Hmotnostní spektrometrieHmotnostní spektrometrie
RNDr. AlenaRNDr. Alena MikuškováMikušková
FN BrnoFN Brno –– Pracoviště dětské medicíny, OKBPracoviště dětské medicíny, OKB
amikuskovaamikuskova@@fnbrnofnbrno..czcz
Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry)
 FyzikálněFyzikálně--chemická metodachemická metoda
•• využívá separace urychlených ionizovaných částic ve vakuuvyužívá separace urychlených ionizovaných částic ve vakuu
podle jejich hmotnostipodle jejich hmotnosti při jejich průchodu magnetickými apři jejich průchodu magnetickými a
elektrickými polielektrickými poli
 MS vyvinuta počátkem 20.století,vyvinuta počátkem 20.století,
•• vv klinické biochemiiklinické biochemii -- již několik desetiletíjiž několik desetiletí
·· identifikace a stanovení nízkomolekulárních látek na základě měřidentifikace a stanovení nízkomolekulárních látek na základě měřeníení
hmotnosti jejich molekul (detekce látek ve spojení shmotnosti jejich molekul (detekce látek ve spojení s plynovouplynovou
chromatografií)chromatografií)
•• První polovina 90. let 20.stoletíPrvní polovina 90. let 20.století -- nové technikynové techniky
·· umožnily využívat metodu i pro látky vysokomolekulárníumožnily využívat metodu i pro látky vysokomolekulární
• MS -- nejdynamičtěji se rozvíjející metodika současné biochemienejdynamičtěji se rozvíjející metodika současné biochemie
·· vedle metod molekulové genetikyvedle metod molekulové genetiky
Hmotnostní spektrumHmotnostní spektrum
Výstup MSVýstup MS -- hmotnostní spektrumhmotnostní spektrum
-- čarovýčarový diagramdiagram
-- vodorovná osavodorovná osa -- hodnotahodnota m/zm/z (hmotnost / náboj iontu)(hmotnost / náboj iontu)
-- svislá osasvislá osa -- odezva detektoru nebo relativní zastoupení daného iontuodezva detektoru nebo relativní zastoupení daného iontu
Hmotnostní spektrometrHmotnostní spektrometr
-- tři funkční celky:tři funkční celky:
•• Iontový zdrojIontový zdroj -- ionizace neutrálních molekul měřené směsi:ionizace neutrálních molekul měřené směsi:
–– molekulamolekula analytuanalytu je převedena do plynné fáze (do vysokého vakua)je převedena do plynné fáze (do vysokého vakua)
–– získává charakteristický nábojzískává charakteristický náboj
•• Iontový separátorIontový separátor
–– rozdělení iontů různýchrozdělení iontů různých
hmotnostíhmotností
–– ion je urychlenion je urychlen
–– z charakteru jeho pohybuz charakteru jeho pohybu
vakuovaným prostorem lzevakuovaným prostorem lze
vypočítat jeho m/zvypočítat jeho m/z
•• DetektorDetektor
–– detekce iontů po jejichdetekce iontů po jejich
separaci podle hodnoty m/zseparaci podle hodnoty m/z
–– určení relativní intenzityurčení relativní intenzity
(četnosti) jednotlivých iontů(četnosti) jednotlivých iontů
Iontový zdrojIontový zdroj -- Ionizační technikyIonizační techniky
Existuje celá řada ionizačních technik
Cíl: vytvoření nabité částice, která je následně analyzována
Použitá technika záleží na - charakteru analyzovaných látek
- separační metodě, na kterou je MS napojen
(GC/MS, LC/MS, bez napojení na separaci)
GC/MS: LC/MS, CE/MS,GC/MS: LC/MS, CE/MS,
-- Elektronová ionizaceElektronová ionizace EIEI MS s přímým nástřikemMS s přímým nástřikem
-- Chemická ionizaceChemická ionizace CICI -- ElektrosprayElektrospray ESIESI MALDI (SELDI)MALDI (SELDI)
Elektronová ionizace, EIElektronová ionizace, EI
Iontový zdrojIontový zdroj -- ionizace molekulionizace molekul analytuanalytu
v plynném stavu pomocí proudu elektronův plynném stavu pomocí proudu elektronů
