Imunoblot, imunoelektroforéza Jana Švarcová. Plazmatické proteiny. http://slideplayer.cz/slide/2345714/ Jana Švarcová. Plazmatické proteiny. http://slideplayer.cz/slide/2345714/ Jana Švarcová. Plazmatické proteiny. http://slideplayer.cz/slide/2345714/ Hypergamaglobulinemie Hypogamaglobulinemie Normální sérum Použití zónové elektroforézy v klinické praxi Imunoelektroforéza A. Kvalitativní imunoelektroforetické metody 1. Imunoelektroforéza 2. Protisměrná elektroforéza B. Kvantitativní imunoelektroforetické metody 1. Elektroimunodifuze podle Laurella (raketková) 2. Dvourozměrná imunoelektroforéza Imunoelektroforéza (podle Grabara a Williamse) • imunoelektroforéza je kombinací elektroforetického dělení s imunodifuzním • rozdělení sledované látky (séra) elektroforézou na gelu (působením stejnosměrného proudu), po ukončení se gel nesuší ani nebarví, ale následuje druhá fáze • vedle rozdělených složek se do gelové vrstvy vykrojí úzký žlábek, do něj se pipetuje protilátka (polyvalentní antisérum), následuje inkubace • mezi antigenem jednotlivých složek a protilátkou se vytvoří precipitační linie, které se zvýrazní obarvením • zjišťování některých gamapatií • poruchy v biosyntéze imunoglobulinů http://ciselniky.dasta.mzcr.cz/CD/hypertext/AJBAG.htm http://www.wikiskripta.eu/index.php/Elektroforeza_bilkovin_v_seru http://www.wiley.com/legacy/products/subject/life/elgert/sample0516.htm http://www.interlab-srl.com/media/web-guide/i_presentazione_html_EN/02_slide.html vzorek Imunoelektroforegram normálního lidského séra Králičí antisérum proti lidským sérovým proteinům při použití polyspecifického antiséra až 35 precipitačních obloučků (každý oblouček = 1 protein), které mají charakteristický tvar a umístění na imunoelektroforegramu http://biochemie.upol.cz/doc/skripta/imch/8.%20Imunoelektroforeza.pdf vzorek vzorek Imunoelektroforegram normálního lidského séra: žlábek a polyspecifické antisérum proti lidským sérovým proteinům žlábek b monospecifické antisérum proti IgG žlábek c antisérum proti IgM žlábek d antisérum proti IgA http://biochemie.upol.cz/doc/skripta/imch/8.%20Imunoelektroforeza.pdf Imunoelektroforegramy normálních lidských sér (a) a sér obsahujících myelómový IgG (b), myelómový IgA (c) Waldenströmův makroglobulin IgM (d) Ve žlábcích je polyspecifické antisérum proti lidským sérovým proteinům. Monoklonové (patologické) imunoglobuliny jsou vyznačeny šipkou. http://biochemie.upol.cz/doc/skripta/imch/8.%20Imunoelektroforeza.pdf Protisměrná imunoelektroforéza • protisměrná elektroforéza využívá opačný pohyb antigenu a protilátky v elektrickém poli. Je to imunodifuze za pomoci elektrického proudu, čímž se imunodifuzní reakce značně zrychlí • je obměnou jednorozměné dvojité difuze. Pohyb molekul antigenu a protilátek je však urychlován stejnosměrným elektrickým polem, takže výsledek můžeme odečítat obyčejně už za 30 minut. • antigen a protilátka se umístí do dvou proti sobě položených startovacích jamek v gelu tak, aby protilátka byla blíže k anodě a antigen ke katodě • v elektrickém poli se antigen pohybuje k anodě a protilátka naopak ke katodě, v místě jejich setkání se vytvoří precipitační linie, které se zvýrazňují barvením Kvalitativní důkaz antigenu, které mají anodickou pohyblivost (anoda) (katoda) Káš J. a kol. Laboratorní techniky biochemie. VŠCHT. Praha 2006 http://biochemie.upol.cz/doc/skripta/imch/8.%20Imunoelektroforeza.pdf Raketová imunoelektroforéza • umožňuje stanovit koncentraci proteinů až 0.1mg/l • jedná se o jednoduchou imunodifuzní techniku probíhající v elektrickém poli (elektroimunodifuze) • molekuly antigenu se zde nepohybují volnou difuzí, ale jejich pohyb je určován stejnosměrným elektrickým polem. • většina proteinových antigenů putuje k anodě, v gelu se střetávají s molekulami protilátek • po dosažení ekvivalentního poměru vznikají precipitáty ve tvaru rakety • výška raketky je přímo úměrná koncentraci antigenu • je možné i opačné uspořádání – stanovení koncentrace protilátek v séru (do gelu antigen) Káš J. a kol. Laboratorní techniky biochemie. VŠCHT. Praha 2006 Dvourozměrná imunoelektroforéza • tato technika je kombinací elektroforézy a raketkové imunoelektroforézy (elektroimunodifuzi) • na gelu (agarosa, polyakrylamid) se nejprve provede elektroforéza bílkovin (směs antigenů) na jednotlivé frakce • poté se neobarvený proužek