horší citlivosthorší citlivost
Detektor elektronového záchytuDetektor elektronového záchytu ((electronelectron capturecapture, ECD), ECD)
–– nosný plyn ionizován radioaktivním βnosný plyn ionizován radioaktivním β--zářičemzářičem
–– analytyanalyty ss elekronegativnímielekronegativními skupinami vychytávajískupinami vychytávají
elektrony z βelektrony z β--zářičezářiče →→ snížení ionizacesnížení ionizace
Hmotnostní detektorHmotnostní detektor ((massmass spectrometryspectrometry detectordetector, MSD), MSD)
Plynová chromatografiePlynová chromatografie
Příprava vzorků pro GC analýzu:Příprava vzorků pro GC analýzu:
 extrakceextrakce sledovanýchsledovaných analytůanalytů ze vzorku biologického materiálu do organickéhoze vzorku biologického materiálu do organického
rozpouštědla (+ odpaření rozpouštědla z extraktu)rozpouštědla (+ odpaření rozpouštědla z extraktu)
 chemickáchemická derivatizacederivatizace -- zvýšení těkavosti azvýšení těkavosti a termostabilitytermostability látek pro GC analýzulátek pro GC analýzu
(mnoho klinicky významných látek je netěkavých)(mnoho klinicky významných látek je netěkavých)
–– silylacesilylace –– substituce atomu vodíku funkčních skupin láteksubstituce atomu vodíku funkčních skupin látek silylsilyl--skupinou (R3Siskupinou (R3Si––))
–– oximaceoximace,, acylaceacylace, esterifikace, esterifikace
Analýza těkavých látek v kapalných neboAnalýza těkavých látek v kapalných nebo
pevných vzorcích:pevných vzorcích:
 GC v uspořádáníGC v uspořádání headhead--spacespace
•• „„headhead spacespace““ –– prostor nad vzorkem (plynnáprostor nad vzorkem (plynná
fáze)fáze)
např. stanovení alkoholu v krvi,např. stanovení alkoholu v krvi,
analýza zbytků rozpouštědel ve farmaceutickýchanalýza zbytků rozpouštědel ve farmaceutických
výrobcích atd.výrobcích atd.
Kapalinová chromatografieKapalinová chromatografie -- LCLC
 Separace založena na rozdělení látek mezi kapalnou mobilní fáziSeparace založena na rozdělení látek mezi kapalnou mobilní fázi a fázi stacionárnía fázi stacionární
 HighHigh perfomanceperfomance liquidliquid chromatographychromatography (HPLC)(HPLC) -- jako nosič použity částice maléhojako nosič použity částice malého
průměru (5 µm),průměru (5 µm),
 HPLCHPLC -- v klinické laboratoři nejrozšířenější forma LC (všechny principv klinické laboratoři nejrozšířenější forma LC (všechny principy dělení)y dělení)
KapalinovýKapalinový chromatografchromatograf
•• kolona pro separacikolona pro separaci analytůanalytů
•• zásobníky rozpouštědel (mobilní fáze)zásobníky rozpouštědel (mobilní fáze)
•• čerpadla pro zajištění průtoku mobilní fáze systémemčerpadla pro zajištění průtoku mobilní fáze systémem
•• dávkovač pro nanesení vzorku na kolonudávkovač pro nanesení vzorku na kolonu
•• onon--line detektor pro detekci separovanýchline detektor pro detekci separovaných analytůanalytů
•• PC pro kontrolu systému, sběr a vyhodnocení datPC pro kontrolu systému, sběr a vyhodnocení dat
HPLC kolonaHPLC kolona
Náplňové kolonyNáplňové kolony
 běžné kolonyběžné kolony -- vnitřní průměr 0,1vnitřní průměr 0,1 -- 5 mm, délka 505 mm, délka 50 -- 250 mm250 mm
 tzv.tzv. nanoborenanobore kolonykolony -- vnitřní průměr 25vnitřní průměr 25 -- 100 µm100 µm
 openopen--tubulartubular kolonykolony -- průměr pod 25 µmprůměr pod 25 µm
 SF chemicky navázána na povrch částic silikagelu nebo na povrchu polymerních částic
– SF: polární funkční skupiny – HPLC s normální fází (silněji vázané polární látky)
–– C18, C8, C4 uhlovodíkové řetězceC18, C8, C4 uhlovodíkové řetězce –– HPLC s reverzní fází (silněji vázané nepolární látky)HPLC s reverzní fází (silněji vázané nepolární látky)