-- Z molekuly při srážce s paprskemZ molekuly při srážce s paprskem
elektronů odtržen elektronelektronů odtržen elektron
-- molekula získává kladný nábojmolekula získává kladný náboj
-- Následná fragmentace (rozpad)Následná fragmentace (rozpad)
molekuly přebytkem energiemolekuly přebytkem energie
EI - tvrdá ionizační technika (fragmentace)(fragmentace)
•• fragmenty rozděleny vfragmenty rozděleny v další částidalší části
analyzátoru dle hodnoty m/z aanalyzátoru dle hodnoty m/z a detegoványdetegovány
-- separace magnetickým analyzátorem,separace magnetickým analyzátorem,
kvadrupólemkvadrupólem
•• Pouze pro teplotně stálé nízkomolekulárníPouze pro teplotně stálé nízkomolekulární
látky (50látky (50 –– 800800 DaDa))
-- DaltonDalton –– jednotka molekulové hmotnostijednotka molekulové hmotnosti
Elektronová ionizace (fragmentace)
-- Hmotnostní spektrumHmotnostní spektrum
metanolumetanolu
Chemická ionizace CI
„Měkčí“ varianta elektronové ionizace
• Do iontového zdroje přiváděn ionizační plyn (př.metan)
– proud elektronů ionizuje nejdříve molekuly tohoto plynu
– tyto teprve předávají energii molekule analytu
– šetrnější, nedochází k tak rozsáhlé fragmentaci
Srovnání hmotnostníhoSrovnání hmotnostního
spektra s elektronovouspektra s elektronovou
ionizací a chemickouionizací a chemickou
ionizacíionizací
Elektrospray ionizace, ESI
 Eluát prochází kapilárou, na ni vloženo
vysoké napětívysoké napětí
 vzniká sprej vysoce nabitých kapiček
 následný postupný odpar rozpouštědla
 vznikají ionty (i vícenásobně nabité)
 jsou dále separovány (kvadrupól, TOF)
 Měkká ionizační technika (bez
fragmentace)
 Vhodné pro nízko- i vysokomolekulární látky
(peptidy, sacharidy, proteiny, nukleové
kyseliny,...)
MMatrixatrix--AAssistedssisted LLaseraser DDesorptionesorption IIonizationonization -- MALDIMALDI
Vzorek vVzorek v roztoku smíchán sroztoku smíchán s matricímatricí
–– matricematrice -- deriváty nízkomolekulárních aromatických kyselinderiváty nízkomolekulárních aromatických kyselin
•• absorbují energii laserového záření ve VIS nebo blízké UV oblastabsorbují energii laserového záření ve VIS nebo blízké UV oblastii
Roztok nakápnut a vysušenRoztok nakápnut a vysušen (vykrystalizován) na MALDI destičce(vykrystalizován) na MALDI destičce
PulzníPulzní ozáření směsných krystalů zábleskem laseruozáření směsných krystalů zábleskem laseru
–– prudké odpaření látek do vakuaprudké odpaření látek do vakua
–– ionizovaná matrice strhává sebou molekuluionizovaná matrice strhává sebou molekulu analytuanalytu a ionizuje jia ionizuje ji
–– ionty urychleny stejnosměrným elektrickým polem do TOF analyzátoionty urychleny stejnosměrným elektrickým polem do TOF analyzátoruru
MALDIMALDI -- MMatrixatrix--AAssistedssisted LLaseraser DDesorptionesorption IIonizationonization
 Velmi měkká, šetrná technikaVelmi měkká, šetrná technika
–– i pro vysokomolekulární látkyi pro vysokomolekulární látky
(proteiny, peptidy,(proteiny, peptidy, oligosacharidyoligosacharidy,,
nukleotidy)nukleotidy)
 Ionty dále separoványIonty dále separovány
analyzátorem TOFanalyzátorem TOF
MatriceMatrice
SpotovacíSpotovací destičkadestička SpotovacíSpotovací destička na monitorudestička na monitoru
MS – separace iontů
•• Iontový separátor:Iontový separátor: rozdělení iontů různých hmotnostírozdělení iontů různých hmotností
–– ion je urychlenion je urychlen
–– z charakteru jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poměz charakteru jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poměrr