gelu přenese na novou desku, plocha se doplní gelem obsahujícím protilátku (polyvalentní antisérum), stane se startem elektroimunodifúze; elektroimunodifúze probíhá ve směru kolmém na gel se separovanými bílkovinami • vznikají píky nebo oblouky, jejichž výška nebo plocha je úměrná koncentraci příslušné bílkoviny • porovnání se standardem • výhodná imunochemická metoda na analýzu směsi antigenů. V lidském séru lze touto metodou rozdělit až 50 různých proteinů. Ag migrují do gelu s Ab a vytvářejí v zónách ekvivalence široké precipitační rakety nebo vrcholy - umístění rakety charakterizuje druh antigenu. - plocha vrcholu při dostatečném čase elektroforézy a také výška jsou úměrné koncentraci Ag http://biochemie.upol.cz/doc/skripta/imch/8.%20Imunoelektroforeza.pdf Imunofixace • Při podezření na přítomnost monoklonální komponenty (monoklonální protein, M-protein, „paraprotein“) při elektroforetickém vyšetření proteinů krevního séra je provedena tzv.imunofixace (pro určení typu paraproteinu) • po elektroforetickém rozdělení bílkovin séra se postupně přidají na povrch gelu specifické protilátky proti těžkým řetězcům imunoglobulinů IgG, IgA a IgM (příp.IgD) a proti lehkým řetězcům kappa a lambda, které difundují do gelu. Místa, kde dojde k precipitaci na podkladě reakce antigenu se specifickou protilátkou, jsou vizuálně vyhodnocena. • analýza séra a moči je nezbytná u všech paraproteinemií • na přítomnost paraproteinu nás může upozornit nezvykle vysoká koncentrace celkové bílkoviny séra (90 g/l a více) Monoklonální protein je tvořen buď celou molekulou příslušného imunoglobulinu (H i L řetězec) charakterizována třídou (γ, , , , ) a antigenním typem ( nebo ), anebo je tvořena pouze těžkými (H) nebo lehkými (L) řetězci. Rozdíl proti normálním imunoglobulinům je především v jeho homogenitě. Monoklonální gammapatie neznámého významu (MGUS) - Je nutné periodické sledování pacientů, protože u mnoha z nich přejde MGUS během pěti let v myelom (16%), makroglobulinémii (3%) nebo v primární amyloidozu (3%). Lymfoproliferativní onemocnění vzniká u 17% během 10 let, u 33% během 20 let. Maligní monoklonální gammapatie Mnohočetný myelom (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE a z volných lehkých řetězců kappa nebo lambda) Plazmocytom Maligní lymfoproliferativní onemocnění Waldenströmova makroglobulinémie Maligní lymfomy Chronická lymfatická leukémie (CLL) – koncentrace M-proteinu v séru je zpravidla 1g/l a většinou (88%) jde o M-protein IgM, imunofixací zahuštěné moče lze BJB v moči prokázat u 65% CLL Nemoc těžkých řetězců (heavy-chain disease) – gamma, alpha, mí, delta (produkce těžkých řetězců proliferací jednoho klonu plazmatických B lymfocytů bez asociace s řetězci lehkými) Primární AL amyloidóza (Bossuyt et al. 1998) Imunofixace vzorku séra pacienta s paraproteinem IgGk Imunoblot • jde o kombinaci elektroforézy, blotingu (neboli otisku) a vizualizační metody (fluorescenční, enzymatické apod.) • antigen je mnohem lépe definovaný, na rozdíl od klasických EIA testů, kde se pracuje se směsným antigenem. Nejčastěji se jedná o proteiny, glykoproteiny, DNA a RNA • směs proteinů aplikuje na gelovou elektroforézu v nosné matrici, aby došlo k rozdělení proteinů podle velikosti, náboje, nebo jiných rozdílů v jednotlivé proteinové pásy • oddělené proteinové pásy jsou pak přeneseny pomocí jednosměrného elektrického proudu do nosné membrány (např. nitrocelulózy nebo nylonu). Tento proces se nazývá bloting (video) • proteiny přilnou na membránu ve stejném rozložení, jako byly rozděleny v gelu a jsou zde fixovány • membrána se nařeže na jednotlivé proužky, které se nazývají stripy. Každý strip se používá pro jednoho pacienta http://www.wieslab.se/diagnostic-services/index.php?langId=1&headId=72&subId=92&pageId=126 Postup pro imunoblot • vaničku se stripy vložit do analyzátoru • přidán blokovací roztok , inkubace – zabránění nespecifických vazeb • promytí • do příslušných žlábků přidáno sérum pacienta, inkubace • promytí • přidán konjugát (sek. protilátka značená enzymem) • promytí • inkubace se substrátem • stop činidlo • stripy osušit AutoBlot 3000 Vyhodnocení vyšetření antinukleárních protilátek programem AID Western Blot Scanner (Autoimmun Diagnostika GmbH, Německo). Na obrázku vidíme pacienta se silnou pozitivitou anti-SS-A a pozitivitou anti-SS-B protilátek.