 částice náplně různé velikostičástice náplně různé velikosti -- průměr 1,8průměr 1,8 -- 10 µm10 µm
Obecně platí:Obecně platí:
–– kolony s malým vnitřním průměrem a malým vnitřním objememkolony s malým vnitřním průměrem a malým vnitřním objemem -- vyšší účinnost, nižší limitvyšší účinnost, nižší limit
detekce, malé objemy MFdetekce, malé objemy MF
–– čím menší částice náplně, tím větší je účinnost kolony (ale tímčím menší částice náplně, tím větší je účinnost kolony (ale tím větší je odpor vrstvy náplněvětší je odpor vrstvy náplně
proti pohybu MF)proti pohybu MF)
Monolitické kolonyMonolitické kolony
–– vysoká účinnost a nízké zpětné tlakyvysoká účinnost a nízké zpětné tlaky
–– kolona zcela vyplněna pórovitým polymeremkolona zcela vyplněna pórovitým polymerem
Kapilární kolony pro LCKapilární kolony pro LC (0,1(0,1 -- 1 mm vnitřní průměr, 101 mm vnitřní průměr, 10 -- 50 cm délky), SF nanesena na vnitřním50 cm délky), SF nanesena na vnitřním
povrchu skleněné kapilárypovrchu skleněné kapiláry
PředkolonaPředkolona
–– ochrana kolony před ireverzibilní adsorpcí proteinů ze vzorkuochrana kolony před ireverzibilní adsorpcí proteinů ze vzorku
–– naplněna stejnou nebo podobnou SF jako analytická kolonanaplněna stejnou nebo podobnou SF jako analytická kolona
KapalinovýKapalinový chromatografchromatograf
Zásobníky s mobilními fázemiZásobníky s mobilními fázemi
 vv nejjednodušší formě skleněné lahve snejjednodušší formě skleněné lahve s přívodními hadičkami kpřívodními hadičkami k čerpadlůmčerpadlům
 MF připraveny zMF připraveny z čistých rozpouštědel určených pro chromatografii (HPLC grade)čistých rozpouštědel určených pro chromatografii (HPLC grade)
 MF přefiltrovány přes membránový filtr pro odstranění případnýchMF přefiltrovány přes membránový filtr pro odstranění případných pevných částicpevných částic
 MF zbaveny rozpuštěných plynůMF zbaveny rozpuštěných plynů –– sonikacesonikace, vakuové, vakuové degasserydegassery (odplyňovače)(odplyňovače)
ČerpadlaČerpadla
•• čerpadla zajišťujíčerpadla zajišťují reprodukovatelný, konstantní areprodukovatelný, konstantní a bezpulzníbezpulzní průtok MF systémemprůtok MF systémem
•• vv systému je nutné vyvinout vysoké tlaky (až 250 bar)systému je nutné vyvinout vysoké tlaky (až 250 bar)
(1 bar = 105(1 bar = 105 PaPa = 1,02= 1,02 atmatm = 14,5 psi)= 14,5 psi)
 bezpulzníbezpulzní tzv. lineární dávkovačtzv. lineární dávkovač -- pro malé průtoky MFpro malé průtoky MF
-- pracuje na principu injekční stříkačkypracuje na principu injekční stříkačky
 pulznípulzní pístovápístová dvojúčinnádvojúčinná (reciproká) čerpadla(reciproká) čerpadla
-- činnost je fázově posunutá pro minimalizaci pulzůčinnost je fázově posunutá pro minimalizaci pulzů
–– Vyhlazení pulzůVyhlazení pulzů
•• tlumič pulzů na principu svinuté odporové kapilárytlumič pulzů na principu svinuté odporové kapiláry
•• nebo redukce pulzů změnou rychlosti pohybu pístůnebo redukce pulzů změnou rychlosti pohybu pístů
 izokratickýizokratický mód práce čerpadlamód práce čerpadla
-- složení MF zůstává konstantní během celé analýzysložení MF zůstává konstantní během celé analýzy
 gradientovýgradientový módmód
-- změna složení MF szměna složení MF s časemčasem -- až čtyři složky MF programovatelně směšovány gradientovýmaž čtyři složky MF programovatelně směšovány gradientovým
ventilemventilem
KapalinovýKapalinový chromatografchromatograf
Dávkovací zařízeníDávkovací zařízení
–– šesticestnýšesticestný ventil s vyměnitelnou smyčkouventil s vyměnitelnou smyčkou
•• objem od desítekobjem od desítek nanolitrůnanolitrů po mililitrypo mililitry
•• plnící pozice (poloha A)plnící pozice (poloha A) -- vzorek se nasaje ze vzorkové nádobky (tzv.vzorek se nasaje ze vzorkové nádobky (tzv.