jeho hmotnosti a náboje m/zjeho hmotnosti a náboje m/z
Magnetický sektorový analyzátorMagnetický sektorový analyzátor KvadrupólKvadrupól
Iontová pastIontová past
TOFTOF
Magnetický sektorový analyzátorMagnetický sektorový analyzátor
 Nejdéle používaný a nejlépe prozkoumaný, stále se vyvíjí
 Klasický typ detektoru, využívá skutečnosti, že dráha nabité částice se v
magnetickém poli zakřivuje tím více, čím má vyšší náboj a nižší hmotnost
 Malé molekuly – pouze GC/MS (EI)
 Velmi přesný, ve své moderní verzi velmi nákladný (v klin. biochemii není
běžně používaný)
Kvadrupol
 Konstrukce - 4 kovové tyče, na ně vloženo stejnosměrné a střídavé napětí
 Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, začnou oscilovat
 Při vhodné kombinaci obou složek napětí prochází kvadrupolem pouze
ionty o určitém poměru m/z
 změnou vkládaných napětí je možné nechat projít kvadrupolem postupně
ionty v celém rozsahu m/z
 Lze použít pro GC/MS i LC/MS (v kombinaci s EI, CI, ESI,…),
– pouze pro menší molekuly
TOF –– analyzátor „Time of Flight“ (průletový)
 DetegujeDeteguje hmotnosti ionizovaných molekul na základě doby jejich letuhmotnosti ionizovaných molekul na základě doby jejich letu
evakuovanou trubicíevakuovanou trubicí
 rychlosti letu závisí na hodnotách efektivní hmotnosti m/zrychlosti letu závisí na hodnotách efektivní hmotnosti m/z
-- lehčí molekula letí rychlejilehčí molekula letí rychleji
 Lineární neboLineární nebo reflektronovýreflektronový mód (mód (reflektronreflektron -- vyšší rozlišovací schopnost)vyšší rozlišovací schopnost)
TOF –– analyzátor „Time of Flight“ (průletový)
TOFTOF -- teoreticky neomezený rozsah hmotností, pro které se dá používatteoreticky neomezený rozsah hmotností, pro které se dá používat
–– v praxi se mu dává přednost pouze pro velké molekulyv praxi se mu dává přednost pouze pro velké molekuly
V kombinaci s MALDI (SELDI), ESIV kombinaci s MALDI (SELDI), ESI
Iontové pastiIontové pasti
stejné fyzikální principy jakostejné fyzikální principy jako kvadrupólkvadrupól
–– regulace pohybu iontu v určitém prostoru elektrickými poliregulace pohybu iontu v určitém prostoru elektrickými poli
 ionty se pohybují po určitou dobu v prostoru iontové pastiionty se pohybují po určitou dobu v prostoru iontové pasti
 vypuzovány z pasti selektivně podle hodnoty m/zvypuzovány z pasti selektivně podle hodnoty m/z
Detektor
- detekce iontů po jejich separaci podle hodnoty m/zdetekce iontů po jejich separaci podle hodnoty m/z
-- určení relativní intenzity (četnosti) jednotlivých iontůurčení relativní intenzity (četnosti) jednotlivých iontů
 Fotonásobič
- před vlastním fotonásobičem umístěna
fosforová destička
- na ni dopadají částice z konverzní dynody
- emise fotonů
- fotony dopadají na fotokatodu
- fotoelektrický jev - emise elektronů
- elektrony zmnoženy stejně jako v elektronovém
násobiči
 Elektronový násobič - série dynod se vzrůstajícím
potenciálem
- ion narazí na povrch první dynody - emise elektronu
- po jeho dopadu na další dynodu - vícenásobná emise
- kaskádý efekt - velké množství elektronů
- detekce
Tandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MSTandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MS
 MS/MSMS/MS -- ionty podrobeny dvěma hmotnostním analýzám (zionty podrobeny dvěma hmotnostním analýzám (zapojení dvou či více
iontových separátorů v tandemu)
 MS/MS umožňuje rychlou analýzu bez použití separačních metod (GC, LC)
ve složité matrici, velice citlivá metoda
Standardně např. trojitý kvadrupól QqQ:
• První kvadrupól vybírá prekursorový ion
