Suchá krevní skvrna (Suchá krevní kapka, Dried Blood Spot) n li Kapka kapilární krve nanesena na testovací kartičku filtračního papíru a vysušena - odběr z prstu - ušního lalůčku - z patičky (u novorozenců) - odběrová kartička ze speciálního filtračního papíru (např. Whatman 903, Schleicher & SchuelĽ.) s definovanými vlastnostmi n vyražení terčíku ze suché krevní kapky - nejlépe ze středu skvrny □ vyextrahování krve z terčíku vhodným rozpouštědlem nebo pufrem ■ použití extraktu k analýze Provedení odběru kapky na scre odběr z prstu, ušního lalůčku nebo v případě novorozenců z patičky drobná incize v místě odběru (dobře prokrveném, očištěném alkoholem a suchém) první kapka krve setřena suchým sterilním tamponem další kapka nasáta do screeningové kartičky tak, aby filtrační papír byl viditelně nasáklý z obou stran nutno zabránit příměsi tkáňového moku, kontaminaci papírku i skvrny, vrstvení více kapek sušení skvrn v horizontální poloze kartičky při pokojové teplotě překrytí suché kapky krycím papírkem (součást kartičky), vyplnění údajů pacienta, odeslání do laboratoře +++ Suchá krevní skvrna méně invazivní, odběr malého objemu (10 až 100 |jl) - šetrnější k pacientovi, vhodná zvláště pro odběry novorozenců po usušení skvrny - stabilní (inaktivace enzymů ve vzorku, analyty jsou pouze po krátkou dobu v roztoku) - vzorky není třeba mrazit lze je snadno dlouhodobě uchovávat při laboratorní teplotě a některá stanovení provádět z archivovaných vzorků i po letech (DNA) snadná a bezpečná manipulace se vzorky, nízké riziko práce s infekčním materiálem (možno přepravovat poštou) i malé množství materiálu - pro analýzu nutné velmi citlivé metody: MS-MS, DELFIA, polymerázová řetězová reakce při analýze DNA ■ časově náročnější zpracování ve srovnání s analýzou kapalného materiálu díky nutnosti vyrážení terčíku a jeho extrakci - neumožňuje plnou automatizaci celého procesu J hodnoty získané analýzou krevní plazmy a krevní skvrny nemusí být zcela srovnatelné v důsledku odlišné matrice vzorku (matematické korekce, které se snaží vliv odlišné matrice eliminovat, nemusí vždy přinášet vyhovující výsledky) J příměsi z filtračního papíru J nehomogenita krevní skvrny iky suché krevní skvrny novorozenecký screening dědičných poruch metabolismu a endokrinních onemocnění stanovení hormonů, lipidů, glykovaného hemoglobinu,... stanovení léků a jejich metabolitů (farmaceutický průmysl -farmakokinetické a toxikokinetické preklinické studie) - technika LC/MS/MS mikrobiologie, sérologie (epidemiologické studie, vyhledávání HlV-pozitivních pacientů, hepatitída, cytomegalovirové infekce... molekulárně genetická vyšetření mutací - Technika suché krevní skvrny - ideálním řešením pro zavedení celoplošného novorozeneckého screeningu a v této oblasti naprosto nezastupitelná Novorozenecký screening aktivní a celoplošné (=celostátní) vyhledávání novorozenců se zvýšeným rizikem některých vzácných onemocnění umožní u novorozenců provést včasnou diagnostiku v období, kdy klinické příznaky ještě nejsou zjevné, a zajistit tak včasnou léčbu dříve, než onemocnění způsobí nevratné poškození odběr proveden za definovaných podmínek všem novorozencům ve věku 48-72 hodin po narození stanovení koncentrace látek specifických pro vyhledávané choroby, eventuelně i průkaz genové mutace Informační webový portál o NS: http://www.novorozeneckyscreening.cz/index.php Historie n 1963 - poprvé použita metoda suché krevní skvrny pro screening metabolických poruch ve velkých populacích novorozenců - prof. Guthrie (USA) : Guthrieho bakteriální inhibiční analýza: - jednoduchá, levná a spolehlivá metoda pro novorozenecký screening fenylketonurie -dědičná porucha metabolismu fenylalaninu - patologické hromadění fenylalaninu v krvi a ostatních tělních tekutinách - hyperfenylalaninémie poškozuje CNS dítěte, vede k těžké oligofrenii Metoda založená na stimulačním efektu aminokyseliny fenylalaninu na růst bakterie Bacillus subtilis: • umístění terčíku suché krevní skvrny na agar obsahující bakteriální spory • inkubace při 37°C • hodnocení průměrů růstových zón - jsou úměrné koncentraci fenylalaninu ve vzorku o oO Novorozenecký screening S vývojem citlivých analytických technik (DELFIA, tandemová hmotnostní spektrometrie) se rozšiřuje počet onemocnění, které lze diagnostikovat ze suché krevní skvrny - spektrum vyšetřovaných metod se v různých zemích liší, záleží na incidenci choroby v dané populaci a na ekonomických podmínkách Novorozenecký screening v ČR 1975 - celoplošný novorozenecký screening fenylketonurie od 2009-13 chorob - kongenitální hypotyreóza - vrozená snížená funkce štítné žlázy - kongenitální adrenální hyperplazie - vrozená nedostatečnost tvorby hormonů nadledvin - cystická fibróza - vrozená porucha tvorby hlenu dýchacích cest - 10 různých dědičných poruch metabolismu aminokyselin (př. fenylketonurie) a mastných kyselin