vialkyvialky) dávkovací injekční stříkačkou do smyčky) dávkovací injekční stříkačkou do smyčky
•• otočením ventilu do polohy B je obsah smyčky vnesen do proudu mootočením ventilu do polohy B je obsah smyčky vnesen do proudu mobilníbilní
fázefáze
•• dávkovací ventil je přesný, programovatelnýdávkovací ventil je přesný, programovatelný
 Další možnostiDalší možnosti
–– dávkovače sdávkovače s děličem (obdobaděličem (obdoba
splitovacíhosplitovacího zařízení vzařízení v GC)GC)
–– dávkovače sdávkovače s možností smísenímožností smísení
vzorku svzorku s derivatizačnímderivatizačním činidlemčinidlem
před nadávkováním na kolonupřed nadávkováním na kolonu
((předkolonovápředkolonová derivatizacederivatizace))
KapalinovýKapalinový chromatografchromatograf -- detektorydetektory
 DetektorDetektor (s výjimkou MSD) obsahuje průtokovou celu(s výjimkou MSD) obsahuje průtokovou celu -- zdezde detegoványdetegovány separovanéseparované analytyanalyty
 generovaný elektronický signál zaznamenán ve forměgenerovaný elektronický signál zaznamenán ve formě chromatogramuchromatogramu
 Fotometry a spektrofotometryFotometry a spektrofotometry -- měřeníměření absorbanceabsorbance UV a VIS zářeníUV a VIS záření
–– Detektory sDetektory s fixní nebo variabilní vlnovou délkoufixní nebo variabilní vlnovou délkou
–– Detektory diodového poleDetektory diodového pole (PDA)(PDA) -- schopné měřit vschopné měřit v celé oblasticelé oblasti λλ
-- průtokovouprůtokovou kyvetoukyvetou prochází polychromatické světloprochází polychromatické světlo
-- prošlé světlo je zaprošlé světlo je za kyvetoukyvetou rozděleno difrakční mřížkourozděleno difrakční mřížkou
-- světlo dopadá na diodové polesvětlo dopadá na diodové pole
 FluorometryFluorometry -- pro detekci fluorescenčních látekpro detekci fluorescenčních látek
-- často nutná předčasto nutná před-- nebonebo postkolonovápostkolonová derivatizacederivatizace analytůanalytů
 Elektrochemické detektoryElektrochemické detektory
–– amperometrickéamperometrické el.el.--chemchem. detektory. detektory
–– elektroaktivníelektroaktivní analytanalyt v průtokové cele oxidován nebo redukován na povrchu elektrodyv průtokové cele oxidován nebo redukován na povrchu elektrody
ss konstantním potenciálemkonstantním potenciálem
–– zaznamenám vzniklý elektrický proudzaznamenám vzniklý elektrický proud
–– př. analýzapř. analýza katecholaminůkatecholaminů vv močimoči
–– coulometrickécoulometrické detektorydetektory
-- oxidace nebo redukceoxidace nebo redukce analytuanalytu
-- měření elektrického nábojeměření elektrického náboje
-- př. stanovenípř. stanovení metanefrinůmetanefrinů,, vanilmandlovévanilmandlové kyseliny,kyseliny, homovanilovéhomovanilové kyseliny nebo 5kyseliny nebo 5--
hydroxyhydroxy--indoloctovéindoloctové kyseliny vkyseliny v močimoči
 Refraktometrický detektorRefraktometrický detektor měří změny indexu lomuměří změny indexu lomu eluátueluátu vv závislosti na koncentracizávislosti na koncentraci analytuanalytu
HPLC, UPLCHPLC, UPLC
Výrobci HPLC systémůVýrobci HPLC systémů