• Ve druhé části - kolizní cele - probíhá fragmentace prekursorového iontu
(srážkou iontu s atomy inertního plynu)
• Poslední kvadrupól analyzuje fragmenty
Pozn.: QqQ v kombinaci s ESI
(přímý nástřik) se používá pro
novorozenecký screening
- Obdobně TOF-TOF analyzátor
- Hybridní Q-TOF analyzátor
(kvadrupól – TOF)
Kvantita v hmotnostní spektrometrii
Kvantifikace látek - metoda vnitřního (interního) standardu (IST)
IST pro stanovení určité látky - analogická sloučenina nebo homolog
– co nejpodobnější chemicko-fyzikální vlastnosti jako stanovovaná látka
– látka, která se v původním zkoumaném vzorku nevyskytuje
IST se přidává do vzorku již na začátku zpracování
– pro potlačení vlivu matrice či kontaminace na účinnost ionizace analytu
IST se přidává do všech vzorků ve stejné koncentraci
Z MS spektra se po analýze vyhodnocuje poměr intenzit fragmentů typických pro
stanovovanou látku a IST
Pozn.: Pro kvantifikaci je vhodné použití selektivního záznamu iontů (SIM – Selection
Ion Monitoring) – způsob, kdy přístroj registruje pouze několik zvolených fragmentů
(zvýšení citlivosti)
nejpřesnější postup:
metoda izotopického zřeďování
IST - izotopicky značený standard
stanovované látky
- identické chemicko-fyzikální vlastnosti
- nejčastěji deuterovaný
Příklady použití – GC/MS
 Analýza neznámých složek směsiAnalýza neznámých složek směsi
-- hmotnostní spektrum pro každouhmotnostní spektrum pro každou
složku směsisložku směsi
-- porovnání s databází spekterporovnání s databází spekter
v počítačiv počítači -- identifikaceidentifikace
 Potvrzení či vyloučení metabolitů,Potvrzení či vyloučení metabolitů,
které svědčí pro určité metabolickékteré svědčí pro určité metabolické
onemocněníonemocnění
 Kvantifikace určitých metabolitůKvantifikace určitých metabolitů
 ToxikologieToxikologie –– léky, drogy, alkoholléky, drogy, alkohol
UkázkaUkázka –– organické kyseliny v močiorganické kyseliny v moči
Příklady použití - LC/MS, LC/MS/MS
 Toxikologické analýzyToxikologické analýzy
 FarmakokinetickéFarmakokinetické studie, stanovení lékůstudie, stanovení léků
 ProteomikaProteomika // metabolomikametabolomika
Stanovení léků LC/MS (LC/MS/MS)Stanovení léků LC/MS (LC/MS/MS)
Pozn.: přístroj registruje pouze dva fragmenty typickéPozn.: přístroj registruje pouze dva fragmenty typické
pro danou molekulupro danou molekulu
Příklady použití – MS/MS
- MS/MS analýza bez použití separační metody (GC, LC)
- uspořádání ESI – trojitý kvadrupol:
Novorozenecký screening dědičných poruch metabolismu
- Stanovení koncentrací aminokyselin
a acylkarnitinů v eluátu ze suché krevní
kapky (10 různých metabolických poruch,
např. fenylketonurie)
SELDISELDI –– SSurfaceurface EEnhancednhanced LLaseraser DDesorptionesorption IIonizationonization
Analýza proteinů pomocí vazby na předpřipravený povrch pevné fáze
proteinového čipu
 Povrch čipu - tvořený protilátkou, receptorem, ligandem, chemickou úpravou
 Po nanesení vzorku - navázání proteinů k povrchu adsorpcí, elektrostatickou
interakcí, na afinitním principu,…
 Promytí mikročipu - odstranění nenavázané složky
 Analýza – viz MALDI - TOF
 Vzorek komplexníVzorek komplexní
směsi proteinů lzesměsi proteinů lze
analyzovat současněanalyzovat současně
na několika různýchna několika různých
sorbentechsorbentech, aby byly, aby byly
navázány veškerénavázány veškeré
proteiny ze vzorkuproteiny ze vzorku
 Čipy mohou býtČipy mohou být
vyrobeny dlevyrobeny dle
požadavku zákazníkapožadavku zákazníka
Děkuji za pozornost…Děkuji za pozornost…