•• např.např. WatersWaters,, AgilentAgilent Technologies,Technologies, ThermoThermo,, PerkinElmerPerkinElmer,, ShimadzuShimadzu,, VarianVarian,,
AmershamAmersham PharmaciaPharmacia,, DionexDionex,, JascoJasco,, GilsonGilson,, HitachiHitachi,, BioRadBioRad a další…a další…
UPLC, UHPLCUPLC, UHPLC
 UltraUltra highhigh--perfomanceperfomance liquidliquid chromatographychromatography
 vyšší separační účinnost než klasická HPLCvyšší separační účinnost než klasická HPLC
 UHPLC využívá chromatografické kolony sUHPLC využívá chromatografické kolony s
částicemi < 2µmčásticemi < 2µm
 přístroje schopné pracovat spřístroje schopné pracovat s ultravysokýmiultravysokými tlakytlaky
(100(100 MPaMPa))
 práce s širokým rozsahem průtokůpráce s širokým rozsahem průtoků
 významné zkrácení doby analýzyvýznamné zkrácení doby analýzy
 Výrobci UPLCVýrobci UPLC -- např.např. WatersWaters
 UPLCUPLC WatersWaters AcquityAcquity (s MS(s MS
detektorem)detektorem)
Příprava vzorků pro HPLC analýzuPříprava vzorků pro HPLC analýzu
ČČištění vzorku aištění vzorku a zakoncentrovánízakoncentrování analytůanalytů
UltrafiltračníUltrafiltrační technikytechniky -- úprava roztoků pomocí polopropustnýchúprava roztoků pomocí polopropustných
membránmembrán
–– hustota membrány limituje velikost molekul, které jsou separovánhustota membrány limituje velikost molekul, které jsou separoványy
–– technika je vhodná protechnika je vhodná pro deproteinacideproteinaci vzorkůvzorků
Extrakční technikyExtrakční techniky
 Kapalinová extrakceKapalinová extrakce analytůanalytů do organického rozpouštědlado organického rozpouštědla
–– organický extrakt se odpařuje v proudu inertního plynu (dusíku)organický extrakt se odpařuje v proudu inertního plynu (dusíku)
–– odparek se rozpustí v nezbytném objemu mobilní fázeodparek se rozpustí v nezbytném objemu mobilní fáze
Extrakce pevnou látkouExtrakce pevnou látkou (solid(solid phasephase extractionextraction,, SPESPE))
 využití SPE kolonek naplněných médiem dle charakteru látkyvyužití SPE kolonek naplněných médiem dle charakteru látky --
sorbentsorbent, iontoměnič, gel atd., iontoměnič, gel atd.
 vzorek v roztoku se kolonkou prolévá podtlakemvzorek v roztoku se kolonkou prolévá podtlakem
 zachycené složky se po promytí uvolní vhodným rozpouštědlemzachycené složky se po promytí uvolní vhodným rozpouštědlem
 SPE jeSPE je automatizovatelnáautomatizovatelná
DerivatizaceDerivatizace analytůanalytů
–– umožnění nebo usnadnění detekceumožnění nebo usnadnění detekce analytůanalytů
–– předkolonovápředkolonová derivatizacederivatizace -- např.např. derivatizacederivatizace aminokyselin a jiných primárních aminů zaaminokyselin a jiných primárních aminů za
vzniku fluorescenčních sloučenin a následná detekcevzniku fluorescenčních sloučenin a následná detekce fluorometremfluorometrem
–– postkolonovápostkolonová derivatizacederivatizace -- např. u analyzátorů aminokyselinnapř. u analyzátorů aminokyselin eluovanéeluované aminokyseliny zaaminokyseliny za
kolonoukolonou derivatizoványderivatizovány ninhydrinem, fotometrická detekceninhydrinem, fotometrická detekce
ChromatografieChromatografie -- kvantitativní analýzakvantitativní analýza
Kalibrační techniky:Kalibrační techniky:
Externí kalibraceExterní kalibrace (kalibrace s vnějším standardem):(kalibrace s vnějším standardem):
–– provedení analýz referenčních vzorků se známýmprovedení analýz referenčních vzorků se známým
obsahemobsahem analytuanalytu
–– sestavení kalibrační křivkysestavení kalibrační křivky -- velikost plochvelikost ploch píkůpíků analytuanalytu
vv závislosti na jeho koncentracizávislosti na jeho koncentraci
–– použití kalibrační závislosti pro vyhodnocení koncentracípoužití kalibrační závislosti pro vyhodnocení koncentrací
analytuanalytu vv reálných vzorcíchreálných vzorcích
Interní kalibraceInterní kalibrace (kalibrace s vnitřním standardem):(kalibrace s vnitřním standardem):
–– provedení analýzy referenčních vzorků se známým obsahemprovedení analýzy referenčních vzorků se známým obsahem
analytůanalytů s přídavkem konstantního množství vnitřního standardus přídavkem konstantního množství vnitřního standardu
vnitřní (interní) standardvnitřní (interní) standard –– sloučenina s podobnými vlastnostmisloučenina s podobnými vlastnostmi
jako stanovovanéjako stanovované analytyanalyty, ale nevyskytující se v reálných, ale nevyskytující se v reálných
vzorcíchvzorcích
–– do kalibrační křivky se vynáší poměr plochy píkudo kalibrační křivky se vynáší poměr plochy píku analytuanalytu a plochya plochy
píku vnitřního standardu vpíku vnitřního standardu v závislosti na koncentracizávislosti na koncentraci analytuanalytu
–– do reálných vzorků se přidává interní standard ve stejném množstdo reálných vzorků se přidává interní standard ve stejném množstvíví
jako do referenčních roztokůjako do referenčních roztoků
–– koncentracekoncentrace analytuanalytu se vyhodnocuje na základě poměru plochyse vyhodnocuje na základě poměru plochy
(výšky) odpovídajícího píku a píku vnitřního standardu(výšky) odpovídajícího píku a píku vnitřního standardu
Kalibrace
0
40000
80000
0 10 20 30 40 50
koncentrace (nmol/l)
plochapíku
Kalibrace
0
1
2
0 10 20 30 40 50
koncentrace umol/l
plochaanalytu/plochaIST
Praktické aplikace chromatografických technikPraktické aplikace chromatografických technik
vv klinické biochemiiklinické biochemii -- příkladypříklady
TenkovrstváTenkovrstvá chromatografie (TLC, HPTLC)chromatografie (TLC, HPTLC)
 kvalitativní, příp.kvalitativní, příp. semikvantitativnísemikvantitativní analýzaanalýza
 flexibilní levnáflexibilní levná matodamatoda
 umožňuje souběžně analyzovat více vzorkůumožňuje souběžně analyzovat více vzorků
 nevyžaduje přístroje a náročnou přípravunevyžaduje přístroje a náročnou přípravu
 velmi časté využití vvelmi časté využití v toxikologiitoxikologii průkaz THCprůkaz THC
–– cílené průkazy nejrůznějších nox (jedů, škodlivin)cílené průkazy nejrůznějších nox (jedů, škodlivin)
–– orientačníorientační screeningscreening léků a drogléků a drog
–– pozitivní výsledky z toxikologickéhopozitivní výsledky z toxikologického screeninguscreeningu musí být konfirmovány pomocí dalšíchmusí být konfirmovány pomocí dalších
chromatografických metod (př. HPLC, často ve spojení schromatografických metod (př. HPLC, často ve spojení s hmotnostní spektrometrií)hmotnostní spektrometrií)
HPTLCHPTLC –– sacharidy HPTLCsacharidy HPTLC –– lipidy dvojrozměrná TLClipidy dvojrozměrná TLC –– složené lipidysložené lipidy
Praktické aplikace chromatografickýchPraktické aplikace chromatografických
technik vtechnik v klinické biochemiiklinické biochemii -- příkladypříklady
Papírová chromatografiePapírová chromatografie
 jednoduchá, již málo používaná technika př.jednoduchá, již málo používaná technika př. screeningscreening aminokyselin vaminokyselin v močimoči
IonexováIonexová chromatografie (IEC)chromatografie (IEC)
 Analýza aminokyselinAnalýza aminokyselin
–– vzorekvzorek -- deproteinovanádeproteinovaná plazma resp. sérum, moč, CSFplazma resp. sérum, moč, CSF -- směs volných aminokyselin (AMK)směs volných aminokyselin (AMK)
–– AMK vneseny na kolonu sAMK vneseny na kolonu s katexem ve forměkatexem ve formě kationtůkationtů (při nízkém(při nízkém pHpH))
–– AMK postupněAMK postupně eluoványeluovány zz kolonykolony pufrypufry o zvyšující seo zvyšující se elučníeluční síle (rostoucísíle (rostoucí pHpH a iontová síla)a iontová síla)
–– postkolonovápostkolonová derivatizacederivatizace ninhydrinemninhydrinem
–– kvalitativní vyhodnoceníkvalitativní vyhodnocení chromatogramuchromatogramu -- na základě retenčních časůna základě retenčních časů
–– kvantitativní vyhodnocení pomocí vnitřního standardu (AMKkvantitativní vyhodnocení pomocí vnitřního standardu (AMK norleucinnorleucin))
Analyzátor AMK (Analyzátor AMK (PerkinPerkin –– ElmerElmer))
 Další využití IECDalší využití IEC
•• nukleotidy, peptidy, proteiny,nukleotidy, peptidy, proteiny, oligonukleotidyoligonukleotidy, nukleové kyseliny, nukleové kyseliny
Praktické aplikace chromatografických technikPraktické aplikace chromatografických technik
vv klinické biochemiiklinické biochemii -- příkladypříklady
HPLCHPLC
 zz chromatografických metod nachází nejširší uplatnění vchromatografických metod nachází nejširší uplatnění v klinické biochemiiklinické biochemii
 většina aplikací využívá HPLC s reverzní fází
 lze ji aplikovat na široké spektrumlze ji aplikovat na široké spektrum analytůanalytů vv závislosti na způsobu detekcezávislosti na způsobu detekce
–– sacharidysacharidy -- karboxylovékarboxylové kyskys.. -- aminokyselinyaminokyseliny
–– lipidylipidy -- steroidysteroidy -- katecholaminykatecholaminy
–– lékyléky -- drogydrogy -- homocysteinhomocystein
–– pterinypteriny -- CDTCDT -- glykovanýglykovaný hemoglobin atd.hemoglobin atd.
 HPLC se uplatňuje jako standardní metoda vHPLC se uplatňuje jako standardní metoda v toxikologii, hlavně vtoxikologii, hlavně v kombinacikombinaci
ss hmotnostní spektrometriíhmotnostní spektrometrií
AnalýzaAnalýza
77--dehydrocholesteroludehydrocholesterolu
((prekursorprekursor cholesterolucholesterolu
–– endogenní syntéza):endogenní syntéza):
-- záznam z PDAzáznam z PDA
-- chromatogramchromatogram připři λλmaxmax
KarboxylovKarboxylovéé kyselinykyseliny --
dynamika pdynamika přřememěěnyny kyskys..
benzoovbenzoovéé nana kyskys..
hippurovouhippurovou (detoxika(detoxikaččnníí
reakce)reakce)
Praktické aplikace chromatografických technikPraktické aplikace chromatografických technik
vv klinické biochemiiklinické biochemii -- příkladypříklady
Záznam HPLC analýzyZáznam HPLC analýzy katecholaminůkatecholaminů vv moči z HPLCmoči z HPLC AgilentAgilent série 1200,série 1200,
elektrochemický detektorelektrochemický detektor CoulochemCoulochem
KatecholaminyKatecholaminy –– adrenalin,adrenalin, noradrenalinnoradrenalin,, dopamindopamin
MetanefrinyMetanefriny –– metanefrinmetanefrin,, normetanefrinnormetanefrin (metabolity(metabolity katecholaminůkatecholaminů))
KysKys.. vanilmandlovávanilmandlová (metabolit(metabolit katecholaminůkatecholaminů))
-- markerymarkery feocytochromufeocytochromu (nádor(nádor sympatoadrenálníhosympatoadrenálního systému, nejčastěji dřeně nadledvin)systému, nejčastěji dřeně nadledvin)
Praktické aplikace chromatografických technikPraktické aplikace chromatografických technik
vv klinické biochemiiklinické biochemii -- příkladypříklady
Analýza CDTAnalýza CDT
((karbohydrátkarbohydrát--deficientnídeficientní transferintransferin))
 detekce nadměrného užití alkoholudetekce nadměrného užití alkoholu
 monitorování abstinence v průběhu léčbymonitorování abstinence v průběhu léčby
 TransferinTransferin -- glykoproteinglykoprotein vázající železovázající železo
–– obsahujeobsahuje polysacharidovépolysacharidové řetězce a variabilní množství kyseliny sialovéřetězce a variabilní množství kyseliny sialové
–– podle počtu skupin kyseliny sialovépodle počtu skupin kyseliny sialové -- 66 izoforemizoforem
aa--, mono, mono--,, didi--, tri, tri--,, tetratetra-- aa pentasialotransferinpentasialotransferin
–– disialotransferindisialotransferin -- cílová sloučenina pro stanovování CDT HPLC analýzoucílová sloučenina pro stanovování CDT HPLC analýzou
-- pozitivní pacientpozitivní pacient -- negativní pacientnegativní pacient
Praktické aplikace chromatografických technikPraktické aplikace chromatografických technik
vv klinické biochemiiklinické biochemii -- příkladypříklady
HPLC analýzaHPLC analýza glykovanéhoglykovaného hemoglobinuhemoglobinu
 HbA1cHbA1c -- sstabilnítabilní aduktadukt glukózy sglukózy s NN--terminálníterminální aminoskupinouaminoskupinou valinuvalinu ββ––řetězceřetězce
hemoglobinuhemoglobinu
 Diferenciální diagnostika diabetuDiferenciální diagnostika diabetu
 Určení kompenzace a stabilityUrčení kompenzace a stability glukózovéhoglukózového metabolismumetabolismu
 Monitorování terapieMonitorování terapie
 Izolace a hemolýza erytrocytůIzolace a hemolýza erytrocytů
-- EDTA krevEDTA krev
-- izolace erytrocytůizolace erytrocytů centrifugacícentrifugací, promytí fyziologickým roztokem, promytí fyziologickým roztokem
-- lyzacelyzace erytrocytůerytrocytů
-- HPLC analýza (HPLC analýza (ionexionex..
kolona)kolona)
HPLC Analyzátor HbA1cHPLC Analyzátor HbA1c
TosohTosoh
Praktické aplikace chromatografických technikPraktické aplikace chromatografických technik
vv klinické biochemiiklinické biochemii -- příkladypříklady
Plynová chromatografiePlynová chromatografie
 standardní technika vstandardní technika v kvalitativních i kvantitativních analýzách vkvalitativních i kvantitativních analýzách v toxikologiitoxikologii
–– plynovéplynové chromatografychromatografy vv toxikologických laboratořích vybaveny různými detektorytoxikologických laboratořích vybaveny různými detektory
kk různým typům analýz, např.různým typům analýz, např.
GC sGC s plamenovým ionizačním detektoremplamenovým ionizačním detektorem -- stanovení alkoholu a těkavých látek vstanovení alkoholu a těkavých látek v krvikrvi
NPD detektorNPD detektor -- screeningscreening většiny léčiv či drogvětšiny léčiv či drog
detektor elektronového záchytudetektor elektronového záchytu -- analýzeanalýze benzodiazepinůbenzodiazepinů nebo halogenovaných láteknebo halogenovaných látek
hmotnostní spektrometrhmotnostní spektrometr -- cílené průkazy a stanovení noxcílené průkazy a stanovení nox
 diagnostika dědičných metabolických poruch (GC / MS)diagnostika dědičných metabolických poruch (GC / MS)
GC analýza alkoholuGC analýza alkoholu Organické kyseliny v močiOrganické kyseliny v moči –– diagnostika dědičnýchdiagnostika dědičných metabmetab. poruch. poruch
Děkuji za pozornost…Děkuji za pozornost…
……ale i těm,ale i těm,
kteří sekteří se
nudili !nudili !
……těm, kterétěm, které
problematikaproblematika
zajímala…zajímala…